br>[0088] 實(shí)施例4:知母皂苷N對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率的影響實(shí)驗(yàn)
[0089] 樣品液的配制：精密稱(chēng)取適量待測(cè)樣品置于IOmL容量瓶中，加水定容至刻度并超 聲溶解，3800rpm離心15min，取上清液即得濃度為30mg/mL待測(cè)樣品液，并稀釋得到0.5mg/ mL、0.75mg/mL和1.5mg/mL的藥液(測(cè)定時(shí)樣品溶液與酶溶液體積比1:2混合，即樣品溶液被 稀釋了 3倍）。
[0090] 給藥濃度的確定:本實(shí)驗(yàn)分別考察了樣品濃度為0.125mg/mL、0.25mg/mL和0.5mg/ mL時(shí)對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率，以選擇合適的藥液濃度。測(cè)定方法如下：將α-葡萄糖苷酶 IOOyL與樣品溶液50yL混合，在37°C水浴中孵育IOmin后加入50yL底物PNPG，37°C反應(yīng)45min 后，加入IOOyL濃度為0 · 3mo I /L的Na2CO3，終止反應(yīng)。于405nm處測(cè)定在酶作用下從PNPG中釋 放出的對(duì)硝基苯的吸光度值。
[0091] 由于藥液本身有顏色，本實(shí)驗(yàn)設(shè)立模型空白組（以I3BS代替酶）、樣品空白組（以I3BS 代替酶），以消除藥液本身顏色對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響(表5)。
[0092] 表5α-葡萄糖苷酶活性測(cè)定反應(yīng)系統(tǒng)
[0094]按照如下公式計(jì)算各組藥物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率，結(jié)果見(jiàn)表6。
[0096]表6不同濃度樣品藥液對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率(mean 土 sd，η = 6)
[0098]注:*P〈0 · 05vs ·模型組，**P〈0 · 01 vs ·模型組。
[0099]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，知母皂苷N對(duì)α-葡萄糖苷酶具有顯著的抑制作用。
[0100] 實(shí)施例5:知母皂苷N與多類(lèi)陽(yáng)性對(duì)照藥對(duì)四氧嘧啶誘導(dǎo)1型糖尿病小鼠的藥效比 較實(shí)驗(yàn)研究
[0101] 在體外模型實(shí)驗(yàn)中，顯示了知母皂苷N具有顯著性降糖作用。本實(shí)驗(yàn)將采用尾靜脈 注射四氧嘧啶的方法制備1型糖尿病小鼠模型，考察知母皂苷N以及陽(yáng)性對(duì)照藥對(duì)該模型血 糖等指標(biāo)的影響，判斷知母皂苷N在體內(nèi)是否具有顯著性降糖作用。選擇目前應(yīng)用最廣的 中藥和化藥降糖藥物消渴丸和鹽酸二甲雙胍片作為陽(yáng)性對(duì)照藥。
[0102] 實(shí)驗(yàn)材料
[0103] 動(dòng)物：ICR小鼠，雄性，18-22g，購(gòu)于南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量許可證號(hào):蘇 SCKX2008-0010。喂養(yǎng)環(huán)境維持12h光/暗周期并保持恒定溫度23±2°C，使其自由飲食飲水。 本研究所有程序均依照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)原則進(jìn)行。
[0104] 試藥：四氧嘧啶（Sigma-alorich公司，批號(hào):BCBH2116V);二甲雙胍(京豐制藥有限 公司，批號(hào)：120915);消渴丸(廣州白云山中一藥業(yè)有限公司，批號(hào):R01252);知母(產(chǎn)地河 北，購(gòu)于中國(guó)中藥材配送網(wǎng)，經(jīng)本人鑒定為百合科植物知母Anemarrhena asphodel〇ides Bge.的干燥根莖）；羧甲基纖維素鈉鹽300-800(中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司，批號(hào)： 30036361) 〇
[0105] 儀器:BSA124S型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；Ep〇ch型酶標(biāo)儀(Biotek 公司）；80-2型電動(dòng)離心機(jī)（江蘇金壇市金城國(guó)圣實(shí)驗(yàn)儀器廠）；移液器(Dragon Medical Limited)等。
[0106] 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果：
[0107] 小鼠的飼養(yǎng):將ICR小鼠飼養(yǎng)于溫度為23 ± 2 °C的動(dòng)物房中，動(dòng)物房保證每天光照 和非光照時(shí)間均為12h，小鼠可以自由飲水和攝食。
[0108] 四氧嘧啶誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠模型的制備:將ICR小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將所有 小鼠禁食(不禁水）17h，稱(chēng)量各小鼠的重量。隨機(jī)選取12只小鼠為空白組，按I OmL/kg的劑量 尾靜脈注射生理鹽水溶液，剩余小鼠按lOmL/kg尾靜脈注射新配制的6mg/mL四氧嘧啶生理 鹽水溶液。靜脈注射4.5h后，每只小鼠灌胃給予50%葡萄糖水溶液20mL/kg，防止低血糖造 成死亡。尾靜脈注射四氧嘧啶72h后，將小鼠禁食（不禁水）12h，每只小鼠眼底靜脈叢取血 0.2mL，將取好的血樣室溫下靜置lh，然后以4000r/min的速度離心10min以分離得到血清。 取IOyL血清于樣品管中按照試劑盒說(shuō)明的操作方法測(cè)定小鼠的空腹血糖值?？崭寡侵? 11. lmmol/L的小鼠視為糖尿病模型小鼠，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0109]糖尿病模型小鼠的分組:為了使各組模型小鼠血糖值接近，將血糖值小于16mmol/ L或大于36mmol/L的小鼠剔除，然后將剩余的90只模型小鼠根據(jù)血糖值進(jìn)行調(diào)整，分為9組 (模型組，消渴丸組，二甲雙胍組，知母藥材低劑量組、知母藥材中劑量組和知母藥材高劑量 組，知母皂苷N低劑量組、知母皂苷N中劑量組和知母皂苷N高劑量組），每組10只。分組后，除 空白組外各組小鼠血糖均值接近，均在30mmol/L左右。
[0110]給藥： 知母藥材的給藥劑量:低劑量組5g/kg、中劑量組10g/kg、高劑量組20g/kg。
[0112] 知母皂苷N的給藥劑量:低劑量組13mg/kg、中劑量組26mg/kg、高劑量組52mg/kg。
[0113] 消渴丸的給藥劑量:消渴丸說(shuō)明書(shū)規(guī)定，其成人一般每日最大給藥量為7.5g。按照 體表面積法換算，則小鼠給藥劑量為:7 · 5g + 60kg X 9 · 01 = 1 · 126g/kg。本實(shí)驗(yàn)按1 · 2g/kg給 藥。
[0114] 鹽酸二甲雙胍的給藥劑量:鹽酸二甲雙胍片說(shuō)明書(shū)規(guī)定，成人一般每日最大給藥 量為1 · 5g。按照體表面積法換算，則小鼠給藥劑量為：1 · 5g + 60kg X 9 · 01 = 0 · 225g/kg。本實(shí) 驗(yàn)按0.23g/kg給藥。
[0115] 藥液的配制
[0116] 知母藥材藥液的配制:小鼠給藥體積為20mL/kg，則知母藥材高劑量組的藥液濃度 為20g生藥/kg + 20mL/kg=lg生藥/mL;知母藥材中劑量組的藥液濃度配制為0.5g生藥/mL; 知母藥材低劑量組的藥液濃度配制為0.25g生藥/mL。
[0117] 知母皂苷N藥液的配制:小鼠給藥體積為20mL/kg，則知母皂苷N高劑量組的藥液濃 度為5811^知母阜苷1'1/1^ + 2〇111171^ = 2.911^知母阜苷1'1/1111^(相當(dāng)于]^生藥/1111^);知母藥材中 劑量組的藥液濃度為1.45mg知母皂苷N/mL(相當(dāng)于0.5g生藥/mL);知母藥材低劑量組的藥 液濃度為〇. 725mg知母皂苷N/mL(相當(dāng)于0.25g生藥/mL)。
[0118] 消渴丸藥液的配制:小鼠給藥體積為20mL/kg，則消渴丸水溶液濃度為：1.2g/kg + 20mL/kg = 60mg/mL。稱(chēng)取研為細(xì)粉的消渴丸6g，加0.4 % CMC-Na溶液研磨，定容至I OOmL，得 至Ij 6 Omg/mL消渴丸混懸液。
[0119] 鹽酸二甲雙胍藥液的配制:小鼠給藥體積為20mL/kg，則鹽酸二甲雙胍片水溶液濃 度為：0.238/1^ + 2〇11^/1^ = 11.511^/1]11^，按1211^/1]11^配制。稱(chēng)取研為細(xì)粉的鹽酸二甲雙胍片 1.2g，加0.4 % CMC-Na溶液研磨，定容至IOOmL，得到12mg/mL鹽酸二甲雙胍混懸液。
[0120] 灌胃給藥:各給藥組按20mL/kg的劑量灌胃給予配制好的藥液，空白組和模型組給 予20mL/kg的CMC-Na溶液。每3天稱(chēng)量一次小鼠體重，并根據(jù)體重的變化調(diào)整給藥劑量，連續(xù) 給藥7天。
[0121] 各種實(shí)驗(yàn)樣品液對(duì)糖尿病小鼠血糖值的影響測(cè)定結(jié)果:血糖的變化能夠直接反映 出藥物的降血糖作用，本實(shí)驗(yàn)在末次給藥前小鼠禁食9h，給藥繼續(xù)禁食3h，然后眼底取血測(cè) 定了小鼠的血糖值，結(jié)果見(jiàn)表7。
[0122] 表7各種樣品及陽(yáng)性對(duì)照藥對(duì)糖尿病小鼠血糖值的影響(mean 土 sd，n = 10)

[0125] 注:與·空白組比較，#P〈0 · 05，##P〈0 · 01;與模型組比較，*P〈0 · 05，#P〈0 · 01。
[0126] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，四氧嘧啶造模后，小鼠血糖值顯著性高于空白組(P〈0.01)，說(shuō)明模 型制備成功。知母藥材、知母皂苷N、消渴丸和二甲雙胍均顯著性降低模型小鼠的血糖值。知 母皂苷N的劑量為58mg/kg，按知母皂苷N的得率(0.29 %)計(jì)算在與知母藥材相同生藥劑量 的情況下，知母皂苷N的降糖效果與藥材相當(dāng)，顯示知母皂苷N的降糖作用顯著。
[0127] 結(jié)論
[0128] 由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，知母皂苷N具有體內(nèi)、外降糖的確切活性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 知母皂苷N在制備防治糖尿病藥物中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物為能夠提高高糖損傷細(xì)胞的細(xì) 胞活力和NO分泌量的藥物。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物為能夠提高機(jī)體胰島素的分泌 能力的藥物。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物為能夠提高機(jī)體葡萄糖消耗量， 改善胰島素抵抗作用的藥物。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物為能夠抑制α_葡萄糖苷酶的活 性的藥物。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物包括知母皂苷Ν和藥學(xué)上可接受 的載體或者常規(guī)食用輔料。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物的劑型為口服劑型。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及知母皂苷N在制備防治糖尿病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)該化合物在體內(nèi)外表現(xiàn)出了很好的抗糖尿病活性，有可能成為未來(lái)治療糖尿病的有效藥物。
【IPC分類(lèi)】A61P3/10, A61K31/7048, A61P5/48
【公開(kāi)號(hào)】CN105560261
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201511029564
【發(fā)明人】楊小林, 吳皓
【申請(qǐng)人】南京中醫(yī)藥大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年5月11日
【申請(qǐng)日】2015年12月31日