專利名稱：用于血管形成治療的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的用于血管形成治療的藥物組合物。更具體地，本發(fā)明涉及下述新的用于血管形成治療的藥物組合物，它包含編碼血管形成因子的基因和至少一種選自下組的物質(zhì)作為活性成分具有血管擴張作用和/或血小板凝集抑制作用的物質(zhì)，以及產(chǎn)生這些物質(zhì)的物質(zhì)。。此外，本發(fā)明還涉及前列腺環(huán)素合酶基因和ets-1基因在諸如血管形成治療中的新用途。
背景技術(shù)：
新血管的發(fā)育和血管形成最初都伴有原血管的內(nèi)皮細胞的活化。那種除了在體內(nèi)刺激上述血管形成以外，還具有針對內(nèi)皮細胞的體外致細胞分裂功能的生長因子稱為“血管形成因子(血管形成生長因子)”。
血管形成因子首次用于治療是由Folkman等(N.Engl.J.Med.285，1182-1186(1971))報道的。后續(xù)研究證實，重組血管形成因子，如成纖維細胞生長因子(FGF)家族(Science 257，1401-1403(1992)；Nature 362，844-846(1993))，內(nèi)皮生長因子(EGF)(J.Surg.Res.54，575-583(1993))和血管表皮生長因子(VEGF)的應(yīng)用能促進和/或加速心肌和后肢缺血動物模型中側(cè)支血管的發(fā)育(Circulation 90，II-228-II-234(1994))。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，肝細胞生長因子(HGF)象VEGF一樣，具有內(nèi)皮特異性生長因子的功能(J.Hypertens.14，1067-1072(1996))。
用血管形成因子治療血管病的策略(如上述)被稱為“血管形成治療”。近期關(guān)于血管形成治療的最活躍研究是關(guān)于使用上述血管形成因子的基因治療缺血性疾病和動脈疾病的進展。
例如，本發(fā)明人闡明了HGF能有效對抗閉塞性動脈硬化癥(ASO)(Circulation Vol.100，No.18，No.1672(1999)；Japanese Circulation Journal Vol.64(Suppl.I)，478，No.P079(2000))。另外還揭示，HGF基因能有效針對心肌梗塞中的缺血性再灌注損傷(Circulation Vol.96，No.8，No.3459(1997)；Ann.Thorac.Surg.，67，1726-1731(1999)；Gene Therapy，7417-427(2000))。
已證實VEGF基因?qū)ωi的心肌缺血模型(Human Gene Therapy 10，2953(1999))和兔的后肢缺血模型(Circulation 96(suppl II)II-382-388(1997))有效。此外，還報道了VEGF對ASO患者(Circulation 97，1114-1123(1998))和心絞痛患者(Ann.Thorac.Surg.68，830-837(1999))有效。目前在美國，有多個小組在進行ASO患者和心絞痛患者的VEGF基因治療的臨床試驗，如Isner等。
關(guān)于bFGF基因，已有報道說，由于將bFGF基因引入到一種肌營養(yǎng)不良模型小鼠mdx的肌肉內(nèi)，導(dǎo)致血管數(shù)增加(Gene Therapy 6(7)，1210-1221(1999))。
前列腺環(huán)素(前列腺素I2；PGI2)是前列腺素的一種，它是一種半壽期為5-10分鐘的不穩(wěn)定的脂質(zhì)介質(zhì)(Arch.Gynecol.Obstet.243，187-190(1988))。它通過提高由G蛋白偶聯(lián)型受體介導(dǎo)的cAMP水平而具有較強的血管擴張作用和抑制血小板凝集的作用(N.Engl.J.Med.17，1142-1147(1979))。目前，血管擴張劑，如PGI2，PGE1(前列腺素E1)以及它們的衍生物(類似物)都廣泛用于治療各種血管病。特別是，期望通過動脈內(nèi)注射和靜脈內(nèi)注射PGE1而對末稍血循環(huán)疾病(如ASO和TAO(閉塞性血栓性脈管炎)發(fā)揮諸如血管擴張和抑制血小板凝集的功能。這樣的注射已經(jīng)成為一種成熟的治療方法。此外，鑒于PGI2具有較強作用又很快失活，開發(fā)了各種衍生物(iloprost，beraprost鈉等)。這些衍生物被用于治療末稍血管閉塞性疾病和慢性動脈閉塞癥(Prostaglandins，Leukotrienes and Essential Fatty Acids.54，327-333(1996)；藥學(xué)雜志，117，509-521(1997))。PGE1和PGI2還被用于由膠原病引起的末稍血循環(huán)障礙，Raynaud’s現(xiàn)象，體外循環(huán)的維持(Minerva Med.89，405-409(1998))，心衰(Am.Heart J.134，44-54(1997))等等。
如上所述，已知諸如PGI2等具有血管擴張作用和抑制血小板凝集的作用的物質(zhì)能有效于各種血管病。但從未有人將這些物質(zhì)與上述使用HGF基因進行的血管形成治療聯(lián)合使用，更沒有人闡明這樣的聯(lián)合將獲得什么樣的效果。
而且，已知諸如HGF、VEGF、bFGF和EGF等血管形成因子能增強ets-1(幼紅細胞增多病病毒癌基因同系物1，一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子)的表達，并通過ets-1激活參與血管形成的各種類型的因子(J.Cell.Physiol.，169，522-531(1996)；“HGF的分子醫(yī)學(xué)(Molecular Medicine of HGF)”，MedicalReview，179-185(1998))。但是，從未有人將ets-1基因用于血管形成治療，對它的作用完全不了解。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于血管形成治療的新的藥用組合物。更具體地是提供一種用于血管形成治療的新的藥用組合物，它包含編碼血管形成因子的基因和至少一種選自下組的物質(zhì)作為活性成分具有血管擴張作用和/或血小板凝集抑制作用的物質(zhì)，以及產(chǎn)生這些物質(zhì)的物質(zhì)。本發(fā)明還涉及前列腺環(huán)素合酶基因和ets-1基因在諸如血管形成治療中的新用途。
本發(fā)明人研究了PGI2合成酶基因(PGI2合成酶，本文稱為“PGIS”)與HGF基因聯(lián)合用于血管形成治療的效果。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)任何藥物與編碼血管形成因子的基因聯(lián)合用于血管形成治療中能表現(xiàn)出令人滿意的效應(yīng)。而且，迄今也沒有人闡述與其它基因聯(lián)合使用的效應(yīng)。
用小鼠后肢缺血性ASO模型檢測的結(jié)果是，HGF基因或VEGF基因與PGIS基因的聯(lián)合使用顯示出相對于這些基因單獨使用而言意外顯著的對小鼠后肢血流的改善作用。另外還首次發(fā)現(xiàn)，PGIS基因加強了HGF基因或VEGF基因的血管形成作用，而且即使是單獨使用也能表現(xiàn)出血管形成作用。
上述結(jié)果表明，諸如PGI2等具有血管擴張作用或血小板凝集抑制作用的物質(zhì)或產(chǎn)生它們的物質(zhì)(如PGIS基因)在使用血管形成因子進行的血管形成治療中十分有效。
此外，本發(fā)明人檢測了編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子ets-1(處在信號傳遞途徑中HGF和VEGF的下游)的基因在血管形成治療中的應(yīng)用。結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)單獨給與ets-1基因這種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子也具有血管形成作用。ets-1與HGF基因的聯(lián)合使用顯示出比單獨給與這兩種基因更顯著的血管形成作用。
基于以上發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明。
更具體地，本發(fā)明的技術(shù)方案是(1)一種用于血管形成治療的藥物組合物，它包含編碼血管形成因子的基因和至少一種選自下組的物質(zhì)作為活性成分具有血管擴張作用和/或血小板凝集抑制作用的物質(zhì)，以及產(chǎn)生這些物質(zhì)的物質(zhì)；
(2)一種用于血管形成治療的藥物組合物，其特征在于將編碼血管形成因子的基因與至少一種選自下組的物質(zhì)聯(lián)合使用具有血管擴張作用和/或血小板凝集抑制作用的物質(zhì)，以及產(chǎn)生這些物質(zhì)的物質(zhì)；(3)一種用于血管形成治療的藥物組合物，它包含至少一種選自下組的物質(zhì)作為活性成分具有血管擴張作用和血小板凝集抑制作用的物質(zhì)，以及產(chǎn)生這些物質(zhì)的物質(zhì)；還包括編碼血管形成因子的基因；(4)一種用于血管形成治療的藥物組合物，其特征在于將編碼血管形成因子的基因與至少一種選自下組的物質(zhì)聯(lián)合使用具有血管擴張作用和血小板凝集抑制作用的物質(zhì)，以及產(chǎn)生這些物質(zhì)的物質(zhì)；(5)(1)-(4)任一項所述的用于血管形成治療的藥物組合物，其中所述血管形成因子是HGF和/或VEGF；(6)(1)-(5)任一項所述的用于血管形成治療的藥物組合物，其中所述具有血管擴張作用和/或血小板凝集抑制作用的物質(zhì)以及能產(chǎn)生它們的物質(zhì)都是涉及cAMP增多的物質(zhì)；(7)(1)-(6)任一項所述的用于血管形成治療的藥物組合物，其中所述能產(chǎn)生具有血管擴張作用和/或血小板凝集抑制作用之物質(zhì)的物質(zhì)為基因；(8)(7)所述的用于血管形成治療的藥物組合物，其中所述基因為前列腺環(huán)素合酶基因；(9)一種用于血管形成治療的藥物組合物，其包含HGF基因和前列腺環(huán)素合酶基因作為活性成分；(10)一種用于血管形成治療的藥物組合物，其特征在于將HGF基因和前列腺環(huán)素合酶基因聯(lián)合使用；(11)一種用于血管形成治療的藥物組合物，其包含VEGF基因和前列腺環(huán)素合酶基因作為活性成分；(12)一種用于血管形成治療的藥物組合物，其特征在于將VEGF基因和前列腺環(huán)素合酶基因聯(lián)合使用；(13)(1)-(12)任一項所述的用于血管形成治療的藥物組合物，其中所述組合物用于治療或預(yù)防缺血性疾病或動脈疾病；(14)(13)的用于血管形成治療的藥物組合物，其中所述缺血性疾病或動脈疾病選自閉塞性動脈硬化，心肌梗塞，心絞痛，心肌病，和腦血管疾病；
(15)(1)-(14)任一項所述的用于血管形成治療的藥物組合物，其中所述基因以裸露DNA的形式引入；(16)一種用于增強編碼血管形成因子的基因的血管形成作用的制劑，它包含至少一種選自下組的物質(zhì)作為活性成分具有血管擴張作用和/或血小板凝集抑制作用的物質(zhì)，以及產(chǎn)生這些物質(zhì)的物質(zhì)；(17)一種用于增強編碼血管形成因子的基因的血管形成作用的制劑，它包含至少一種選自下組的物質(zhì)作為活性成分具有血管擴張作用和血小板凝集抑制作用的物質(zhì)，以及產(chǎn)生這些物質(zhì)的物質(zhì)；(18)(16)或(17)的增強血管形成作用的制劑，其中所述血管形成因子是HGF和/或VEGF；(19)(16)-(18)任一項所述的增強血管形成作用的藥物組合物，其中所述具有血管擴張作用和/或血小板凝集抑制作用的物質(zhì)以及能產(chǎn)生它們的物質(zhì)都是涉及cAMP增多的物質(zhì)；(20)(16)-(19)任一項所述增強血管形成作用的制劑，其包含前列腺環(huán)素合酶基因作為活性成分；(21)一種用于增強HGF基因的血管形成作用的制劑，其包含前列腺環(huán)素合酶基因作為活性成分；(22)(16)-(21)任一項所述增強血管形成作用的制劑，用于治療或預(yù)防缺血性疾病或動脈疾?。?23)一種血管形成制劑，其包含前列腺環(huán)素合酶基因作為活性成分；(24)(23)的血管形成制劑，其用于治療或預(yù)防缺血性疾病或動脈疾?。?25)一種用于血管形成治療的藥物組合物，其包含ets-1基因和另一種編碼血管形成因子的基因作為活性成分；(26)一種用于血管形成治療的藥物組合物，其特征在于聯(lián)合使用ets-1基因和另一種編碼血管形成因子的基因；(27)(25)或(26)的用于血管形成治療的藥物組合物，其中所述血管形成因子是HGF和/或VEGF；(28)一種用于血管形成治療的藥物組合物，其包含HGF基因和ets-1基因作為活性成分；(29)一種用于血管形成治療的藥物組合物，其特征在于聯(lián)合使用HGF基因和ets-1基因；
(30)(25)-(29)任一項所述用于血管形成治療的組合物，其中所述組合物用于治療或預(yù)防缺血性疾病或動脈疾??；(31)一種含有ets-1基因作為活性成分的制劑，它增強另一種編碼血管形成因子的基因的血管形成作用；(32)(31)的增強血管形成作用的制劑，其中所述血管形成因子是HGF和/或VEGF；(33)一種用于增強HGF基因的血管形成作用的制劑，其包含ets-1基因作為活性成分；(34)(31)-(33)任一項所述增強血管形成作用的制劑，其中該制劑用于治療或預(yù)防缺血性疾病或動脈疾??；(35)一種血管形成制劑，其包含ets-1基因作為活性成分；(36)(35)的血管形成制劑，用于治療或預(yù)防缺血性疾病或動脈疾病。
本發(fā)明提供了用于血管形成治療的藥物組合物，它包含至少一種選自下組的物質(zhì)作為活性成分具有血管擴張作用和/或血小板凝集抑制作用的物質(zhì)，以及產(chǎn)生這些物質(zhì)的物質(zhì)；還包括編碼血管形成因子的基因。
本文中用于血管形成治療的“編碼血管形成因子的基因”是指編碼能誘導(dǎo)新血管形成的蛋白、多肽或其部分的基因。具體例如，編碼以下蛋白的基因HGF，VEGF，VEGF-2，酸性FGF(aFGF)，堿性FGF(bFGF)，F(xiàn)GF-4，EGF，TGF-α，TGF-β，血小板衍生的表皮細胞生長因子(PD-ECGF)，血小板衍生的生長因子(PDGF)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，胰島素樣生長因子，血管形成蛋白(angiopoietin)-1等。此外，調(diào)節(jié)基因表達的HIF-1(如VEGF)，以及編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因(如ets家族的成員，包括ets-1)也都是所述基因的例子。優(yōu)選所述基因是HGF基因和VEGF基因；更優(yōu)選HGF基因。這些基因的序列注冊在公用數(shù)據(jù)庫中，本領(lǐng)域技術(shù)人員利用這些數(shù)據(jù)庫能輕易地克隆上述基因。
下文中，用HGF基因和VEGF基因舉例說明本發(fā)明。
本發(fā)明中，術(shù)語“HGF基因”是指編碼HGF(HGF蛋白)的基因。插入表達質(zhì)粒中以備表達的HGF基因也可以簡稱為“HGF基因”。特別是，所述基因包括HGF的cDNA，參見Nature，342，440(1989)，Examined PublishedJapanese Patent Application No.2777678，Biochem.Biophys.Res.Commun.，163，967(1989)所述的那些，它們被插入適當(dāng)表達載體(非-病毒載體，病毒載體)中，如下所述。編碼HGF cDNA的核苷酸序列可參見上述文獻。此外，它也登記在諸如Genbank等數(shù)據(jù)庫中。因此可以根據(jù)上述序列信息，采用適當(dāng)DNA片段作為PCR引物，對來自肝臟或白細胞的mRNA進行RT-PCR反應(yīng)而克隆出HGF cDNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員基于參考文獻，如MolecularCloning 2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，可以很容易地進行這種克隆。
本發(fā)明的HGF基因不限于如上所述。只要所述基因所表達的蛋白基本上具有與HGF相同的血管形成作用，這種基因就可以用作本發(fā)明的HGF基因。尤其是，本發(fā)明的HGF基因包括1)與上述cDNA在嚴(yán)格條件下雜交的DNA；2)編碼具有下述氨基酸序列的蛋白的DNA，所述序列由上述cDNA編碼，但其中一或多個(優(yōu)選數(shù)個)氨基酸被取代、缺失、和/或添加等，只要它們編碼的蛋白具有血管形成作用。上述1)和2)所述DNA可以通過定點誘變法、PCR法、常規(guī)雜交法等輕易獲得。特別是，這些方法可根據(jù)上述參考文獻，如Molecular Cloning 2nd edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)來進行。
本文中術(shù)語“VEGF基因”是指編碼VEGF蛋白的基因。插入表達載體以備表達的VEGF基因也簡稱為“VEGF基因”。具體例子如插入適當(dāng)表達載體(非-病毒載體，病毒載體)中的VEGF cDNA，如下所述。人的VEGF基因由于已報道的轉(zhuǎn)錄期間選擇性剪接而存在4種亞型(VEGF121，VEGF165，VEGF189，和VEGF206)(Science，219，983(1983)；J.Clin.Invest.，84，1470(1989)；Biochem.Biophys.Res.Commun.，161，851(1989))。這些VEGF基因中任一種都可以用于本發(fā)明。但是，VEGF165基因是所有VEGF基因中生物活性最強的，因此更為優(yōu)選。此外，與上述HGF情況類似，這些VEGF的修飾的基因，只要它們編碼具有血管形成作用的蛋白，就都包括在本發(fā)明的VEGF基因中。
與HGF基因類似，VEGF基因也可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)文獻(如Science，246，1306(1989))中描述的序列和數(shù)據(jù)庫中登記的序列信息而輕易地克隆；對它們的修飾也很容易進行。
可以通過體外測定WO 97/07824所述的血管內(nèi)皮細胞的增生作用，來測定上述HGF基因，VEGF基因，編碼它們的修飾形式的基因是否具有血管形成作用?；蛘撸梢泽w內(nèi)測定下文實施例的小鼠后肢缺血模型中血流的改善來測定這些基因的血管形成作用。
上述編碼血管形成因子的基因可以單獨或聯(lián)合用于本發(fā)明的血管形成治療中。
根據(jù)以下實施例所述，是本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)，前列腺環(huán)素合酶基因(PGIS基因)在血管形成治療中與HGF基因聯(lián)合使用可產(chǎn)生意外顯著的效果。尤其是，本發(fā)明首次證實，聯(lián)合使用HGF基因和PGIS基因獲得了超出它們單獨應(yīng)用所得效應(yīng)的疊加的協(xié)同效應(yīng)。
由PGIS合成的PGI2具有如上所述的血管擴張作用，增強血管透性的作用，以及血小板凝集抑制作用。因此，上述協(xié)同效應(yīng)可能是由于HGF基因和PGIS基因的聯(lián)合使用提供了一種使HGF能在缺血部位輕易發(fā)揮作用的環(huán)境，即一種由于PGI2具有的血管擴張作用和血小板凝集抑制作用等作用而使HGF引起血管形成的環(huán)境。結(jié)果導(dǎo)致上述意外效應(yīng)。
因此認(rèn)為，具有血管擴張和/或血小板凝集抑制作用的物質(zhì)，或者產(chǎn)生它們的物質(zhì)引起了與聯(lián)合使用PGIS基因等效的效應(yīng)。因此，本發(fā)明提供了一種用于血管形成治療的藥用組合物，它包含至少一種選自下組的物質(zhì)作為活性成分具有血管擴張作用和/或血小板凝集抑制作用的物質(zhì)，以及產(chǎn)生這些物質(zhì)的物質(zhì)；還包括編碼血管形成因子的基因。
特別是，同時具有血管擴張作用和血小板凝集抑制作用的物質(zhì)，以及產(chǎn)生這些物質(zhì)的物質(zhì)優(yōu)選用于本發(fā)明的血管形成治療中。
本文中術(shù)語“具有血管擴張作用的物質(zhì)”包括所有已知具有血管擴張作用的物質(zhì)(市售血管擴張制劑等)，它可以是任何物質(zhì)，包括基因、蛋白、以及低分子量化合物。具體可以是以下物質(zhì)。
常用的血管擴張劑(所謂降壓藥)包括Ca拮抗劑，ACE抑制劑，α1阻斷劑，ANP(心房利尿鈉肽)，鉀離子通道開啟劑，肼等。
特別是，用于ASO的血管擴張劑包括前列腺素制劑如PGI2，PGE1及其衍生物(iloprost，beraprost鈉，lipoPGE1等)；此外，增加NO供體或胞內(nèi)cGMP濃度的藥物，如亞硝酸化合物包括硝化甘油；增加胞內(nèi)cAMP的藥物，如磷酸二酯酶抑制劑。
優(yōu)選的制劑是增加cAMP的藥物或前列腺素制劑，更優(yōu)選PGI2，PGE1及其衍生物(類似物)，更進一步優(yōu)選PGI2。
“具有血小板凝集抑制作用的物質(zhì)”包括所有已知具有血小板凝集抑制作用的物質(zhì)(市售抗血小板制劑等)，并且可以是任何物質(zhì)，如基因、蛋白、低分子量化合物。特別是，這類物質(zhì)的實例如上述前列腺素制劑，如PGI2，PGE1及其衍生物(iloprost，beraprost sodium，lipoPGE1等)，以及花生四烯酸代謝抑制劑，腺苷環(huán)化酶激活劑，磷酸二酯酶III抑制劑，5-HT2受體拮抗劑，花生四烯酸代謝抑制劑或磷酸二酯酶V抑制劑。
優(yōu)選的物質(zhì)是那些增加cAMP的藥物，或前列腺素制劑。更優(yōu)選PGI2，PGE1，和它們的穩(wěn)定衍生物(類似物)，更進一步優(yōu)選PGI2衍生物。
以上術(shù)語“產(chǎn)生具有血管擴張作用和/或血小板凝集抑制作用的物質(zhì)的物質(zhì)”是指，合成、產(chǎn)生、或誘導(dǎo)上述具有血管擴張作用和/或血小板凝集抑制作用的物質(zhì)的物質(zhì)。特別是，它們指能合成、產(chǎn)生、或誘導(dǎo)上述增加前列腺素或cAMP的物質(zhì)。
這些物質(zhì)可以是基因、蛋白、和低分子量化合物。但在，例如，合成血管擴張物質(zhì)的合酶的情況中，優(yōu)選所述物質(zhì)為基因形式。所述基因的具體實例包括PGIS基因，環(huán)加氧酶-1(COX-1)基因，環(huán)加氧酶-2(COX-2)基因(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89(16)，7384-7388(1992))，NO合酶(內(nèi)皮型和誘導(dǎo)型)基因，細胞色素P450基因，ANP(心房利尿鈉肽)基因，BNP(腦利尿鈉肽)基因，CNP(C-型利尿鈉肽)基因等。優(yōu)選的基因包括PGIS基因，COX-1基因，和COX-2基因，更優(yōu)選PGIS基因。所有這些基因的序列都已經(jīng)登記在公用數(shù)據(jù)庫中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地利用這些登記的基因克隆出所述基因。
一個利用了PGIS基因的實例如下。
本文中，術(shù)語“PGIS基因”是指編碼PGIS蛋白的基因。為了表達的目的而插入表達質(zhì)粒中的PGIS基因也簡稱為“PGIS基因”。具體實例是，如BBRC 200(3)，1728-1734(1994)，和WO 95/30013所述的插入到適當(dāng)表達載體(非病毒載體，病毒載體)中的PGIS cDNA，見下文。此外，與上述HGF基因和VEGF基因相似，修飾的PGIS基因，只要能編碼具有PGIS作用的蛋白，就包括在本發(fā)明的PGIS基因目錄中。
與HGF基因和VEGF基因一樣，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以根據(jù)上述文獻所述的序列，或者根據(jù)數(shù)據(jù)庫中登記的序列信息，很容易地克隆出PGIS基因。還可以很容易地對PGIS基因進行修飾?？蓽y定由所述基因編碼的蛋白是否具有所需PGIS活性，例如，用6-酮前列腺素F1α酶免疫分析試劑盒(Cayman，目錄號#515211)進行免疫分析，或者通過薄層層析(TLC)檢測前列腺環(huán)素合酶的代謝物。另外，還可以通過測定血管形成因子與另一種血管形成因子對以下實施例中小鼠后肢缺血模型的作用，來測定該血管形成因子對血管形成作用的增強作用。
上述具有血管擴張作用和/或血小板凝集抑制作用的物質(zhì)，或能產(chǎn)生它們的物質(zhì)，單獨或與這些物質(zhì)中的某一些聯(lián)合，可用于以血管形成因子基因進行的血管形成治療中。
以下是本發(fā)明用于血管形成治療的藥用組合物的引入方法，引入形式，以及引入量的說明。
1)具有血管擴張作用和/或血小板凝集抑制作用的物質(zhì)，或產(chǎn)生它的物質(zhì)(基因)，以及編碼血管形成因子的基因，的應(yīng)用為了聯(lián)合使用編碼血管形成因子的基因和諸如上述PGIS基因，即聯(lián)合使用兩種或更多種基因，需要采用這些基因的適于進行基因治療的制劑形式。聯(lián)合使用的例子包括HGF基因與PGIS基因聯(lián)合，或VEGF基因與PGIS基因聯(lián)合。
被患者施用基因治療制劑的方式可分為兩類，其一利用非病毒載體，另一利用病毒載體。其制備方法和給藥方法詳見實驗手冊(實驗醫(yī)學(xué)(Experimental Medicine)增刊，“基因治療的一般技術(shù)(Fundamental Techniquesfor Gene Therapy)”，羊土社，1996；實驗醫(yī)學(xué)(Experimental Medicine)增刊，“基因?qū)肱c表達分析的實驗方法(Experimental Methods for Gene Transfer&Expression Analysis)”，羊土社，1997；“基因治療研究和開發(fā)手冊”，i(日本基因治療學(xué)會)編，NTS，1999)。詳述如下A.非病毒載體的應(yīng)用利用重組表達載體，引入了目標(biāo)基因的常規(guī)基因表達載體，通過以下方法可以將目標(biāo)基因引入細胞和組織中。
用于將基因轉(zhuǎn)染至細胞中的方法的實例包括磷酸鈣共沉淀法，利用毛細玻璃管直接注入DNA的方法等。
將基因轉(zhuǎn)染至組織中的方法的實例包括通過內(nèi)包型脂質(zhì)體進行的基因轉(zhuǎn)染方法，通過靜電型脂質(zhì)體進行的基因轉(zhuǎn)染方法，HVJ(日本血凝素病毒)-脂質(zhì)體法，改良的HVJ-脂質(zhì)體法(HVJ-AVE脂質(zhì)體法)，受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的方法，通過粒子槍將載體(金屬粒子)與DNA分子一起引入細胞的方法，直接引入裸露DNA的方法，通過帶正電的聚合物引入的方法，等等?？梢杂眠@些方法中的任何一種將重組表達載體引入細胞。在這些方法中，直接引入裸露DNA的方法是最簡便的，因此從這種角度說是最優(yōu)選的引入方法?；蛘撸琀VJ-脂質(zhì)體法也是優(yōu)選的轉(zhuǎn)染形式，因為與傳統(tǒng)的脂質(zhì)體法相比，它能以極高的活性與細胞膜融合。優(yōu)選將Z毒株(得自ATCC)作為HVJ，但原則上也可以使用其它HVJ毒株(例如ATCC VR-907，ATCC VR-105等)。
本發(fā)明中可以使用任何表達載體，只要它能體內(nèi)表達所需的基因，這樣的載體包括，例如，pCAGGS(Gene，108，193-200(1991))，pBK-CMV，pcDNA3.1，pZeoSV(Invitrogen，Stratagene)。
可以將上述兩種或更多基因，以兩種或更多重組表達載體的混合物的形式同時，或以一定時間間隔分別轉(zhuǎn)染至機體中，所述混合物可通過將所述基因引入不同表達載體而制備。另一種方法是，引入單一表達載體，其中所述兩種或更多基因已插入一種表達載體中。此外，有了上述脂質(zhì)體制劑，就可以將兩種或更多種重組表達載體包括在一種脂質(zhì)體中而實施轉(zhuǎn)染，或通過將每種重組表達載體包括在各自的脂質(zhì)體中而實施轉(zhuǎn)染。
B.病毒載體的應(yīng)用病毒載體的實例包括重組腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒等。更具體地，可以通過將基因引入DNA病毒或RNA病毒，并用該重組病毒感染細胞，而將基因引入細胞，所述病毒如無毒力的逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，腺伴隨病毒，皰疹病毒，痘苗病毒，痘病毒，脊髓灰質(zhì)炎病毒，仙臺病毒，SV40，以及免疫缺陷病毒(HIV)。
在上述病毒載體中，已知腺病毒的感染效力遠高于其它病毒載體。因此，從這個角度說，優(yōu)選使用腺病毒載體系統(tǒng)。
與上述非病毒載體相似，也可以通過制備分別引入了兩種或更多基因的重組表達載體，而將上述這些腺病毒載體以混合物的形式同時引入，或者間隔一定時間分別引入?；蛘?，可以引入單一重組表達載體，其中已將兩種或更多基因引入一種表達載體中。
此外，可以一并使用上述非病毒載體以及病毒載體將兩種或更多種基因引入活體中。
引入本發(fā)明用于基因治療的制劑的方法包括(i)將所述基因治療制劑直接引入機體中的體內(nèi)方法；和(ii)收獲來自人體的特定類型的細胞，在機體外將所述基因治療制劑引入所述細胞，然后將修飾的細胞引入機體的回體(ex vivo)方法(日經(jīng)Science，April 1994，20-45；月刊藥事36(1)，23-48，1994；實驗醫(yī)學(xué)(Experimental Medicine)增刊，12(15)，1994；“基因治療研究和開發(fā)手冊”，(日本基因治療學(xué)會)編，NTS，1999)。本發(fā)明優(yōu)選上述體內(nèi)方法。
通過體內(nèi)方法給藥時，根據(jù)所治療的疾病，靶器官等等來選擇合適的給藥途徑。例如，靜脈給藥，動脈給藥，皮下給藥，皮內(nèi)給藥，肌肉內(nèi)給藥等，或者直接在病變部位局部給藥。
可以通過不同的制備形式來適應(yīng)上述每種給藥方式所適合的不同劑型(例如，液體制劑等)。例如，可以采用常規(guī)方法制備含有基因作為活性成分的注射劑，例如，將適當(dāng)溶劑(緩沖液，如PBS，生理鹽水，已滅菌的水等)溶解；必要時通過濾器過濾除菌，然后裝入無菌容器中?？筛鶕?jù)該注射劑的要求添加常規(guī)載體等?；蛘?，脂質(zhì)體，如HVJ-脂質(zhì)體可以是脂質(zhì)體制劑的形式，如懸浮劑，凍結(jié)劑，或離心濃縮的凍結(jié)劑。
此外，為了便于病灶周圍存在所述基因，可以制備控釋制劑(微型丸劑等)并埋植在病灶附近。也可以用滲透泵連續(xù)和逐步給藥。
上述兩種或更多種重組表達載體可以采用不同劑型，或者可以是含有混合制劑的一種劑型。
制劑中所述基因的含量可根據(jù)所治療的疾病，患者年齡和體重等進行適當(dāng)調(diào)整；但通常優(yōu)選每種基因每隔數(shù)日或數(shù)月給藥0.0001-100mg，或優(yōu)選0.001-10mg一次。
2)具有血管擴張作用和/或血小板凝集抑制作用的物質(zhì)，和產(chǎn)生它的物質(zhì)(低分子量化合物，蛋白等)，以及編碼血管形成因子的基因，的應(yīng)用編碼血管形成因子的基因和低分子量化合物，蛋白，肽等聯(lián)合使用時，所述編碼血管形成因子的基因應(yīng)該采用上述基因治療制劑的形式。另一方面，低分子量化合物等物質(zhì)都是以常規(guī)藥用組合物的形式口服或胃腸外給藥。代表性的組合包括，HGF基因與PGI2衍生物的組合，VEGF基因與PGI2衍生物的組合等。
含有上述低分子量化合物，蛋白等物質(zhì)作為活性成分的藥用組合物的例子如下所述。
上述已經(jīng)作為血管擴張劑或血小板凝集抑制劑(抗血小板劑)產(chǎn)品銷售的低分子量化合物或蛋白的給藥方法，劑量等，可以根據(jù)它們所聲明的優(yōu)點來設(shè)定。但通常的給藥形式和方法可以是如下所述。
口服給藥可以使用本領(lǐng)域常規(guī)的給藥形式。胃腸外給藥的形式可以是諸如局部給藥制劑(經(jīng)皮劑等)，直腸給藥制劑，注射劑和鼻內(nèi)用藥制劑。
口服制劑或直腸給藥制劑的例子包括，膠囊，片劑，丸劑，粉劑，滴劑，栓劑，液體制劑等。注射劑的例子包括，無菌溶液，懸浮液，乳液等；具體有，水，水-聚乙二醇溶液，緩沖液，0.4％生理鹽水等。局部給藥制劑包括，例如，乳膏，軟膏劑，洗劑，經(jīng)皮劑，等等。
可以用本領(lǐng)域常規(guī)方法將上述劑型與可藥用填充劑和添加劑一起配制。可藥用填充劑和添加劑包括載體，結(jié)合劑，香味劑，緩沖劑，增稠劑，著色劑，穩(wěn)定劑，乳化劑，分散劑，懸浮劑，防腐劑，pH調(diào)節(jié)劑，滲透壓調(diào)節(jié)劑，潤滑劑等?？伤幱幂d體包括，例如，碳酸鎂，乳糖，果膠，淀粉，甲基纖維素等。
可以根據(jù)所治療的疾病，靶器官等等選用適當(dāng)途徑來給藥上述藥用組合物。例如，靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)等，或者直接在病灶部位局部給藥。此外，也可以口服或使用栓劑。
給藥劑量和頻率根據(jù)患者癥狀、年齡、體重，給藥形式等而不同；但每日成人劑量通常是約0.0001-500mg，優(yōu)選約0.001-100mg，可以一次給足，或分多次給與。
含有上述低分子量化合物和蛋白作為活性成分的藥用組合物可以與含有編碼血管形成因子的基因的基因治療制劑同時給藥，或者間隔一定時間給藥。
本發(fā)明用于血管形成治療的藥用組合物適用于需要血管形成治療的所有疾病。具體例如缺血性疾病或動脈疾病。更具體地，心臟疾病的例子包括缺血性心臟病、心肌梗塞、急性心肌梗塞、心肌病、心絞痛、不穩(wěn)定的心絞痛、冠狀動脈硬化、心衰等；四肢缺血性疾病的實例包括閉塞性動脈硬化(ASO)，伯格(Berger)病、血管損傷、動脈栓塞、動脈血栓、器官動脈閉塞、動脈瘤等。其它實例有腦血管疾病，具體例子包括，腦血管閉塞、腦梗塞、腦血栓、腦栓塞、腦卒中、腦出血、腦底異常血管網(wǎng)病、腦血管性癡呆、阿爾茨海默型癡呆(Alzheimer type dementia)、腦出血后遺癥、和腦梗死后遺癥。本發(fā)明的藥用組合物尤其對閉塞性動脈硬化有效。
此外，本發(fā)明還提供了用于增強編碼血管形成因子的基因所致的血管形成效應(yīng)的制劑，它包含至少一種選自下組的物質(zhì)作為其活性成分具有血管擴張作用和/或血小板凝集抑制作用的物質(zhì)，和產(chǎn)生它們的物質(zhì)。如上所述，作為本發(fā)明用于血管形成治療的藥用組合物的活性成分的物質(zhì)，具有增強編碼血管形成因子的基因的血管形成作用的效應(yīng)。因此，如上所述，它可以用作血管形成治療的藥用組合物的成分之一，它還可單獨用作增效劑以增強編碼血管形成因子的基因的血管形成作用。本發(fā)明的增效劑可有效用于編碼血管形成因子的基因的作用不足的情況中。本發(fā)明的增效劑可以僅包含一種成分(物質(zhì))，或包含多種成分(物質(zhì))的組合。
具體地，本發(fā)明增效劑的活性成分包括上述PGIS基因或COX基因。其它例子還有PGI2，PGE1，它們的衍生物，等等；優(yōu)選PGIS基因。所述血管形成因子可以是HGF或VEGF。
本發(fā)明增效劑的給藥方法，給藥形式，適用癥等等特點都與上述血管形成治療藥用組合物的特點相同。
此外，本發(fā)明提供了包含PGIS基因作為活性成分的血管形成制劑。即，這是第一次表明，單獨給藥PGIS基因可導(dǎo)致血管形成效應(yīng)。這是尚未為人所知的一種新效應(yīng)，它歸因于發(fā)現(xiàn)PGIS基因可用作血管形成制劑。本發(fā)明的血管形成制劑可用于上述需要血管形成的所有疾病(缺血性疾病，和動脈疾病)。而且，給藥方法，給藥形式等都相同于上述用于血管形成治療的藥用組合物。
此外，也是由本發(fā)明第一次表明，ets-1基因可用作血管形成治療的基因治療劑。也就是說，如下文實施例所證實的那樣，單獨給與ets-1基因可觀察到血管形成效應(yīng)，將ets-1基因與HGF基因聯(lián)合使用，與它們?nèi)我粋€單獨給藥相比，可以增強血管形成。
本文中，ets-1是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其表達通常因HGF，VEGF，bFGF，和EGF等血管形成因子的作用而增強。已知這些血管形成因子可通過ets-1來活化與血管形成有關(guān)的各種因子(J.Cell.Physiol.，169，522-531(1996)；“HGF的分子醫(yī)學(xué)(Molecular Medicine of HGF)”，Medical Review，179-185(1998)))。因此，通過將ets-1基因與除了HGF基因以外的其它血管形成因子(如VEGF基因)聯(lián)合使用，可以獲得與HGF基因聯(lián)合使用相同的效應(yīng)。
因此，本發(fā)明提供了新的用于血管形成治療的藥用組合物，其中單獨應(yīng)用了ets-1基因或?qū)⒃摶蚺c其它血管形成因子聯(lián)合使用。具體地，有以下三種實例(1)一種用于血管形成治療的藥用組合物，其包含ets-1基因和另一種編碼血管形成因子的基因作為活性成分；(2)一種制劑，其包含ets-1基因作為增強由另一種編碼血管形成因子的基因所致的血管形成作用的活性成分；和(3)一種血管形成制劑，其包含ets-1基因作為活性成分。
本文中，術(shù)語“ets-1 gene”是指編碼ets-1(ets-1蛋白)的基因。被摻入表達質(zhì)粒中以便表達的ets-1基因也可以簡稱為“ets-1基因”。具體實例有，GenBank登錄號為J04101的人ets-1 cDNA，由Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85(21)，7862-7866(1988)所述的摻入適當(dāng)?shù)幕蛑委煴磉_載體(非病毒載體，病毒載體)，如上述的那些。可以用類似于上述對HGF基因和VEGF基因的方法克隆ets-1基因。此外，本發(fā)明的ets-1基因不限于天然類型，只要是能表達基本上與ets-1相同效應(yīng)的蛋白，這樣的基因就包括在內(nèi)。
與上述HGF基因和PGIS基因類似，可以將這種ets-1基因配制成基因治療制劑。而且，引入活體的方法和引入量，劑型等都與HGF基因和PGIS基因的情況相同。
如上述(1)所述，為了聯(lián)合使用ets-1基因與其它編碼血管形成因子的基因(除ets-1以外)，可以將這兩種或更多種基因如下配制。使用非病毒載體時，將基因插入不同表達載體中，構(gòu)建出不同的重組表達載體，用這些載體以混合物的形式同時轉(zhuǎn)染活體，或以一定時間間隔分別轉(zhuǎn)染活體。另一種方法是，將所述兩種或更多種基因摻入一種表達載體中，然后引入這種單一表達載體。如果給藥形式是脂質(zhì)體制劑，可通過將上述不同的表達載體包含在一個脂質(zhì)體中，或者通過將這些不同的重組表達載體分別包容至不同脂質(zhì)體中，而引入上述不同的重組表達載體。
另一方面，使用病毒載體時，可以將重組表達載體(其中已將兩種或更多種基因摻入不同表達載體中)可以以混合物的形式同時引入，或者以一定時間間隔，用類似于上述對非病毒載體的方法引入?；蛘?，可以引入單個重組表達載體，其中已將兩種或更多種基因摻入一種表達載體中。
或者，可以用上述非病毒載體和病毒載體來將兩種或更多種基因引入活體中。
與ets-1基因聯(lián)合使用的血管形成因子的基因可以是任何基因，只要它編碼出能誘導(dǎo)新血管形成的蛋白或多肽，或其一部分，如上所述。優(yōu)選HGF基因和VEGF基因，更優(yōu)選HGF基因。
此外，如上述(2)所述，本發(fā)明的ets-1可以單獨用作增強編碼血管形成因子的基因(如HGF和VEGF)的血管形成作用的增效劑。這種包含ets-1基因作為活性成分的增效劑可用于編碼血管形成因子的基因的作用不足的情況中。特別是，它可有效用作增強HGF基因的作用的增效劑。此外，本發(fā)明的ets-1基因可以單獨用作上述(3)所述的血管形成制劑。當(dāng)以此種方式單獨使用ets-1基因時，可以應(yīng)用與上述基因治療制劑相同的給藥方法和給藥形式。
上述使用ets-1基因的血管形成治療可應(yīng)用于，例如，疾病，特別是缺血性疾病或動脈疾病，更尤其心臟病，如缺血性心臟病心肌梗塞，急性心肌梗塞，心肌病，心絞痛，不穩(wěn)定的心絞痛，冠狀動脈硬化癥，心衰和四肢缺血性疾病，如閉塞性動脈硬化(ASO)、伯格病、血管損傷、動脈栓塞、動脈血栓、器官動脈閉塞、動脈瘤。其它實例有腦血管疾病等。具體地，腦血管疾病的實例包括腦血管閉塞、腦梗塞、腦血栓、腦栓塞、腦卒中、腦出血、腦底異常血管網(wǎng)病、腦血管性癡呆、阿爾茨海默氏癡呆、腦出血后遺癥、和腦梗塞后遺癥。這些疾病中，本發(fā)明含有ets-1基因作為活性成分的藥用組合物都可以有效應(yīng)用，特別對閉塞性動脈硬化有效。


圖1是給小鼠后肢缺血性ASO模型給藥各種基因(對照，HGF基因，PGIS基因，HGF基因+PGIS基因)后，用激光多普勒成像儀(Laser DopplerImager)測量后肢血流的結(jié)果，它顯示了左-右比率隨時間的變化。
圖2是給小鼠后肢缺血性ASO模型給藥各種基因(對照，HGF基因，PGIS基因，HGF基因+PGIS基因)后，用激光多普勒成像儀測量后肢血流的結(jié)果，它顯示了左-右比率與給藥所述基因之前相比，隨時間變化的增長率。
圖3是給小鼠后肢缺血性ASO模型給藥各種基因(對照，HGF基因，PGIS基因，HGF基因+PGIS基因)后，缺血性后肢肌肉中毛細血管數(shù)的檢查結(jié)果。
圖4是給大鼠后肢缺血性ASO模型給藥各種基因(對照，HGF基因，ets-1基因，HGF基因+ets-1基因)后，用激光多普勒成像儀測量后肢血流的結(jié)果，它顯示了右-左后肢血流比率的增長率。
圖5是給大鼠后肢缺血性ASO模型給藥各種基因(對照，HGF基因，ets-1基因，HGF基因+ets-1基因)后，缺血性后肢肌肉中毛細血管的密度。
圖6是給大鼠后肢缺血性ASO模型給藥各種基因(對照，HGF基因，ets-1基因，HGF基因+ets-1基因)后，缺血性后肢肌肉中的大鼠HGF濃度。
圖7是給大鼠后肢缺血性ASO模型給藥ets-1基因后，缺血性后肢肌肉中的大鼠HGF濃度。
圖8是給小鼠后肢缺血性ASO模型給藥PGIS基因，VEGF基因，或VEGF基因+PGIS基因后，缺血性后肢肌肉中的人VEGF濃度。
圖9是形成小鼠后肢缺血性ASO模型的手術(shù)10天后，通過LDI測定的未處理的右后肢(正常)和左后肢(ASO)的血流比率。
圖10是給小鼠后肢缺血性ASO模型給藥PGIS基因，VEGF基因，或VEGF基因+PGIS基因的2周后，通過LDI測定的缺血性后肢肌肉中血流量的增長比。
圖11是給小鼠后肢缺血性ASO模型給藥PGIS基因，VEGF基因，或VEGF基因+PGIS基因的4周后，通過LDI測定的缺血性后肢肌肉中血流量的增長比。
圖12是給小鼠后肢缺血性ASO模型給藥PGIS基因和HGF基因，VEGF基因，或VEGF基因和PGIS基因的4周后，通過堿性磷酸酶染色的缺血性后肢肌肉的冰凍切片照片。
圖13是給小鼠后肢缺血性ASO模型給藥PGIS基因，VEGF基因，或VEGF基因+PGIS基因的4周后，毛細血管的密度。
實施本發(fā)明的最佳模式下文中，本發(fā)明將通過實施例進行描述，但這并不意味著僅限于這些
對小鼠后肢缺血性ASO模型給藥HGF基因或PGIS基因的效應(yīng)(1)材料人HGF cDNA(特開平5-111383號公報記載)用常規(guī)方法克隆，并插入含有巨細胞病毒(CMV)啟動子的表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)(Invitrogen)中，作為人HGF基因來使用。
人PGIS cDNA(B.B.R.C.，Vol.200，No.3，p1728-1734(1994))用常規(guī)方法克隆，并插入含有CMV增強子和β-肌動蛋白啟動子的表達質(zhì)粒pCAGGS(Gene 108，193-200(1991))中，用作人PGIS基因。
(2)方法使用C57BL/6J小鼠(8周齡，雄性)。對小鼠實施麻醉，方法是腹膜內(nèi)注射200μl 10-倍稀釋的戊巴比妥，必要時再吸入乙醚。然后，結(jié)扎左后肢動靜脈以制作小鼠后肢缺血性ASO模型。10天后，用激光多普勒成像儀(LDI，Moor Instruments Ltd.，MLDI5070)評價雙側(cè)后肢的血流，計算左-右比率。然后，將500μg以上(1)所述每種基因以裸露質(zhì)粒的形式給藥至左后肢肌肉中。共設(shè)立4個組即，未給藥的對照組；HGF基因單獨給藥組；PGIS基因單獨給藥組；以及HGF基因和PGIS基因聯(lián)合給藥組。給藥這些基因的2周和4周后，用LDI評價血流，計算所述比率。此外，4周后，摘出左后肢肌肉，制備冰凍切片，通過堿性磷酸酶染色來測定毛細血管密度。用Fisher的PLSD方法檢驗顯著性差異。
(3)結(jié)果左-右后肢血流比率隨時間的改變通過LDI測定，示于圖1。此外，相對于基因給藥之前LDI比率的增長率示于圖2。PGIS基因給藥2周后，血流改善，但給藥4周后，幾乎與對照組相同。HGF基因給藥的2周和4周后，血流都得到改善。意外的是，PGIS基因和HGF基因的聯(lián)合使用相較于單獨給與這些基因，血流得到顯著改善(2周后對照為100％，HGF基因給藥為132％，PGIS基因給藥為125％，HGF基因+PGIS基因聯(lián)合給藥為177％，P＜0.01；4周后對照為100％，HGF基因給藥為150％，PGIS基因給藥為104％，HGF基因+PGIS基因聯(lián)合給藥為166％，P＜0.01)。
基因給藥4周后，肌肉中的毛細血管密度見圖3。毛細血管密度由于給藥PGIS基因或HGF基因而增加。而且，通過聯(lián)合使用PGIS基因和HGF基因，毛細血管密度相較于單獨給藥顯著增加。
對大鼠后肢缺血性ASO模型給藥HGF基因和ets-1基因的效應(yīng)(1)材料使用攜有人HGF基因的表達質(zhì)粒，與實施例1一樣。人ets-1 cDNA(GenBank登錄號J04101，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85(21)，7862-7866(1988))通過常規(guī)方法克隆，并插入市售表達載體中，用作人ets-1基因。
(2)方法使用Sprauge Dawley大鼠(12周齡，雄性)。摘出一側(cè)股動脈，以制作大鼠后肢缺血性ASO模型。1周后，將100μg的每種基因用HVJ-脂質(zhì)體法給藥至左后肢肌肉。共設(shè)立4個組僅給藥載體的對照組；HGF基因單獨給藥組；ets-1基因單獨給藥組；以及HGF基因和ets-1基因聯(lián)合給藥組。給藥前和給藥4周后，用LDI評價兩后肢中的血流，計算左-右血流比率的增長率。此外，摘出左后肢肌肉，制備冰凍切片，通過堿性磷酸酶染色來測定肌肉中的毛細血管密度。為了研究基因給藥對內(nèi)源性HGF的影響，用ELISA試劑盒(Institute of Immunology)測定缺血的后肢中，大鼠HGF的肌肉內(nèi)濃度。
(3)結(jié)果通過單獨給與ets-1基因，增強了肌肉組織中的ets-1結(jié)合活性。此外，通過單獨給與ets-1基因，用LDI所測的后肢血流比率的增長率提高(圖4)，肌肉中的毛細血管密度增加(圖5)，這些結(jié)果表明，單獨給藥ets-1基因?qū)ρ苄纬傻男?yīng)，以及對ASO模型的有效性。此外，在ets-1基因單獨給藥組中，缺血后肢中的肌肉內(nèi)HGF濃度增加(圖6和圖7)，據(jù)認(rèn)為這是ets-1基因給藥發(fā)生效應(yīng)的機制之一。
在ets-1基因和HGF基因聯(lián)合給藥組中，LDI血流比率的增長率相較于ets-1基因或HGF基因單獨給藥組顯著增加(圖4)。聯(lián)合給藥還使肌肉內(nèi)毛細血管密度顯著增加(圖5)?？梢姡龌虻穆?lián)合轉(zhuǎn)染比單獨應(yīng)用更促進血管形成。因此，這些基因的聯(lián)合比單獨基因轉(zhuǎn)染能更有效對抗ASO。
根據(jù)對大鼠缺血后肢肌肉中內(nèi)源性HGF濃度的測定，大鼠HGF濃度在HGF基因和ets-1聯(lián)合給藥組高于在HGF基因單獨給藥組(圖6)。這提示HGF具有通過活化ets-1而進行的自我循環(huán)型(auto-loop type)調(diào)節(jié)機制，因為與ets-1基因聯(lián)合給藥比HGF基因單獨給藥更促進內(nèi)源性HGF的表達。
對小鼠后肢缺血性ASO模型給藥VEGF基因和PGIS基因的效應(yīng)(1)材料人VEGF165 cDNA(九洲大學(xué)第II外科米滿教授惠贈)用常規(guī)方法克隆，插入帶有CMV增強子和β-肌動蛋白啟動子的表達質(zhì)粒pCAGGS(Gene 108，193-200(1991))中的EcoRI位點，作為人VEGF基因來用。
人PGIS cDNA(B.B.R.C.，Vol.200，No.3，p1728-1734(1994))用常規(guī)方法克隆，插入帶有CMV增強子和β-肌動蛋白啟動子的表達質(zhì)粒pCAGGS(Gene 108，193-200(1991))中，作為PGIS基因來用。
(2)方法1.使用C57BL/6J小鼠(8周齡，雄性)。對小鼠實施麻醉，方法是腹膜內(nèi)注射200μl 10-倍稀釋的戊巴比妥，必要時再吸入乙醚。然后，結(jié)扎左后肢動靜脈以制作小鼠后肢缺血性ASO模型。評價后，將1mg以上(1)所述每種基因以裸露質(zhì)粒的形式給藥至左后肢肌肉中。共設(shè)立4個組未給藥的對照組；VEGF基因單獨給藥組；PGIS基因單獨給藥組；以及VEGF基因和PGIS基因聯(lián)合給藥組。每組4只動物。將每種質(zhì)粒給藥至左脛骨肌，之后的第5天，用AN’ALYZA免疫分析系統(tǒng)人VEGF試劑盒(GENZYME)測定缺血的后肢中，人VEGF蛋白的肌肉內(nèi)濃度(圖8)。
2.通過與上述類似的方法制作小鼠后肢缺血性ASO模型。10天后，用激光多普勒成像儀(LDI，Moor Instruments Ltd.，MLDI5070)評價雙例后肢的血流，計算左-右比率(圖9右腿(正常)，左后肢(ASO))。結(jié)果證實，以正常血流為100％時，左后肢中的血流量減少了近30％。評估后，將500μg以上(1)所述每種基因以裸露質(zhì)粒的形式給藥至左后肢肌肉中。共設(shè)立4個組未給藥的對照組；VEGF基因單獨給藥組；PGIS基因單獨給藥組；以及VEGF基因和PGIS基因聯(lián)合給藥組。給藥這些基因的2周和4周后，用LDI評價血流，并計算增長率。此外，4周后，摘出左后肢肌肉，制備冰凍切片，通過堿性磷酸酶染色來測定毛細血管密度(圖12)。用Fisher的PLSD方法檢驗顯著性差異。
(3)結(jié)果
1.如圖8所示，對照組和PGIS基因給藥組中未檢測到人VEGF蛋白的肌肉內(nèi)濃度，VEGF基因和PGIS基因聯(lián)合給藥組所檢測到的上述濃度比VEGF基因單獨給藥組的高。
2. 2周后通過LDI測得的左后肢血流的增長率見圖10，4周后的結(jié)果見圖11。無論是VEGF基因單獨給藥，還是VEGF基因和PGIS基因聯(lián)合給藥，2周后的血流未見改善。但4周后，VEGF基因單獨給藥以及VEGF基因和PGIS基因聯(lián)合給藥相較于對照組，血流都得到改善。意外的是，PGIS基因和VEGF基因的聯(lián)合使用相較于單獨給與這些基因，血流得到顯著改善(2周后對照為100％，PGIS基因給藥為105％，VEGF基因給藥為117％，VEGF基因+PGIS基因聯(lián)合給藥為115％；4周后對照為100％，PGIS基因給藥為103％，VEGF基因給藥為130％，VEGF基因+PGIS基因聯(lián)合給藥為169％，P＜0.01)。
基因給藥4周后，肌肉中的毛細血管密度見圖13。毛細血管密度由于VEGF基因給藥而增加。而且，通過聯(lián)合使用PGIS基因和VEGF基因，毛細血管密度相較于單獨給藥顯著增加。(對照為100％，PGIS基因給藥為175％，VEGF基因給藥為221％，VEGF基因+PGIS基因聯(lián)合給藥為338％，P＜0.0001)。
工業(yè)實用性本發(fā)明提供了一種新的用于血管形成治療的高效藥用組合物，它包含至少一種選自下組的物質(zhì)作為活性成分具有血管擴張作用和/或血小板凝集抑制作用的物質(zhì)，以及產(chǎn)生這些物質(zhì)的物質(zhì)；還包括編碼血管形成因子的基因。此外，對于前列腺環(huán)素合酶基因和ets-1基因等基因，以前不知道它們可用于血管形成治療，而本發(fā)明新發(fā)現(xiàn)它們可用于血管形成治療。本發(fā)明還提供了包含這些基因作為活性成分的用于血管形成治療的藥用組合物。
權(quán)利要求
1.一種用于血管形成治療的藥物組合物，它包含編碼血管形成因子的基因和至少一種選自下組的物質(zhì)作為活性成分具有血管擴張作用和/或血小板凝集抑制作用的物質(zhì)，以及產(chǎn)生這些物質(zhì)的物質(zhì)。
2.一種用于血管形成治療的藥物組合物，其特征在于將編碼血管形成因子的基因與至少一種選自下組的物質(zhì)聯(lián)合使用具有血管擴張作用和/或血小板凝集抑制作用的物質(zhì)，以及產(chǎn)生這些物質(zhì)的物質(zhì)。
3.權(quán)利要求1或2的用于血管形成治療的藥物組合物，其中所述血管形成因子是HGF和/或VEGF。
4.權(quán)利要求1-3任一項所述的用于血管形成治療的藥物組合物，其中所述能產(chǎn)生具有血管擴張作用和/或血小板凝集抑制作用之物質(zhì)的物質(zhì)為一種基因。
5.權(quán)利要求4的用于血管形成治療的藥物組合物，其中所述基因為前列腺環(huán)素合酶基因。
6.一種用于血管形成治療的藥物組合物，其包含HGF基因和前列腺環(huán)素合酶基因作為活性成分。
7.一種用于血管形成治療的藥物組合物，其特征在于將HGF基因和前列腺環(huán)素合酶基因聯(lián)合使用。
8.一種用于血管形成治療的藥物組合物，其包含VEGF基因和前列腺環(huán)素合酶基因作為活性成分
9.一種用于血管形成治療的藥物組合物，其特征在于將VEGF基因和前列腺環(huán)素合酶基因聯(lián)合使用。
10.權(quán)利要求1-9任一項所述的用于血管形成治療的藥物組合物，其中所述組合物用于治療或預(yù)防缺血性疾病或動脈疾病。
11.權(quán)利要求10的用于血管形成治療的藥物組合物，其中所述缺血性疾病或動脈疾病選自閉塞性動脈硬化，心肌梗塞，心絞痛，心肌病，和腦血管疾病。
12.權(quán)利要求1-11任一項所述的用于血管形成治療的藥物組合物，其中所述基因以裸露DNA的形式引入。
13.一種用于增強編碼血管形成因子的基因的血管形成作用的制劑，它包含至少一種選自下組的物質(zhì)作為活性成分具有血管擴張作用和/或血小板凝集抑制作用的物質(zhì)，以及產(chǎn)生這些物質(zhì)的物質(zhì)。
14.權(quán)利要求13的增強血管形成作用的制劑，其中所述血管形成因子是HGF和/或VEGF。
15.權(quán)利要求13或14所述增強血管形成作用的制劑，其包含前列腺環(huán)素合酶基因作為活性成分。
16.一種用于增強HGF基因的血管形成作用的制劑，其包含前列腺環(huán)素合酶基因作為活性成分。
17.權(quán)利要求13-16任一項所述增強血管形成作用的制劑，其用于治療或預(yù)防缺血性疾病或動脈疾病。
18.一種血管形成制劑，包含前列腺環(huán)素合酶基因作為活性成分。
19.權(quán)利要求18的血管形成制劑，用于治療或預(yù)防缺血性疾病或動脈疾病。
20.一種用于血管形成治療的藥物組合物，其包含ets-1基因和另一種編碼血管形成因子的基因作為活性成分。
21.一種用于血管形成治療的藥物組合物，其特征在于聯(lián)合使用ets-1基因和另一種編碼血管形成因子的基因。
22.權(quán)利要求20或21的用于血管形成治療的藥物組合物，其中所述血管形成因子是HGF和/或VEGF。
23.一種用于血管形成治療的藥物組合物，其包含HGF基因和ets-1基因作為活性成分。
24.一種用于血管形成治療的藥物組合物，其特征在于聯(lián)合使用HGF基因和ets-1基因。
25.權(quán)利要求20-24任一項所述用于血管形成治療的組合物，其中所述組合物用于治療或預(yù)防缺血性疾病或動脈疾病。
26.一種含有ets-1基因作為活性成分的制劑，它增強另一種編碼血管形成因子的基因的血管形成作用。
27.權(quán)利要求26的增強血管形成作用的制劑，其中所述血管形成因子是HGF和/或VEGF。
28.一種用于增強HGF基因的血管形成作用的制劑，其包含ets-1基因作為活性成分。
29.權(quán)利要求26-28任一項所述增強血管形成作用的制劑，其中該制劑用于治療或預(yù)防缺血性疾病或動脈疾病。
30.一種血管形成制劑，包含ets-1基因作為活性成分。
31.權(quán)利要求30的血管形成制劑，其用于治療或預(yù)防缺血性疾病或動脈疾病。
全文摘要
本發(fā)明提供(1)用于血管形成治療的藥物組合物，它包含至少一種選自下組的物質(zhì)作為活性成分具有血管擴張作用和/或血小板凝集抑制作用的物質(zhì)，以及產(chǎn)生這些物質(zhì)的物質(zhì)；和編碼血管形成因子的基因；(2)增強編碼血管形成因子的基因的血管形成作用的制劑，它包含至少一種選自下組的物質(zhì)作為活性成分具有血管擴張作用和/或血小板凝集抑制作用的物質(zhì)，以及產(chǎn)生這些物質(zhì)的物質(zhì)；(3)一種血管形成制劑，它包含前列腺環(huán)素合酶基因作為活性成分；(4)用于血管形成治療的藥物組合物，它包含ets－1基因和另一種編碼血管形成因子的基因作為活性成分；(4)一種制劑，它包含ets－1基因作為活性成分，用于增強另一種編碼血管形成因子的基因的血管形成作用；和(5)一種血管形成制劑，它包含ets－1基因作為活性成分。
文檔編號A61K31/5585GK1446105SQ01814006
公開日2003年10月1日 申請日期2001年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月27日
發(fā)明者森下竜一, 小池弘美, 田邊忠, 青木元邦 申請人:安增生摩祺株式會社, 森下竜一