專利名稱：：用于抗血栓性疾病的藥物組合物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種用于抗血栓性疾病的藥物組合物及其制備方法和用途，具體涉及一種包含知母皂苷AIII和知母皂苷BII的藥物組合物，及其制備方法和在制備用于預防或治療血栓性疾病的藥物中的用途。
背景技術：
：血小板的粘附、聚集、釋M應導致血栓形成。血栓形成是心肌梗塞、腦卒中等許多人類心腦血管疾病的主要發(fā)病原因，也是糖尿病、脈管炎等一些重要疾病的加重因素。抗血栓治療是這些疾病的主要治療措施之一。抑制血小板聚集、抗凝和溶栓是血栓性疾病治療的三大主題，其中以抗血小板聚集治療應用最廣，療效突出，相關藥物的研發(fā)也最為活躍。從最早的環(huán)氧化酶抑制劑阿司匹林，到ADP受體拮抗劑塞氯吡啶，再到血小板GPIIb/IIIa受體拮抗劑替羅非斑，以及系列前列腺素類藥物，如PGE1、PGI2等，已廣泛應用于心、腦血管性疾病的臨床治療。中藥知母為百合科(Liliaceae)知母屬多年生草本植物知母^4we附flf由冊卿/i^/o/toBge.的根莖，主要成分是齒體鬼脊(steroidalsaponins),到目前為止，文獻報道從知母中分離鑒定了幾十種甾體皂苷及皂苷元；其次還有黃酮、寡糖、多糖及脂肪酸等。JianyingZHANG等報道了單體化合物知母皂苷Ia、BI、BII、Bill和AIII具有顯著的抗人血小板聚集及延長凝血時間的活性。(JianyingZHANG等，ClinicaChimicaActa,1999;289:79-88)。知母急苷AIII、B和BII的結構如下4知母皂苷AIII<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>知母皂苷BII<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>知母皂苷B馬百平等報道了單體化合物知母皂苷BII可明顯改善局灶性腦缺血大鼠神經癥狀，縮小腦梗塞范圍，減輕腦水腫程度；明顯改善模型動物的血液流變性、減輕腦缺血所致炎性損傷等，可用于防治腦卒中(腦中風)(發(fā)明專利申請書，申請?zhí)?00410037347.X)。陳萬生等報道了知母總皂苷用于制備防治腦卒中藥物的用途(發(fā)明專利申請公開書，公開號CN1451384A，申請?zhí)?3116824.8)。該申請中公開的知母總皂苷的特征為知母皂苷BII、E、B、AIII的含量之和^50%。陳萬生等還報道了知母提取物的注射劑(含知母皂苷BII、E1和B，三者比例為78-92:7-12:0-6)可明顯改善大鼠腦缺血再灌注損傷引起的行為癥狀，縮小腦梗塞體積，降低腦缺血大鼠腦水腫，可用于治療缺血性腦血管疾病(發(fā)明專利申請公開書，公開號為CN1628790A,申請?zhí)枮?00410054146.0)。至今未發(fā)現(xiàn)以知母皂苷AIII為主，聯(lián)合知母皂苷BII的抗血栓藥物。因此，提供一種以知母皂苷AIII為主，聯(lián)合知母皂苷BII的抗血栓藥物是合乎臨床需要的。
發(fā)明內容本發(fā)明的一個目的是提供一種用于預防或治療血栓性疾病的主要包含知母急苷AIII和知母急苷BII的藥物組合物。本發(fā)明的另一個目的是提供用于制備本發(fā)明藥物組合物的方法。本發(fā)明的還一個目的是提供本發(fā)明藥物組合物在制備用于預防或治療血栓性疾病的藥物中的用途。本發(fā)明的發(fā)明人通過多年潛心研究，首次發(fā)現(xiàn)并證實，將知母皂苷AIII和知母皂香BII聯(lián)合用于抗血栓性疾病，只要知母皂苷AIII的含量大于或等于知母皂苷BII的含量，該組合物就可以在產生令人滿意的抗血栓作用的同時，減輕抗血松藥通常具有的出血或出血傾向?；诖税l(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。一方面，本發(fā)明提供一種用于預防或治療血栓性疾病的藥物組合物，其包含有效量的知母皂苷AIII和知母皂苷BII，并且包含或不含一種或多種藥用輔料，其特征在于其中知母皂苷AIII的含量大于或等于知母皂苷BII的含量。在一個實施方案中，知母皂苷AIII和知母皂苷BII都以知母皂苷提取物的形式用于本發(fā)明的藥物組合物中。在該實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可以僅包含有效量的含有知母皂苷AIII的提取物和含有知母鬼苷BII的提取物，可以不使用藥用輔料。在另一個實施方案中，在本發(fā)明的藥物組合物中，知母皂苷AIII與知母皂苷BII的重量比為1:1至10:1。在另一個實施方案中，在本發(fā)明的藥物組合物中，知母皂苷AIII與知母皂苷BH的重量比為2:1至5:1。在再一個實施方案中，在本發(fā)明的藥物組合物中，知母皂苷AIII和知母皂苷BII的重量比為3:1。6另一方面，本發(fā)明提供用于制備本發(fā)明藥物組合物的方法，該方法包括將含所需量的知母皂苷AIII提取物和知母皂普BII提取物混合，并且根據(jù)需要，可以不加入輔料或加入一種或多種藥用輔料，然后使用適當?shù)姆椒ㄖ瞥伤璧闹苿?。在一個實施方案中，制備本發(fā)明藥物組合物的方法包括將所需量的知母皂苷AIII單體化合物和知母皂苷BII單體化合物，以及一種或多種藥用輔料混合，然后使用適當?shù)姆椒ㄖ瞥伤璧闹苿?。在另一個實施方案中，制備本發(fā)明藥物組合物的方法包括如下步驟使用適合的提取方法提取知母藥材飲片、新鮮根莖、須根等，將提取液過濾并收集濾液，然后將濾液注入大孔吸附樹脂柱，用適合的溶劑洗脫，收集相應的組分，分離得到主要含知母皂苷BII的知母原生總皂苷；使用自然發(fā)酵、酶轉化、緩沖鹽轉化、酸水解或它們的組合方法轉化所述組分足夠的時間，得到知母次生總皂苷；以及將一定比例的知母原生總皂苷和次生總皂苷混合得到本發(fā)明的藥物組合物。在一個具體實施方案中，制備本發(fā)明藥物組合物的方法包括如下步驟使用40~70%d-C4醇或40~70%丙酮提取知母飲片、新鮮根莖或須根，將提取液過濾，收集濾液并離心，然后將上清液注入大孔吸附樹脂柱，用選自水、20~90%d-C(醇和10~80%丙酮的溶劑梯度洗脫，收集50~90%d-C4醇組分或35~80%丙酮組分，得到所述知母原生總皂苷；使用選自p-葡聚糖酶、p-葡萄糖苷酶、果膠酶、纖維素酶、苦杏仁酶和黑曲霉的酶或微生物轉化所述組分足夠長的時間，將轉化溶液離心后得到知母次生總皂苷；以及將一定比例的上述知母原生總皂苷和次生總皂苷混合得到本發(fā)明的藥物組合物。在另一個具體實施方案中，制備本發(fā)明藥物組合物的方法包括如下步驟用40~70%的乙醇提取知母飲片、新鮮根莖，或須根，將提取液過濾并收集濾液，減壓濃縮后加入90~100%乙醇，離心，然后將上清液裝入大孔吸附樹脂柱，用20~95%乙醇梯度洗脫，收集50~卯％乙醇組分，得到所述知母原生總皂普；使用選自p-葡聚糖酶、p-葡萄糖苷酶、果膠酶、奸維素酶、苦杏仁酶和黑曲霉的酶或微生物的一種或幾種組合酶轉化所述組分一定時間(至少10小時)，將轉化溶液離心后得到知母次生總急苷；以及將一定比例的上述知母原生總皂苷和次生總急苷混合得到本發(fā)明的藥物組合物。另一方面，本發(fā)明提供知母皂苷AIII和知母皂苷BII在制備用于預防或治療血栓性疾病的藥物中的用途，其中在所制備的藥物中知母皂苷AIII的含量大于或等于知母皂苷BII的含量。在一個實施方案中，在所制備的藥物中，知母皂苷AIII與知母皂苷BII的重量比為1:1至10:1.在另一個實施方案中，在所制備的藥物中，知母皂苷AIII與知母皂苷BII的重量比為2:1至5:1。在另一個實施方案中，在所制備的藥物中，知母皂苷AIII和知母皂苷BII的重量比為3:1。在另一個實施方案中，所述血栓性疾病及與血栓相關性疾病包括例如冠心病、心絞痛、心肌梗塞、腦卒中、腦血栓、肺栓塞、糖尿病和脈管炎。本申請中所稱的"有效量"是指知母皂苷AIII和知母皂苷BII二者聯(lián)合應用時能夠實現(xiàn)臨床上預防或治療血栓性疾病目標的量。對于本領域的技術人員來說，本發(fā)明的藥物組合物可以通過本領域中的各種常規(guī)方法被輕易地配制成各種劑型，如口服制劑，如片劑，膠嚢，溶液，懸浮液和顆粒劑等；非腸道給予劑型，如注射劑，軟骨，貼劑等。本發(fā)明的藥物組合物可以通過本領域中的各種給藥途徑使用。8可以用口服或腸胃外給藥等方式將本發(fā)明的藥物組合物或其制劑給予需要它的患者。對于成人來說，每人口服日劑量為約150mg~450mg，例如約300mg。經研究表明，知母皂苷AIII體外可以顯著抑制血小板聚集，增強PGE1的抗血小板聚集作用，體內給藥具有明顯的抗血栓活性；而知母皂苷BII體外不能抑制血小板聚集，但可擴張血管，體內可改善血液流變性、減少白細胞在血管內皮細胞上粘附。因此，本發(fā)明中一定比例配比的知母皂苷AIII和知母皂苷BII兩個具有不同作用才幾制和乾點的組合，可以在體內獲得抗血栓作用強，但出血傾向低的優(yōu)點。本發(fā)明的藥物組合物在發(fā)揮預防或治療血栓性疾病的作用的同時，可以減輕患者的出血或出血傾向。圖l是各組小鼠尾靜脈注射膠原致死時間散點分布圖圖2是各組小鼠尾靜脈出血時間散點分布圖具體實施例方式下面的實施例用于進一步說明本發(fā)明，但其不意味著對本發(fā)明的任何限制。除非特別指明，否則本申請中的百分比或份數(shù)均指重量百分比或份數(shù)，并且組合物中各組分的含量之和等于百分之百。實施例1本發(fā)明的藥物組合物對小鼠尾靜脈出血時間和尾靜脈膠原注射致死時間的影響一、實驗材料和方法1實驗材料根據(jù)已知方法(藥學學報1996;31(4):271-277;ChemPharmBull,200810146414.X1963，11:1221)制備了知母皂苷AIII和BII單體化合物，這2種化合物的純度均大于98.5%;Wistar大鼠，雄性，體重280-320克，昆明種小鼠，雄性，體重22-24克，由軍事醫(yī)學科學院動物伺養(yǎng)中心提供。腎上腺素購自北京市永康藥業(yè)有限公司。膠原為本實驗室自制的大鼠尾部膠原。PBS購自天為時代公司。肝素購自Sigma公司，生理鹽水購自山東臨淄制藥廠。阿司匹林，石家莊制藥集團歐意藥業(yè)有限>^司。2動物分組將Wistar大鼠隨才幾分成七組，對照組、阿司匹林組(ASP,40mg/Kg)、AIII組(40mg/Kg)、BII組(40mg/Kg)、1比1組(AIII與BH的重量比，40mg/Kg)、1比3組(AIII與BII的重量比，40mg/Kg)、3比1組(AIII與BII的重量比，40mg/Kg)。連續(xù)灌胃給藥七天，每天給藥一次，第七天給藥一小時后開始實驗。對照組給予相同體積的生理鹽水。3實驗方法3.1血小板最大聚集率的檢測Wistar大鼠，第7天給藥1小時后，戊巴比妥鈉(40~60mg/kg)腹腔注射麻醉，心臟取血，以3.8%枸櫞酸鈉(體積比1:9)抗凝。于室溫800rpm離心10分鐘，分離富血小板血漿(PRP)，然后再室溫3000rpm離心20分鐘，分離貧血小板血漿(PPP)。用F-820血細胞計數(shù)儀計數(shù)，以PPP將PRP濃度調整為3.0xl()U/L。Chronolog血小板聚集儀檢測。用血漿將血小板懸液濃度調整到3.0xlO"/L，打開血小板聚集儀并預溫30分鐘，以PPP做空白對照調節(jié)透光率到100%。取血小板懸液450jiL,加入攪拌子37。C預溫3分鐘，分別加入誘導劑(50nL)ADP試劑(終濃度為20nM)，然后記錄5分鐘圖形，讀取1分鐘、3分鐘、5分鐘及最大的聚集率。3.2動-靜脈旁路血栓實驗將大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液(30-40mg/kg)麻醉，仰臥位固定，分離右側頸總動脈和左頸外靜脈，將三段聚乙烯管相連，一端插入右頸總動脈，另一端插入左頸外靜脈，兩端聚乙烯管內充滿25u/mL肝素(以生理鹽水臨用新制)，中間段長10cm,放入一根長為8cm的7#手術線(已稱重)，管內注滿生理鹽水(注意不得有氣泡)，建立動靜脈旁路。15分鐘后取下套管，取出血栓，在濕潤的濾紙上滾動，去除多余浮血，置已稱重的硫酸紙上稱濕重。再置于烘箱內60。C烘烤lh至恒重，冷卻稱重得血栓干重。3.3小鼠尾靜脈出血時間實驗將小鼠隨才幾分成七組，對照組、阿司匹林組(40mg/Kg)、BII組(40mg/Kg)、AIII組(40mg/Kg)、1比1組(AIII與BII的重量比，40mg/Kg)、1比3組(AIII與BII的重量比，40mg/Kg)、3比1組(AIII與BII的重量比，40mg/Kg)。連續(xù)灌胃給藥五天，每天給藥兩次，第六天給藥一小時后開始實驗。對照組給予相同體積的生理鹽水。所有藥物比例均為AIII和BII。將小鼠用戊巴比妥鈉(40-60mg/Kg)麻醉小鼠，放置在溫暖舒適的墊子上，在小鼠尾巴的直徑為2.25-2.5mm處切去尾尖，并立即置入PBS(37。C)中，開始計時。觀察10分鐘內的止血時間和再出血現(xiàn)象，并通過血紅蛋白的含量推測小鼠出血的體積。10分鐘內沒有止住出血的，壓迫止血，出血時間記為600秒。3.4小鼠尾靜脈膠原注射致死時間實驗將小鼠隨機分成七組，對照組、阿司匹林組(40mg/Kg)、BII組(40mg/Kg)、AIII組(40mg/Kg)、1比1組(40mg/Kg)、1比3組(AIII與BII的重量比，40mg/Kg)、3比1組(AIII與BII的重量比，40mg/Kg)。連續(xù)灌胃給藥五天，每天給藥兩次，第六天給藥一小時后開始實驗。對照組給予相同體積的生理鹽水。將小鼠在小鼠固定架上固定以后，尾靜脈注射由膠原(0.5mg/Kg)和腎上腺素(60ug/Kg)組成的血栓劑100pL/只。觀察10分鐘內小鼠的癥狀、癥狀出現(xiàn)時間和死亡時間，IO分鐘以上死亡的視為存活。二、實驗結果1.知母皂苷灌胃給藥對小鼠血小板聚集率的影響知母皂甙末次灌胃給藥1小時后進行麻醉心臟取血，檢測給藥后對ADP(20jiM)誘導的血小板聚集率，結果顯示，同對照組相比，AIII組、3:1組和1:1組的血小板最大聚集率均明顯降低，其中AIII組和3:1組血小板聚集抑制效應與阿司匹林組相當。說明知母皂甙AEI在體內對血小板聚集的抑制作用強于BII，但3:1組仍有明顯的抗血小板聚集活性。表l.本發(fā)明的藥物組合物體內給藥對血栓形成的影響組另lj例數(shù)最大聚集率(％)對照組654.9±5.8ASP40mg/Kg組640.8±7.6**AIII40mg/Kg組639.8±5.0**BII40mg/Kg組650.8±6.71:140mg/Kg組644.5±9.4*1:340mg/Kg組648.3±5.63:140mg/Kg組642.2±4.5**注與對照組比*P<0.01P<0.052.動-靜脈旁路血栓形成實驗與正常對照相比各給藥組的血栓濕重和干重均有下降的趨勢，AIII組和3:1組血栓濕重與對照組相比差異顯著，1:1組存在差異，但BII組和1:3組與對照組相比沒有統(tǒng)計學上的差異。從本實驗的結果來看AIII在抗血栓方面占主導作用。AIII組的血栓濕重低于陽性對照藥阿司匹林，說明AIII在抗血栓方面強于阿司匹林。具體實驗結果如表2所示。12組另，J例數(shù)血栓濕重(mg)血栓干重(mg)對照組ii117.12±38.3335.9±8.35ASP40mg/Kg組ii79.74±18.95**25.5±7.37**AIII40mg/Kg組864.29±22.58**24.4±6.30**BH40mg/Kg組9卯.39±29.5928.6±7.821:140mg/Kg組887.75±14.24*29.6±6.523:140mg/Kg組770.31±12.73**26.6±8.10*1:340mg/Kg組688.60±17.1729.5±5.35注與對照組比"P<0.01*P<0.053.3小鼠尾靜脈膠原注射致死時間實驗小鼠尾靜脈注入血栓劑后，出現(xiàn)呼吸加快、燥動不寧、旋轉和眼球突出等癥狀，隨后《艮快死亡。對照組的平均死亡時間為129.3士26.9秒，而單純給予BII和AIII的動物死亡時間明顯延長，分別為259.1±169.9秒、237.9±125.1秒，與對照組相比具有顯著差異。兩藥合用的動物死亡時間與對照組相比也有一定程度的延長，但除3比1組外，其效果不如單純用藥組。3比1組動物死亡時間及存活率與單純給藥組相仿，說明AIII在組合給藥中占主導作用。各組的具體存活率和死亡時間見表3和圖1。表3.本發(fā)明的藥物組合物體內給藥對小鼠尾靜脈膠原注射致死時間的影響組別例數(shù)死亡時間(秒)對照組15129.3±26.9ASP40mg/Kg組15244.6±195.3★AIII40mg/Kg組14237.9±125.1"BII40mg/Kg組14259.1±169.9"1:140mg/Kg組13198.6±140.23:140mg/Kg組13254.6±199.5★1:340mg/Kg組12142.7±56.9注與對照組比食禽P〈0.01食P〈0.053.2小鼠尾靜脈出血時間實驗對照組的平均止血時間為88.9±45.9秒，與對照組相比給藥組的出血時間明顯延長，陽性對照阿司匹林組的平均止血時間為277.4±188.5秒，與正常對照組相比差異極顯著。BII和AIII單純用藥時平均止血時間大于陽性對照藥，這說明知母皂苷BII和AIII單獨給藥時有明顯的出血傾向。同對照組相比，組合給藥出血時間也有所延長，但出血體積明顯少于單純給藥組及阿司匹林組。說明知母皂苷BII和AIII雖然具有強烈抗血栓的作用，但有明顯的出血傾向；二者合理組合后(3比1組)，在產生抗血栓活性的同時，出血時間及總的出血量明顯減少。具體結果如表4和圖2所示。表4.本發(fā)明的藥物組合物體內給藥對小鼠尾靜脈出血時間及出血體積的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>5主與對照組比<0.001★★P<0.01*P<0.05與BII組比###P<o.ooi;##P<o.oi;#P<o.os與AIII組比§§§P<。.ooi;§§P<o.oi;§P<o.os三、討論體外活性篩選發(fā)現(xiàn)知母皂苷Ain具有明顯的抑制血小板聚集作用，而知母急苷BII具有明顯的擴血管作用。動物體內實驗結果顯示，知母皂苷AIII抑制體內血小板聚集活性和抗大鼠動靜脈旁路血栓形成作用最強，BII較弱，且知母皂苷不同組合也具有抗血小板聚集和抗血栓形成作用，尤其是知母皂普AIII和BII的3:l組合。在尾靜脈膠原注射致死實驗中，具有抗血小板聚集作用的知母皂苷AIII和具有擴血管作用的知母皂苷BII均能明顯延長模型小鼠的存活時間，提高模型小鼠的存活率，但小鼠斷尾實驗發(fā)現(xiàn)這兩個化合物單獨給藥尾靜脈出血時間延長，出血體積增加；同時實驗也發(fā)現(xiàn)知母皂普AIII和BII3:l組合也有與單獨給藥相當?shù)目寡ㄐ纬勺饔茫察o脈出血時間雖有延長，但出血體積明顯減少；知母皂苷其它比例組合尾靜脈出血時間和出血體積雖有減少，但抗血栓活性也明顯降低。實驗表明，較強的抑制血小板聚集和適當?shù)臄U血管可達到體內最為理想的抗血栓效果。因此，本實驗的一個重要發(fā)現(xiàn)是以AIII比例為主的知母皂苷組合在體內可發(fā)揮最佳的抗血檢形成作用，同時具有較低的出血副作用。以此而開發(fā)的各種劑型的藥物，用于各種心腦血管性疾病的治療，可達到安全、高效的目的。實施例2本發(fā)明的藥物組合物體外抑制血小板聚集作用的研究一、材料與方法1.實驗材料Wistar大鼠，雄性，體重280-320g，大耳白兔，雌性，體重2-2.5Kg，獼猴，雄性，體重5-7Kg，均由軍事醫(yī)學科學院動物養(yǎng)殖中心提供。人血小板由北京血液中心提供。本發(fā)明的藥物組合物，為白色粉末，是根據(jù)實施例15中所述的方法制備的。二磷酸腺苷(ADP)、花生四烯酸(AA)、二甲基亞砜(DMSO)均為Sigma公司產品；瑞斯托霉素(Ristocetin)、腎上腺素購自Biopool公司。2.實驗方法2.1血液的采集Wistar雄性大鼠，2%戊巴比妥鈉(30~40mg/kg)腹腔注射麻醉，心臟取血；大耳雌性白兔，在安靜的狀態(tài)下，耳中動脈取血，取血完成后立即以3.8%枸櫞酸鈉(體積比1:9)抗凝。2.2血小板的制備將所取血液室溫800rpm離心10分鐘，取上層富血小板血漿(PRP)，室溫3000rpm離心20分鐘，取上層貧血小板血漿(PPP)。用F-820血細胞計數(shù)儀計數(shù)，以PPP調PRP濃度為3.0xlO"/L。2.3血小板最大聚集率測定Chronolog血小板聚集儀檢測。用血漿將血小板懸液濃度調整到3.0xl()U/L,打開血小板聚集儀，以PPP做空白對照調節(jié)透光率到100%。取血小板懸液450nL，加入攪拌子37'C預溫3分鐘，分別加入各種誘導劑(50nL):ADP試劑(終濃度為20)、AA(終濃度為80nM)、瑞斯托霉素(終濃度為1.2mg/mL)、腎上腺素(終濃度為10jiM)，然后記錄5分鐘圖形，讀取1分鐘、3分鐘、5分鐘及最大的聚集率。二、實驗結果1.本發(fā)明的藥物組合物體外抑制ADP誘導大鼠血小板聚集作用對大鼠血小板預先給予不同濃度的本發(fā)明的藥物組合物，孵育2分鐘后，加入聚集誘導劑ADP,檢測不同時間血小板聚集率。結果如表5所示，10ng/mL的本發(fā)明的藥物組合物便能明顯抑制大鼠血小板的聚集，隨著本發(fā)明的藥物組合物劑量的增加，抑制作用明顯增強，本發(fā)明的藥物組合物50ng/mL可完全抑制大鼠血小板的聚集。通過統(tǒng)計處理，計算出本發(fā)明的藥物組合物抑制大鼠血小板聚集的ICso值為26.92±4.7516表5.本發(fā)明的藥物組合物對大鼠血小板聚集的抑制作用(11=8)血小板聚集率(％)組別l分鐘3分鐘5分鐘最大ADP20nM22.4±2.8339.0±1.7743.9±2.4243.9±2.42ADP20fiM+本發(fā)明的藥物組合物10ng/mL19.6±5.3235.6±3.5037.5±3.8238.13±3.04**ADP20]aM十本發(fā)明的藥物組合物20jig/mL16.0±4.4430.6±5.3227.5±8.7531.38±6.74**ADP20^VI+本發(fā)明的藥物組合物30ng/mL9.8±5.7819.0±9.4714.4±12.3220.75±8.78**ADP20jiM+本發(fā)明的藥物組合物40fig/mL7.3±5.5014.0±10.2810.8±8.6315.25±8.83**ADP20fiM+本發(fā)明的藥物組合物50fig/mL0.4±0.740.1±0.9301.0±1.85**注最大聚集率與ADP組比*P<0.05,**P<0.012.本發(fā)明的藥物組合物體外抑制兔子血小板聚集作用兔子是抗血栓藥物研究的常用動物之一，本實驗觀察了不同劑量的本發(fā)明的藥物組合物對兔血小板聚集的抑制作用。結果如表6所示，10ng/mL的本發(fā)明的藥物組合物可使ADP誘導的兔血小板最大聚集率抑制到23%，隨著本發(fā)明的藥物組合物劑量的增加，抑制作用明顯增強，本發(fā)明的藥物組合物60fig/mL可使兔血小板的最大聚集率抑制到80%。通過統(tǒng)計處理，計算出本發(fā)明的藥物組合物抑制兔血小板聚集的ICso值為16.1±2.1|ng/mL。用(n=3)組另lj最大聚集率(。/。)i分鐘3分鐘s分鐘最大ADP20nM16.7±2.0832.0土2.6S35.7±4.7335.7±4.73ADP20nM+本發(fā)明的藥物組合物10pg/mL18.0±5.2026.5±4.5026.7±3.7927.3±3.51**ADP20fiM+本發(fā)明的藥物組合物20ng/mL10.5±4.09".7土3.S114.2±3.7515.2土3.33"ADP20nM十本發(fā)明的藥物組合物30ng/mL9.0±4.2410.4±4.749.5±0.3611.0±4.24**ADP20nM+本發(fā)明的藥物組合物40fig/mL7.3±1.777.5±2.127.0±4.249.0±1.41**ADP20fiM+本發(fā)明的藥物組合物60fig/mL0.4±0.745.0±1.413.8±3.896.8±0.35**注最大聚集率與ADP組比叩<0.05,**P<0.013.本發(fā)明的藥物組合物體外抑制獼猴血小板聚集作用獼猴的基因背景與人最為接近，本文繼續(xù)觀察了本發(fā)明的藥物組合物對獼猴血小板聚集的抑制作用。實驗發(fā)現(xiàn)50jig/mL的本發(fā)明的藥物組合物可使ADP誘導的獼猴血小板最大聚集率抑制到13%,隨著本發(fā)明的藥物組合物劑量的增加，抑制作用明顯增強，本發(fā)明的藥物組合物150jig/mL可使獼猴血小板的最大聚集率抑制到90%。通過統(tǒng)計處理，計算出本發(fā)明的藥物組合物抑制獼猴血小板聚集的ICso值為79.16±5.31ng/mL。從中看出，本發(fā)明的藥物組合物抑制獼猴血小板的ICso值明顯高于兔和大鼠。表7.本發(fā)明的藥物組合物對獼猴血小板聚集的抑制作用(n=5)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>4.本發(fā)明的藥物組合物對不同誘導劑誘導人血小板聚集的體外抑制效果比較在新鮮健康人血小板中預先加入不同濃度的本發(fā)明的藥物組合物后，再以各種誘導劑誘導血小板聚集，得到的結果見表8~11。實驗發(fā)現(xiàn)，ADP(20|LiM)、花生四稀酸(80nM)、瑞斯托霉素(1.2mg/mL)和腎上腺素(10pM)均能誘導人血小板聚集，聚集率均在50%以上。本發(fā)明的藥物組合物20-25|Lig/mL均能有效抑制上述誘導劑引起的血小板聚集，隨著本發(fā)明的藥物組合物給藥劑量的增加，抑制作用明顯增強，本發(fā)明的藥物組合物150-300jig/mL可完全抑制上述誘導劑引起的人血小板聚集。本發(fā)明的藥物組合物抑制不同誘導劑引起的人血小板聚集的ICso值見表12。通過以上實驗，不同來源的血小板對本發(fā)明的藥物組合物的敏感性存在差異，但大劑量的本發(fā)明的藥物組合物可完全抑制ADP、花生四稀酸、瑞斯脫霉素和腎上腺素誘導的人血小板聚集。提示本發(fā)明的藥物組合物具有潛在的臨床應用價值。表8.本發(fā)明的藥物組合物對ADP誘導人血小板聚集功能的影響(n=5)最大聚集率(％)組別l分鐘2分鐘3分鐘5分鐘ADP20fiM23.5±3.8734.50±1.7342.75±2.7551.25±9.07ADP20nM+本發(fā)明的藥物組合物12.5ng/mL23.2S±2.2233.00±2.1642.25±5.91S0,75士9.11ADP20fiM+本發(fā)明的藥物組合物25fig/mL23.75±4.9232.25±4.1141.75±6.5546.75±9.84**ADP20nM+本發(fā)明的藥物組合物50fig/mL21.00±2.5830.00±4.5536.75±6.卯40.75±8.42**ADP20fiM十本發(fā)明的藥物組合物100ng/mL10.50±1.7317.00±0.8220.50±1.292楊±4.32**ADP20nM+本發(fā)明的藥物組合物200fig/mL0.25±0.500.50±1.000.75±1.501.50±1.91**注最大聚集率與ADP組比，*P<0.05，**P<0.0120表9.本發(fā)明的藥物組合物對AA誘導的人血小板聚集功能的影響(n=5)組別最大聚集率(。/。)l分鐘2分鐘3分鐘5分鐘AA8039.00±9.5053.03±7.3062.00±5.5067.75±2.25AA80fi!Ni+本發(fā)明的藥物組合物25ng/mL18.00±3.5038.13±2.8349.50±10.5063.25士3.7SAA80fiM+本發(fā)明的藥物組合物50jig/mL16.25±4.7542.25±3.7554.75±2.9661.25±3.25*AA80jiM+本發(fā)明的藥物組合物100ng/mL11.00±7.0029.15±6.2437.75±3.3843.75±3.25**AA80nM+本發(fā)明的藥物組合物200ftg/mL7.50±1.2518.27±1.8528.75±10.6333.00±9.50**AA80fiM+本發(fā)明的藥物組合物300jig/mL0000**注5分鐘最大聚集率與AA組比*P<0.05，**P<0.01表IO.本發(fā)明的藥物組合物對瑞斯托霉素誘導人血小板聚集功能的影響(n=5)組別最大聚集率(。/。)1分鐘2分鐘3分鐘s分鐘瑞斯托霉素1.2mg/mL38.67±4.6254.33±6.3560.67±5.1364.67±4,04瑞斯托霉素1.2mg/mL+本發(fā)明的藥物組合物25ng/mL32.33士2.S251.67±5.8657.67±6.6663.00±3.61瑞斯托霉素1.2mg/mL十本發(fā)明的藥物組合物50ng/mL30.67±6.4349.33±7.2353.00±7.0058.33±2.89*瑞斯托霉素1.2mg/mL+本發(fā)明的藥物組合物100ng/mL23.33±1.1543.00±6.0849.00±7.2154.00±2..65*瑞斯托莓素1.2mg/mL+本發(fā)明的藥物組合物200ng/mL2.00±2.006.67±3.0612.33±1.1524.67±4.16**瑞斯托霉素1.2mg/mL+本發(fā)明的藥物組合物400jig/mL000.33±0.580.33±0.58**注最大聚集率與瑞斯托霉素組比:*P<0.05，**P<0.01表ll.本發(fā)明的藥物組合物對腎上腺素誘導人血小板聚集功能的影響(n=5)最大聚集率(％)組別l分鐘2分鐘3分鐘s分鐘腎上腺素10nM13.67±3.8744.33±1.5350.67±1.535S.67±1.15腎上腺素+本發(fā)明的藥物組合物25pg/mL17.33±2.0841.33±9.0749.33±5.135S.33±0.58腎上腺素+本發(fā)明的藥物組合物SOng/mL9.67士2.S221.33±3.5135.00±5.5743.33±4.04*腎上腺素+本發(fā)明的藥物組合物75pg/mL9.67±2.5219.00±1.7331.67±3.5135.33±1.15**腎上腺素+本發(fā)明的藥物組合物100嗎/mL1.33±0.582.67±0.583.33±0.584.33±2.08**腎上腺素+本發(fā)明的藥物組合物150fig/mL0.33±0.580.33±0.580.67±0.581.33±0.58"注最大聚集率與腎上腺素組比*P<0.05,**P<0.01表12.本發(fā)明的藥物組合物對不同誘導劑引^Aj6l小板聚集的IC別值ADP花生四稀酸瑞斯托霉素腎上腺素ICS0(fig/mL)81.28±3.64131.92士16.7S147.54±9.3489.42±5.74實施例3.本發(fā)明的藥物組合物體內給藥抑制血栓形成作用研究一、材料與方法221.實驗材料Wistar大鼠，雄性，體重280320g，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。知母皂苷BII和AIII組合物是根椐實施例5中所述的方法制備得到的。肝素，購自美國Sigma公司。生理鹽水，購自北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司。阿司匹林，石家莊制藥集團歐意藥業(yè)有限^^司。出凝血時間(PT、TT和APTT)試劑盒購于上海太陽生物技術公司。2.實驗方法2.1動物分組將Wistar大鼠隨機分為五組，即空白對照組、阿斯匹林40mg/kg組、本發(fā)明的藥物組合物10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg組，各組動物連續(xù)灌胃給藥七天，每日給藥一次，給藥體積為10mL/kg，第七天給藥后lh施行手術，空白對照組給予等體積蒸餾水。2.2大鼠動-靜脈旁路血栓形成實驗參考文獻方略加改進。將大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液(30-40mg/kg)麻醉，仰臥位固定，分離右側頸總動脈和左頸外靜脈，將三段聚乙烯管相連，一端插入右頸總動脈，另一端插入左頸外靜脈，兩端聚乙烯管內充滿25u/mL肝素(以生理鹽水臨用新制)，中間段長10cm，放入一根長為8cm的7#手術線(已稱重)，管內注滿生理鹽水(注意不得有氣泡)，建立動靜脈旁路。20分鐘后取下套管，取出血栓，在濕潤的濾紙上滾動，去除多余浮血，置已稱重的多充酸紙上稱濕重。再置于烘箱內60。C烘烤1h至恒重，冷卻稱重得血栓干重。2.3PRP和PPP的制備Wistar雄性大鼠，第7天給藥1小時后，戊巴比妥鈉(3040mg/kg)腹腔注射麻醉，心臟取血，以3.8%枸櫞酸鈉(體積比1:9)抗凝。于室溫800rpm離心10分鐘，取上層富血小板血漿(PRP)，室溫3000rpm離心20分鐘，取上層貧血小板血漿(PPP)。用F-820血細胞計數(shù)儀計數(shù)，以PPP調PRP濃度為3.0xlOu/L。2.4血小板最大聚集率的檢測Chronolog血小板聚集儀檢測。用血漿將血小板懸液濃度調整到233.0xlOu/L，打開血小板聚集儀，以PPP做空白對照調節(jié)透光率到100%。取血小板懸液450ftL，加入攪拌子37。C預溫3分鐘，分別加入誘導劑(50nL)ADP試劑(終濃度為20nM)，然后記錄5分鐘圖形，讀取1分鐘、3分鐘、5分鐘及最大的聚集率。2.5出凝血時間的測定取血、分離血漿后，參照試劑盒說明書操作。二、實驗結果1.本發(fā)明的藥物組合物灌胃給藥對大鼠大鼠動靜脈旁路血栓形成的影響本發(fā)明的藥物組合物灌胃給藥，給藥劑量分別為40、20和10mg/Kg，每日一次，阿司匹林40mg/Kg為陽性對照，給藥后第七天進行頸動-靜脈旁路血栓形成實驗。結果顯示本發(fā)明的藥物組合物大劑量組和中劑量組血栓干重和濕重較對照組均明顯降低，其中以大劑量組降低最為明顯，小劑量組血栓重量低于對照組，但無明顯差異。阿司匹林陽性對照組血栓干、濕重略高于大劑量組，同對照組相比有明顯差異。這些結果說明本發(fā)明的藥物組合物具有抑制體內血栓形成的作用。表13.本發(fā)明的藥物組合物灌胃給藥對大鼠頸動靜脈旁路血栓形成的影響組別例數(shù)血栓重量(mg)濕重干重對照組li117.1±38.335.9±8.4本發(fā)明的藥物組合物40ug/mL964.3±22.6**24.4±6.3**本發(fā)明的藥物組合物20ug/mL870.3±12.7*26.6±8.1*本發(fā)明的藥物組合物10ug/mL888.6±17.229.5±5.4阿司匹林組1179.7±19.0*26.7±6.4*注同對照組相比，**p<0.01;*p<0.052.本發(fā)明的藥物組合物灌胃給藥對大鼠血小板聚集率及出凝血時本發(fā)明的藥物組合物給藥方式及分組同第三部分，大鼠給藥后第七天進行心臟取血，同批檢測ADP誘導血小板聚集率和出凝血時間(PT、TT和APTT)。結果顯示本發(fā)明的藥物組合物三個劑量組的血小板聚集率均明顯低于對照組，并具有一定的劑量效應。阿司匹林組血小板聚集率低于對照組，但無明顯差異。本發(fā)明的藥物組合物各處理組PT、TT和APTT同對照組相比均沒有統(tǒng)計學差異；阿司匹林組除APTT同對照組相比有明顯延長外，其余兩個指標同對照組相比沒有明顯差異。上述結果表明，本發(fā)明的藥物組合物體內給藥可抑制血小板聚集，阻止血栓形成，但不影響出凝血時間。表14.本發(fā)明的藥物組合物灌胃給藥對大鼠ADP_____誘導血小板聚集率的影響_AIII和BII組AIII和BII組本發(fā)明的藥物組阿司匹對照組__________合物40ug/mL合物20ug/mL合物10ug/mL林組PLT最大聚集率54.9±5.843.3士7.6**_48.3±5.1*,_49.9±4.649,1±4.8注同對照組相比，**p<0.01;*p<0.05表15.口服給藥后對大鼠凝血參數(shù)APTT、PT、TT的影響凝血時間(s)組另'JitAPTTPTTT正常對照組824.84±1.4517.74士1.S528.37±0.卯本發(fā)明的藥物組合物40mg/kg824.91±1.4616.85±1.1127.34±1.58本發(fā)明的藥物組合物20mg/kg824.53±1.0717.15±1.1528.20±1.84本發(fā)明的藥物組合物10mg/kg824.47±1.6716.91±0.7627.65±2.32阿司匹林組817.50±2.37*16.49±2.0828.98±0.97注與正常對照組相比，*P<0.05實施例4.本發(fā)明藥物組合物對局灶性腦缺血大鼠運動感覺功能的影響缺血性腦血管病(主要指腦血栓形成)的最佳治療時間窗是發(fā)病6小時以內，積極的治療措施有望使損傷減少到最低限度。然而，大多數(shù)腦缺血患者多在睡眠等安靜狀態(tài)發(fā)生，加之運送、影像學檢查等原因不能及時救治而殘留偏癱、失語等后遺癥，因此對于腦缺血亞急性期及恢復早期的治療干預顯得尤為重要。本實驗擬通過大鼠大腦中動脈閉塞(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)模型，于病理改變的亞急性期缺血后3-14天，給予本發(fā)明的組合物，以探討本發(fā)明的藥物組合物對腦缺血損傷大鼠運動功能的影響，為本發(fā)明的藥物組合物合理應用于臨床提供一定實驗依據(jù)。一、材料和方法1.實驗動物SD大鼠，雄性，體重280-300g,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號SCXK(京)2002-2003。2.實驗藥品本發(fā)明的藥物組合物，按實施例6的方法制備。3.實驗方法3.1大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型的制備大鼠用100/。水合氯醛0.35g/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定，常規(guī)消毒皮膚，頸正中切口，分離右側頸總動#、頸內動脈及頸外動脈，穿線備用，結扎頸外動脈與頸總動脈，以動脈夾夾閉頸內動脈遠心端后，于頸外動脈與頸內動脈分叉處作一切口，從切口處插入頭端磨成球形的光滑尼龍線(直徑0.25mm，頭端直徑0.27mm,距頭端18mm處作標記)，有阻力感時停止進線并記錄缺血時間，插入深度18mm左右，實現(xiàn)大腦中動脈阻塞導致腦缺血。結扎切口處，固定尼龍線，逐層縫合肌肉和皮膚，消毒。2小時后將尼龍線頭端輕輕拔出到近切口處，實現(xiàn)再灌注。假手術組只暴露和分離右側頸總動脈。腦缺血及再灌注過程中保持室溫23'C，常規(guī)分籠祠養(yǎng)。3.2模型成功的判定按照ZeaLonga5級評分法(請注明文獻出處)，大鼠完全清醒后進行評定，評分標準無明顯神經病學癥狀，0分；不能完全伸展左側前爪，1分；向左側旋轉，2分；行走時向左側傾倒，3分；不能自行行走，4分。l-3分的大鼠入選后續(xù)的實驗。3.3分組及給藥將神經癥狀1-3分的大鼠分成5組模型組；本發(fā)明的藥物組合物15mg/kg(低)、30mg/kg(中)、60mg/kg(高)給藥組；安宮牛黃丸(請注明生產廠家及其批號)400mg/kg作為陽性對照組。假手術與模型組給等量0.5。/。CMC溶液。術后3天至14天灌胃給藥，每天一次。3.4肢體運動感覺功能檢測3.4.1橫木行走實驗橫木行走實驗[FeeneyDMetal，Science,1982，217:855-857評價運動的協(xié)調和整合缺損。橫木寬2.0cm，長120cm，厚1cm，，距地面80cm水平懸空放置，橫木一端連接一個暗盒(長25cm,寬22cm,高18cm),用噪音刺激大鼠通過橫木走進暗盒。評分標準大鼠不能呆在橫木上，0分；大鼠能呆在橫木上但不動，l分；大鼠試圖通過，但從橫木摔下，2分；大鼠走上橫木，但損傷的后肢滑落次數(shù)超過50%，3分；超過1次但不到50%，4分；僅滑落1次，5分；順利通過，6分。缺血前訓練2天，讓大鼠學會順利走過橫木。以缺血后3，7，10，14天為觀察時間點分別進行檢測。3.4.2觸覺刺激實驗評價軀體感覺和精細運動執(zhí)行功能(請注明該方法的文獻出處)。用相同面積(0.7cmx0.7cm)的醫(yī)用膠布貼在大鼠左前肢腕部腹側面作為觸覺刺激，記錄大鼠揭除膠布的潛伏期。術前訓練2天，l次/天，使大鼠能夠在20秒內完成揭除膠布的動作。以缺血后3，7，10,14天為觀察時間點分別進行檢測。3.5取材檢測結束后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.35g/kg)，經27左心室插管，分別用37度生理鹽水及預冷的4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(pH7.2)灌注，大鼠僵硬后斷頭取腦，浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定24小時，常規(guī)脫水，石蠟包埋，取前囟前2.2mm-前自前1.7mm組織塊，冠狀位連續(xù)切片，腦片厚3jun。3.6組織病理學及免疫組織化學染色每組取5例進行HE染色及免疫組織化學染色(Sp兩步法)。200倍光學顯微鏡下，每張切片在梗死周圍區(qū)選取3個固定視野拍照，用Image-ProPlus(v.5.1,SilverSpring,Maryland,USA)軟件進行圖象分析，觀察皮層運動感覺區(qū)神經細胞的形態(tài)結構，計數(shù)200倍視野(HP)內神經細胞的數(shù)目，即n/200HP;測定梗死灶周圍腦組織VEGF陽性細胞(細胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒)的積分光密度(IOD)以及微血管的密度(MVD),按Weidner等[WeidnerN.etal，NEnglJMed，1991，324:l-8.I方法進行，凡染成棕黃色的單個內皮細胞或內皮細胞簇作為一個血管計數(shù)，不以出現(xiàn)血管腔為唯一計數(shù)標準，計算出每1!12面積內微血管的數(shù)量，取3個視野的均值作為測定結果。3.7統(tǒng)計方法運用Windows適用的SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，數(shù)值采用7士s表示，組間比較采用單因素方差分析。二、實驗結果1.本發(fā)明的藥物組合物對腦缺血再灌注大鼠運動感覺功能的影響1.1本發(fā)明的藥物組合物對腦缺血再灌注大鼠橫木行走能力的影響由表16可見，假手術組大鼠橫木行走能力沒有變化，各缺血組大鼠橫木行走能力明顯降低，觀察期內未恢復到正常水平。本發(fā)明的藥物組合物30mg/kg、60mg/kg給藥組、安宮牛黃丸組能夠促進大鼠行走能力的恢復，與模型組比較，在術后14天P〈0.05，P<0.01。28表16本發(fā)明的藥物組合物對腦缺血再灌注大鼠橫木行走能力的影響(^士s)組別n劑量(mg/kg)_橫木行走評分_3day7day10day14day假手術10-5.60±0.496.00±06.00±06.00±0模型10-1.20±0.61.30±0.462.10±0.543.60±0.66#本發(fā)明組合物(低)10151.00±0.451.30±0.461.卯±0.703.卯±0.83本發(fā)明組合物(中)11301.00±0.631.20±0.752.30±0.464.27±0.64*本發(fā)明組合物(高)11601.00±0.601.30±0.452.30±0.624.64士0.77"安宮牛黃丸114001.09±0.511,40土0.642.50±0.504.30±0.45*注與模型組比較*i<0.05，*尸<0.01;與假手術組比較#尸<0.011.3本發(fā)明的藥物組合物對腦缺血再灌注大鼠觸覺刺激反應的影響各缺血組大鼠缺血對側前肢的觸覺敏感度以及精細運動執(zhí)行能力明顯減弱，雖然在觀察期中逐漸有所恢復，但14天后該指標仍顯著低于正常組。與;f莫型組比較，本發(fā)明的藥物組合物30mg/kg、60mg/kg給藥組明顯縮短大鼠揭除膠布的潛伏期，P<0.05。表17.本發(fā)明的藥物組合物對腦缺血再灌注大鼠觸覺刺激的影響(組別n劑量(mg/kg)觸覺刺激潛伏期(s)3dayday10day14day假手術10-18.80±3.0619.30±3.8018.40±2.3716.10±2.26模型10-335.20±36.17259.卯士28.S8146.20±12.3971.70±9.22#本發(fā)明組合物(低)1015317.70±37.05251.卯±16.07135.40±19.5973.00±13.75本發(fā)明組合物(中)1130328.55±39.56245.64±15.71142.09±16.2160.82±9.97*本發(fā)明組合物(高)1160340.09±31.61231.09±32.71137.64±11.3660.18±8.92*安宮牛黃丸11400307.09±38.34232.64±38.51145.00±19.6867.09±7.67S主與模型組比較*/><0.05,**/><0.01;與假手術組比較#P<0.01292.本發(fā)明組合物對腦缺血再灌注大鼠皮層運動感覺區(qū)神經元損傷的影響^^莫型組大鼠皮層運動感覺區(qū)以及新紋狀體神經細胞大量變性壞死，排列散亂，胞膜胞核輪廓不清，胞核固縮深染，胞體皺縮，神經元密度降低，神經元脫失明顯，間質疏松呈篩狀。本發(fā)明的藥物組合物30mg/kg、60mg/kg給藥組，安宮牛黃丸組與模型組相比，神經元數(shù)量明顯增多，變性壞死組織范圍較小、程度較輕。表18.本發(fā)明的藥物組合物對腦缺血再灌注大鼠皮層運動感覺區(qū)神經元數(shù)目的影響(3f士S)組別ii劑量(mg/kg)n/200倍HP假手術10-91.6±8.2模型10-12.7±4.8#本發(fā)明組合物(低)101522,8±6.7本發(fā)明組合物(中)113032.2±11.7**本發(fā)明組合物(高)116047.2±8.4**安宮牛黃丸1140039.6±9.8**S主與模型組比較*戶<0.05,**尸<0,01,與假手術組比較#J°<0.013.本發(fā)明組合物對腦缺血再灌注大鼠血管新生及VEGF表達的影響假手術組大鼠，在皮層及紋狀體可見少量棕黃色的微血管及VEGF呈陽性的神經元和內皮細胞；腦缺血各組大鼠，皮層及紋狀體梗死周圍區(qū)可見大量神經元，膠質細胞和內皮細胞均呈VEGF陽性，散布或叢集呈簇的CD34陽性細胞及其形成的毛細血管分布于梗死周圍區(qū)，并向梗死中心區(qū)延伸。其中本發(fā)明的藥物組合物30mg/kg、60mg/kg給藥組、安宮牛黃丸組與模型組比較VEGF表達明顯增多，微血管數(shù)目明顯增力口；i<0,05，尸<0.01。表19.本發(fā)明的藥物組合物對腦缺血再灌注大鼠血管新生的影響"士s)組別n劑量(mg/kg)MVD(n/mm2)假手術5-214.8±26.8模型5-359.6±14.5#本發(fā)明組合物(低)515352.1±37.5本發(fā)明組合物(中)530409.5±28.9*本發(fā)明組合物(高)560440.4±19.4**安宮牛黃丸5400424.5±34.2**i主與模型組比較*戶<0.05,*,J50.01,與假手術組比較#尸<0.01表20.本發(fā)明的藥物組合物對腦缺血再灌注大鼠VEGF表達的影響組別n劑量(mg/kg)IOD假手術5-70.0±5.4模型5-172.4±22.8#本發(fā)明組合物(低)515196.1±26.2本發(fā)明組合物(中)530224.9±26.8A本發(fā)明組合物(高)560229.9±22.9**安宮牛黃丸5400262.2士27.8"i主與模型組比較，/*<o.os,*'尸o.oi,與假手術組比較#尸<0,01大鼠局灶性腦組織缺血再灌注后，損傷導致皮層運動感覺區(qū)及新紋狀體大量神經細胞變性壞死，肢體運動感覺功能發(fā)生障礙，運動協(xié)調平衡能力明顯降低，盡早建立缺血組織的血液供應是神經功能恢復的關鍵環(huán)節(jié)。本研究在缺血后的亞急性期(第3-14天)，通過本發(fā)明組合物(30mg/kg、60mg/kg)給藥干預后，大鼠的感覺運動功能得到明顯改善，與模型組比較，能夠提高大鼠橫木行走的能力，縮短揭除膠布的潛伏期，減輕皮層運動感覺區(qū)的神經細胞損傷，升高梗死周圍區(qū)VEGF的31表達以及微血管的數(shù)目，P<0.05，P<0.01?？傊景l(fā)明組合物可加快大鼠局灶性腦缺血后運動感覺功能的恢復，其可能的機制是促進了大腦VEGF的表達和微血管的新生。實施例5.本發(fā)明藥物組合物的制備知母新鮮根莖3Kg，切薄片，加70%乙醇8L浸泡l小時，回流提取，過濾，藥渣再加70。/。乙醇6L回流提取兩次。合并提取液，回收乙醇，減壓濃縮至10L。將預先處理好的大孔吸附樹脂SP825(日本三菱公司)裝柱(4L)，水平衡。濃縮液過濾，濾液通入色鐠柱，依次用4BV(4倍柱體積)水和4BV的20%乙醇洗除雜，再用4BV的70%乙醇和3BV的95。/。乙醇洗脫，70%部分洗脫液回收乙醇，濃縮至IOOOmL，冷凍干燥，得原生總皂苷81g。知母新鮮根莖9Kg，切薄片，加水24L，與37。C水浴保溫72h自然發(fā)酵。過濾，濾液舍去，藥渣用18L甲醇回流提取l小時，過濾，藥渣再用18L甲醇同樣回流提取兩次。合并甲醇提取液，回收部分溶劑，析出沉淀，干燥，稱重得212g粗AHI樣品。HPLC-ELSD法測定原生總皂苷中知母皂苷BII含量為58.7%，粗AIII中知母皂苷AIII的含量為55.4%。取80g原生總皂苷和210g粗AIII混合均勻即得本發(fā)明的藥物組合物。分別用HPLC-ELSD外標兩點法測定知母皂苷AIII和BII的含量為40.9%和16.1%，紫外分光光度法測定知母總皂普的含量為82.7%。實施例6，本發(fā)明藥物組合物的制備中藥知母飲片6Kg，適當粉碎，加水48L,浸泡1小時，加熱煎煮1小時，過濾；藥渣再加水36L煎煮2次，過濾。合并濾液，減壓濃縮至30L，離心，上清液備用。將預先處理好的大孔吸附樹脂SP700(日本三菱公司)裝柱(18L)，水平衡。備用上清液通入平衡好的SP700樹脂柱，水平衡。提取濃縮液過濾，濾液上樣，用水洗除去雜質。之后依次用4BV的25%乙醇、4BV的卯％乙醇洗脫。90%部分洗脫液回收乙醇，濃縮至5000mL。取其中1000mL冷凍干燥，得原生總皂苷78g。另外4000mL加水稀釋到15000mL,加入20mL的p-葡萄糖苷酶混勻后放在50。C水浴中保溫轉化24h。轉化后溶液離心得上清液和沉淀，沉淀放烘箱內80。C烘10h至干燥，得次生總皂普213g，粉碎成粉末狀。分別用HPLC-ELSD法測定原生總皂苷和次生總皂苷中知母皂苷BII和AIII的含量為52.6%和66.3%。取75g原生總皂普和180g次生總皂苷混合均勻即得本發(fā)明的藥物組合物。HPLC-ELSD外標兩點法測定知母皂苷AIII和BII的含量為47.1%和15.6%，紫外分光光度法測定知母總皂苷的含量為88.5%。實施例7.本發(fā)明藥物組合物的制備知母須根8Kg，切咀，加入60。/。乙醇48L,浸泡1小時，回流提取1小時，過濾；藥渣再加60%乙醇48L回流提取兩次，過濾。合并濾液，減壓回收乙醇至20L,加乙醇至濃度為30%,靜置備用。將預先處理好的大孔吸附樹脂SP700(日本三菱公司)裝柱(10L)，30%乙醇平衡。上述備用提取液離心，上清液通入平衡好的樹脂柱，依次用4BV的30%乙醇、4BV的90。/。乙醇洗脫，收集90%乙醇部分，回收乙醇，濃縮至4000mL。取其中2000mL冷凍干燥,得原生總急苷165g。另外2000mL加水稀釋到3200mL后，加入30mL果膠酶(NCB-PE40)混勻后放在50。C水浴中保溫轉化12h。轉化后溶液離心得上清液和沉淀，沉淀放烘箱內80。C烘6h至干燥，得次生總皂苷119g。HPLC-ELSD法測定原生總皂苷中知母皂苷BII和AIII的含量為19.2。/。和32.6%，次生總皂苷中知母皂苷AIII的含量為61.3%。取100g原生總急苷和100g次生總皂苷混合均勻即得本發(fā)明的藥物組合物。HPLC-ELSD外標兩點法測定知母皂苷AIII和BII的含量為47.2%和9.7%，紫外分光光度法測定知母總皂苷的含量為79.4%。實施例8.本發(fā)明藥物組合物的制備中藥知母飲片6Kg，適當粉碎，加30。/。乙醇48L，浸泡1小時，回流提取l小時，過濾；藥渣再加30%乙醇36L同樣回流提取2次。合并醇提液，備用。將預先處理好的大孔吸附樹脂SP825(日本三菱公司)裝柱(18L)，30%乙醇平衡。備用上清液通入平衡好的SP825樹脂柱，30%乙醇洗4BV除去雜質，再依次用4BV的50%乙醇和3BV的80%乙醇洗脫，最后用3BV的95%乙醇再生色鐠柱。收集50%和80%乙醇洗脫液，分別回收乙醇，減壓濃縮。50%乙醇濃縮液冷凍干燥得粗BII為113g，80%乙醇濃縮液干燥得粗AIII為221g。HPLC-ELSD法測定粗BII和粗AIII中知母皂苷BII和AIII的含量為61.2%和55.9%。取110g粗BII和150g粗AIII混合均勻即得本發(fā)明的藥物組合物。HPLC-ELSD外標兩點法測定知母急苷AIII和BII的含量為32.4%和26.2%,紫外分光光度法測定知母總皂苷的含量為83.3%。實施例9.本發(fā)明藥物組合物的制備中藥知母飲片6Kg,適當粉碎，加水48L，浸泡1小時，加熱煎煮1小時，過濾；藥渣再加水36L同樣煎煮2次。合并提取液，減壓濃縮至30L,加乙醇至濃度為30%，搖勻后放置過夜，離心，上清液備用。將預先處理好的大孔吸附樹脂HP20(日本三菱公司)裝柱(18L)，30%乙醇平衡。備用上清液通入平衡好的HP20樹脂柱，4BV的30%乙醇洗除去雜質，再依次用4BV的50%乙醇和4BV的80%乙醇洗脫，最后用3BV的95%乙醇再生色鐠柱。收集50%和80%乙醇洗脫液。80%乙醇濃縮液干燥得粗AIII為125g。50%乙醇部分回收乙醇，濃縮至4000ml。將50%乙醇濃縮液取出1500mL冷凍干燥得粗BII為153g。將另外2500mL溶液加水稀釋到7000mL后，加入40mL的復合果漿酶(NCB-PE200)混勻后放在50。C搖床中，以120轉/分鐘，轉化36h。轉化后溶液離心得沉淀，沉淀放烘箱內80。C烘6h至干燥，得次生總皂普183g。HPLC-ELSD法測定粗BII中知母急苷BII的含量為53.2%，粗AIII以及次生總皂苷中知母皂普AIII的含量57.1%和64.3%。取50g粗BII、120g粗AIII和180g次生總皂苷混合均勻即得本發(fā)明的藥物組合物。HPLC-ELSD外標兩點法測定本發(fā)明的藥物組合物中知母急苷AIII和BII的含量52.7%和7.8%，紫外分光光度法測定知母總皂苷的含量為85.8%。實施例10.本發(fā)明藥物組合物的制備中藥知母飲片6Kg，適當粉碎，加50。/o乙醇48L，浸泡1小時，回流提取l小時，過濾；藥渣再加50%乙醇36L同樣回流提取2次。合并提取液，減壓回收乙醇濃縮至6L,加入水飽和正丁醇萃取3次，合并正丁醇層，濃縮得原生總皂苷551g。取原生總皂苷500g用水10000mL溶解后，加入110mL的纖維素酶(AE80)混勻后放在50。C搖床中，以120轉/分鐘，轉化36h。轉化后溶液離心得沉淀，沉淀放烘箱內80'C烘6h至干燥，得次生總皂苷283g。HPLC-ELSD法測定粗BII中知母皂苷BII的含量為44.1%，次生總皂苷中知母皂苷AIII的含量為62.3%。取50g原生總皂苷和280g次生總皂苷混合均勻即得本發(fā)明的藥物組合物。HPLC-ELSD外標兩點法測定BII和AIII組合物中知母急苷AIII和BII的含量53.7%和6.9%，紫外分光光度法測定知母總皂苷的含量為86.1%。實施例11.本發(fā)明藥物組合物的制備知母新鮮根莖6Kg，切薄片，加入70。/o乙醇8L，浸泡2小時，加熱回流提取l小時，過濾；藥渣再加70。/o乙醇6L同樣回流提取2次。合并提取液，回收乙醇，減壓濃縮至10L。將預先處理好的大孔吸附樹脂SP700(日本三菱公司)裝柱(6L)，20%乙醇平衡。提取濃縮液加乙醇至20%，過濾，濾液通入色i普柱，依次用4BV的20%乙醇、4BV的80%乙醇和3BV的95%乙醇洗脫，80%的乙醇回收溶劑，濃縮至小體積，得2000mL。取500mL冷凍干燥得原生總皂香56g。剩余1500mL稀釋到7000mL，加入200mL苦杏仁酶液，混勻后放在37。C搖床中，以120轉/分鐘轉速，轉化24h。轉化后溶液離心得上清液和沉淀，沉淀放烘箱內80。C烘干，得次生總皂苷105g。HPLC-ELSD法測定原生總皂苷中知母皂苷BII的含量為43.3%，次生總皂苷中知母急苷AIII的含量為55.6%。取50g原生總皂苷和100g次生總鳥苷混合均勻即得35本發(fā)明的藥物組合物。HPLC-ELSD外標兩點法測定知母皂苷AIII和BII的含量為37.5%和14.7%,紫外分光光度法測定知母總皂苷的含量為73.5%。實施例12.本發(fā)明藥物組合物的制備知母新鮮根莖6Kg，切薄片，加入60。/。乙醇8L，浸泡2小時，超聲波振蕩器超聲提取0.5h，過濾；藥渣再加60。/。乙醇6L同樣超聲提取2次，過濾，合并提取液，減壓濃縮至10L，加丙酮到20%備用。將預先處理好的大孔吸附樹脂AB-8(天津南開化工廠)裝柱(6L)，20%丙酮平衡。備用的20%丙酮溶液通入色鐠柱，依次用4BV的20%丙酮、4BV的80。/。丙酮洗脫，收集80%丙酮部分，回收丙酮，濃縮至2000mL。取500mL冷凍干燥得原生總皂苷43g。剩余1500mL稀釋到7000mL,加入200mL苦杏仁酶液，混勻后放在37。C水浴中保溫轉化24h。轉化后溶液離心得上清液和沉淀，沉淀放烘箱內80。C烘6小試至干燥，得次生總皂苷94g。分別用HPLC-ELSD法測定原生總皂苷和次生總皂苷中知母皂普BII和AIII的含量為54.1%和62.3%。取43g原生總皂苷和卯g次生總皂苷混合均勻即得本發(fā)明的藥物組合物。分別用HPLC-ELSD外標兩點法測定知母皂苷AIII、BII的含量和用紫外分光光度法測定知母總皂苷的含量。BII為17.3%,AIII為42.7。/。，總皂苷為83.4%。實施例13.本發(fā)明藥物組合物的制備知母新鮮根莖9Kg,切薄片，加入40。/。丙酮24L，浸泡2小時，超聲波振蕩器超聲提取0.5h，過濾；藥渣再加40%丙酮18L同樣超聲提取2次。合并提取液，回收丙酮，減壓濃縮至10L。將預先處理好的大孔吸附樹脂D-lOl(天津農藥廠)裝柱(12L)，水平衡。提取濃縮液通入色鐠柱，依次用4BV的水、4BV的15%丙酮、4BV的70%丙酮洗脫，收集70%的丙酮部分，回收溶劑，濃縮至3000mL。取500mL冷凍干燥得原生總皂苷46g。剩余2500mL稀釋到11000mL,加入5436mL的p-葡聚糖酶(NCB-10),混勻后放在50。C水浴中保溫轉化20h。轉化后溶液離心得上清液和沉淀，沉淀放烘箱內80。C烘干，得次生總皂苷163g。HPLC-ELSD法測定原生總皂苷中知母皂苷BII的含量為56.2%，次生總皂苷中知母皂苷AIII的含量為63.5%。取40g原生總鳥苷和160g次生總皂苷混合均勻即得本發(fā)明的藥物組合物。HPLC-ELSD外標兩點法測定知母皂苷AIII和BII的含量為51.3%和11.2%，紫外分光光度法測定知母總皂普的含量為87.5o/o。實施例14.本發(fā)明藥物組合物的制備知母須根12Kg，切咀，加入水48L，浸泡l小時，超聲波振蕩器超聲提取0.5h,過濾；藥渣再加入水36L同樣超聲提取2次，過濾，合并濾液，減壓濃縮20L，加乙醇至濃度為30%，靜置備用。將預先處理好的大孔吸附樹脂D-lOl(天津農藥廠)裝柱(8L)，30%乙醇平衡。上述備用提取液離心，上清液通入平衡好的樹脂柱，依次用4BV的30%乙醇、3BV的80%乙醇和3BV的95%乙醇洗脫，收集80%乙醇部分濃縮至2000mL。取400mL冷凍干燥得原生總皂苷21g，剩余1600mL加入黑曲霉培養(yǎng)液2000mL，混勻后放在37'C水浴中保溫轉化20h。轉化后溶液離心得上清液和沉淀，沉淀放烘箱內80。C烘干，得次生總皂苷63g。HPLC-ELSD法測定原生總鬼苷中知母急香BII44.3%,次生總急苷中知母皂苷AIII的含量為52.3%。取20g原生總皂苷和60g次生總皂普混合均勻即得本發(fā)明的藥物組合物。HPLC-ELSD外標兩點法測定知母急香AIII和BII的含量為39.5%和11.2%，紫外分光光度法測定知母總皂苷的含量為71.8%。實施例15.本發(fā)明藥物組合物的制備中藥知母飲片6Kg，適當粉碎，加水48L,浸泡l小時，加熱煎煮l小時，過濾；藥渣加水再同樣煎煮2次。合并提取液，減壓濃縮至30L，加乙醇至濃度為35%，搖勻后放置過夜，離心，上清液備用，沉淀干燥另收。將預先處理好的大孔吸附樹脂HP20(日本三菱公司)裝柱(18L)，35%乙醇平衡。備用上清液通入平衡好的HP20樹脂柱，先用4BV的35%乙醇除去雜質，再用4BV的85%乙醇洗脫，最后用3BV的95。/。乙醇再生色鐠柱。收集85%乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮至3000mL。取濃縮液600mL冷凍干燥得原生總鳥苷52g。將另外2400mL溶液加1000mL醋酸鹽緩沖鹽(pH-4),混勻后放在37。C搖床中，以120轉/分鐘，轉化24h。轉化后溶液離心得上清液和沉淀，沉淀放烘箱內8(TC烘干，得次生總皂苷166g。HPLC-ELSD法測定原生總皂苷中BII的含量為50.2%，次生總皂苷中知母皂苷AIII的含量為57.1%。取40g原生總皂苷和165g次生總皂苷混合均勻即得本發(fā)明的藥物組合物。HPLC-ELSD外標兩點法測定知母皂苷AIII和BII的含量為46.1%和10.4%，紫外分光光度法測定知母總皂苷的含量為81.5%。實施例16.本發(fā)明藥物組合物的制備中藥知母飲片6Kg,適當粉碎，加水48L，浸泡1小時，加熱煎煮1小時，過濾；藥渣加水再同樣煎煮2次。合并提取液，減壓濃縮至30L，加丙酮至濃度為15%，搖勻后放置過夜，離心，上清液備用。將預先處理好的大孔吸附樹脂SP825(日本三菱公司)裝柱(18L)，15%丙酮平衡。備用上清液通入平衡好的SP825樹脂柱，15%丙酮洗4倍柱體積(4BV)除去雜質，再用4BV的70%丙酮洗脫。收集70%丙酮洗脫液，回收乙醇，濃縮至5000mL。將濃縮液取出1500mL冷凍干燥得粗BII為87g。將另外3500mL溶液，加入硫酸，調pH至2-3，混勻后水解轉化2h。轉化液離心得上清液和沉淀，沉淀放供箱內80'C烘干，得次生總皂苷113g。HPLC-ELSD法測定原生總皂苷中知母皂苷BII的含量為55.6%，次生總皂苷中知母皂苷AIII的含量為46.3。/。。原生總皂苷和次生總皂苷混勻，得本發(fā)明的藥物組合物。HPLC-ELSD夕卜標兩點法測定知母皂苷AIII和BII的含量為26.7%和24.3%，紫外分光光度法測定知母總皂苷的含量為73.7。/。。實施例17.本發(fā)明藥物組合物的制備中藥知母飲片2Kg，適當粉碎，加50。/q乙醇16L，浸泡1小時，回流提取l小時，過濾；藥渣再加50%乙醇12L同樣回流提取2次。合并醇提液，回收乙醇，減壓濃縮至10L，上清液備用。將預先處理好的大孔吸附樹脂SP700(日本三菱公司)裝柱(8L)，水平衡。備用上清液通入平衡好的SP700樹脂柱，水洗4BV，再用30%乙醇洗4BV除去雜質，再用3BV的50。/q乙醇洗脫，收集50%乙醇洗脫液，回收乙醇，減壓濃縮至約1500mL。濃縮液反復通入C18柱色i脊，以55%曱醇恒定比例洗脫，最后得BII(百分面積法含量大于95%)32g。知母新鮮根莖24Kg，切薄片，加水48L，與37。C水浴保溫72h自然發(fā)酵。過濾，濾液舍去，藥渣用48L甲醇回流提取l小時，過濾，藥渣再用48L甲醇同樣回流提取兩次。合并甲醇提取液，回收部分溶劑，析出沉淀，沉淀用甲醇反復重結晶，得AIII純品(百分面積法含量大于95%)181g。(或者將甲醇提取液通過硅膠柱色i脊，氯仿-曱醇-水系統(tǒng)洗脫得到AIII純品)。取20gBII和180gAIII混合均勻即得本發(fā)明的藥物組合物。HPLC-ELSD外標兩點法測定本發(fā)明的藥物組合物中知母皂苷AIII和BII的含量為83.7%和9.2%，紫外分光光度法測定知母總皂苷的含量為99.4%。實施例18.本發(fā)明藥物組合物的制備中藥知母飲片6Kg,適當粉碎，加40。/。乙醇48L，浸泡1小時，加熱回流l小時，過濾；藥渣再加40%乙醇36L同樣回流2次。合并提取液，減壓回收乙醇濃縮至6L，再加乙醇至20%，搖勻后放置過夜，離心，上清液備用。將預先處理好的大孔吸附樹脂SP700(日本三菱公司)裝柱(8L)，20%平衡。備用上清液通入平衡好的SP700樹脂柱，20。/。乙醇洗4BV除去雜質，再用3BV的卯。/。乙醇洗脫，收集90%乙醇洗脫液，回收乙醇，減壓濃縮至約1500mL。冷凍干燥得樣品498g。即為本發(fā)明的藥物組合物。HPLC-ELSD外標兩點法測定其中知母皂苷AIII和BII的含量25.3%和12.5%，紫外分光光度法測定知母總^苷的含量為56.4%。實施例19.本發(fā)明藥物組合物的制備中藥知母飲片6Kg，適當粉碎，加40。/。乙醇48L,浸泡1小時，加熱回流l小時，過濾；藥渣再加40%乙醇36L同樣回流2次。合并提取液，減壓回收乙醇濃縮至6L，再加乙醇至25%，搖勻后放置過夜，離心，上清液備用。將預先處理好的大孔吸附樹脂SP700(日本三菱^>司)裝柱(8L)，20%平衡。備用上清液通入平衡好的SP700樹脂柱，25%乙醇洗4BV除去雜質，再用3BV的50。/。乙醇和85。/。乙醇洗脫，收集50%和85%乙醇洗脫液，回收乙醇，減壓濃縮分別冷凍干燥得原生總皂苷152g和次生總皂苷316g。取150g原生總皂苷和300g次生總皂苷混合均勻即得本發(fā)明的藥物組合物。HPLC-ELSD外標兩點法測定本發(fā)明的藥物組合物中知母皂苷AIII和BII的含量為27.6%和13.5%，紫外分光光度法測定知母總皂苷的含量為60.3%。權利要求1.用于預防或治療血栓性疾病的藥物組合物，其包含有效量的知母皂苷AIII和知母皂苷BII，以及一種或多種藥用輔料，其特征在于其中知母皂苷AIII的含量大于或等于知母皂苷BII的含量知母皂苷AIII知母皂苷BII。2.用于預防或治療血栓性疾病的藥物組合物，其包含有效量的知母皂苷AIII和知母皂苷BII,該知母皂苷AIII和知母皂苷BII以知母皂苷提取物形式用于該藥物組合物中，其特征在于其中知母皂苷AIII的含量大于或等于知母皂苷BII的含量。3.根據(jù)權利要求1或2的藥物組合物，其中知母皂苷AIII與知母皂苷BII的重量比為1:1至10:1。4.根據(jù)權利要求1或2的藥物組合物，其中知母皂苷AIII與知母皂苷BII的重量比為2:1至5:1。5.根據(jù)權利要求1或2的藥物組合物，其中知母皂苷AIII和知母急苷BII的重量比為3:1。6.根據(jù)權利要求1或2的藥物組合物，其中該藥物組合物被制成膠嚢、片劑、顆粒劑或注射劑。7.知母皂苷AIII和知母皂苷BII在制備用于預防或治療血栓性疾病和血栓相關性疾病的藥物中的用途，其特征在于在所制備的藥物中知母皂苷AIII的含量大于或等于知母皂苷BII的含量。8.根據(jù)權利要求7的用途，其中知母皂苷AIII與知母皂苷BII的重量比為1:1至10:1。9.根據(jù)權利要求6的用途，其中知母皂苷AIII與知母皂苷BII的重量比為2:1至5:1。10.根據(jù)權利要求6的用途，其中知母皂苷AIII和知母皂苷BII的重量比為3:1。11.根據(jù)權利要求6至8任意一項的用途，其中所述血栓性疾病選自冠心病、心絞痛、心肌梗塞、腦卒中、腦血栓、腦梗塞、肺栓塞、糖尿病和脈管炎。12.—種制備權利要求1至6任意一項的藥物組合物的方法，它包括如下步驟使用40~70%的d-C4醇或40~70%丙酮提取知母飲片、新鮮根莖或須根，將提取液過濾，收集濾液并離心，然后將上清液注入大孔吸附樹脂柱，用選自水、20~卯％的d-Ct醇和10~80%丙酮的溶劑梯度洗脫，收集5090。/。d-C4醇組分或3580。/o丙酮組分，得到所述知母原生總皂苷；使用選自p-葡聚糖酶、p-葡萄糖苷酶、果膠酶、纖維素酶、苦杏仁酶和黑曲霉的一種或幾種酶或微生物轉化所述組分足夠長的時間，將轉化溶液離心后得到知母次生總皂苷；以及將一定比例的上述知母原生總皂苷和次生總皂苷混合得到本發(fā)明的藥物組合物。13.根據(jù)權利要求12的方法，它包括如下步驟用40~70%的乙醇提取知母飲片、新鮮根莖或須根，將提取液過濾并收集濾液，減壓濃縮后加入90~100%乙醇，離心，然后將上清液裝入大孔吸附樹脂柱，用20~95%乙醇梯度洗脫，收集50~90%乙醇組分，得到所述知母原生總皂苷；使用選自p-葡聚糖酶、p-葡萄糖苷酶、果膠酶、纖維素酶、苦杏仁酶和黑曲霉的一種或幾種酶或微生物轉化所述組分至少i小時，將轉化溶液離心后得到知母次生總皂苷；以及將一定比例的上述知母原生總皂苷和次生總皂普混合得到本發(fā)明的藥物組合物。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于抗血栓性疾病的藥物組合物及其制備方法和用途。該藥物組合物主要包含知母皂苷AIII和知母皂苷BII，任選包含藥用輔料，其特征在于所述知母皂苷AIII的含量大于或等于知母皂苷BII的含量。本發(fā)明還涉及知母皂苷AIII和知母皂苷BII組合物在制備用于預防或治療血栓性疾病的藥物或產品中的用途。本發(fā)明藥物組合物在發(fā)揮預防或治療血栓性疾病的作用的同時，可以減輕患者出血或出血傾向。文檔編號A61K31/58GK101658525SQ20081014641公開日2010年3月3日申請日期2008年8月28日優(yōu)先權日2008年8月28日發(fā)明者從玉文,夏中寧,康利平,熊呈琦,譚大維,陽趙,車馮升,鵬鄒,馬百平,月高申請人:北京四環(huán)制藥有限公司;中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所;海南四環(huán)心腦血管藥物研究院有限公司