專利名稱：紫杉酚衍生物、它們的藥物組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及紫杉酚衍生物，它與紫杉酚相比，其水溶性改善且表現(xiàn)出優(yōu)良抗腫瘤活性。該化合物對(duì)于治療一些癌癥尤為有效，這些癌是和紫杉酚對(duì)其已顯示出活性癌相同，包括人體肺癌、黑素瘤、白血病、乳房腫瘤及結(jié)腸癌。
紫杉酚是一種已知的雙萜類、倍半萜烯，它是從西部紫杉屬樹(Taxus brevsifolia)的莖皮中分離出來(lái)的，它具有下列結(jié)構(gòu)式
紫杉酚對(duì)多種腫瘤都顯示出具有強(qiáng)大的抗腫瘤活性。但是，該化合物只能極微溶于水，這在生產(chǎn)適用于人體治療的藥物配方中產(chǎn)生了明顯的問(wèn)題。最初用帶乳油的EL
(cremophore
)作為藥物載體來(lái)生產(chǎn)注射用的紫杉酚配方或靜脈注射的紫杉酚配方以克服紫杉酚水溶性差的問(wèn)題。但是，乳油本身有些毒性，它本身能引起特異性組胺釋放并引起過(guò)敏性樣的反應(yīng)，所以使用該載體對(duì)于生產(chǎn)紫杉酚的良好配方并不是一個(gè)理想的對(duì)該問(wèn)題的解決方法。
因此，本發(fā)明者研究了紫杉酚衍生物的生產(chǎn)，它應(yīng)當(dāng)比紫杉酚有更大水溶性并且也顯示出與紫杉酚相同或相似的優(yōu)良抗腫瘤和細(xì)胞毒性的活力。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是開發(fā)出紫杉酚衍生物，它們具有良好的抗腫瘤活性及水溶性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是開發(fā)出紫杉酚衍生物的配方，它們采用無(wú)毒的載體，因而避免了使用諸如乳油的毒性載體。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是開發(fā)出紫杉酚衍生物，它們具有對(duì)于制備藥物配方合適pH水平(pH3-4)的的良好穩(wěn)定性，但在體內(nèi)的生理的pH(pH7.4)下迅速裂解，它們是潛在地作為紫杉酚的前體藥物。
通過(guò)開發(fā)出具有良好抗腫瘤活性和良好水溶性的紫杉酚的衍生物來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的這些和其它目的。
一般地說(shuō)，本發(fā)明的新穎紫杉酚衍生物由下式表示，它是紫杉酚2′和/或7-位酯
其中R和R′各自是H或是選自由丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、賴氨酸和精氨酸所組成組的氨基酸的殘基或是下式的基團(tuán)
其中n是1-3整數(shù)，R2和R3各自是氫或有1-3個(gè)碳原子的烷基，或者R2和R3與氮原子連接在一起形成一個(gè)有4-5個(gè)碳原子的飽和雜環(huán)，條件是R和R′中至少一個(gè)不是氫。
在上式(Ⅲ)中，當(dāng)R2和/或R3不是氫時(shí)，這些化合物可被認(rèn)為、且下面有時(shí)稱為“烷基化的氨基酸”。因此，式(Ⅰ)的化合物可廣泛地被認(rèn)為是帶有氨基酸或烷基化氨基酸的紫杉酚的2′和/或7-位的酯。
本發(fā)明因而包括(a)紫杉酚2′-羥基處酯化的衍生物，(b)紫杉酚的7-羥基處酯化的衍生物，以及(c)在2′-和7-位羥基處都酯化的衍生物。
在上述式(Ⅰ)中包含的化合物中，下列特定化合物被認(rèn)為是本發(fā)明的優(yōu)選化合物。
1.2′(N，N-二乙基氨基丙酰)紫杉酚2.2′(N，N-二甲基氨基乙酰)紫杉酚3.7(N，N-二甲基氨基乙酰)紫杉酚4.2′7-二-(二甲基氨基乙酰)紫杉酚5.7(N，N-二乙基氨基丙酰)紫杉酚6.2′7-二-(N，N-二乙基氨基丙酰)紫杉酚7.2′(L-氨基乙酰)紫杉酚8.7-(L-氨基乙酰)紫杉酚9.2′，7-二(L-氨基乙酰)紫杉酚10.2′-(L-丙氨酰)紫杉酚11.7-(L-丙氨酰)紫杉酚12.2′，7-二(L-丙氨酰)紫杉酚13.2′(L-亮氨酰)紫杉酚14.7-(L-亮氨酰)紫杉酚
15.2′，7-二(L-亮氨酰)紫杉酚16.2′-(L-異亮氨酰)紫杉酚17.7-(L-異亮氨酰)紫杉酚18.2′，7-二(L-異亮氨酰)紫杉酚19.2′-(L-纈氨酰)紫杉酚20.7-(L-纈氨酰)紫杉酚21.2′，7-二(L-纈氨酰)紫杉酚22.2′(L-苯丙氨酰)紫杉酚23.7-(L-苯丙氨酰)紫杉酚24.2′，7-二(L-苯丙氨酰)紫杉酚25.2′-(L-脯氨酰)紫杉酚26.7-(L-脯氨酰)紫杉酚27.2′，7-二(L-脯氨酰)紫杉酚28.2′-(L-賴氨酰)紫杉酚29.7-(L-賴氨酰)紫杉酚30.2′，7-二(L-賴氨酰)紫杉酚31.2′-(L-谷氨酰)紫杉酚32.7-(L-谷氨酰)紫杉酚33.2′，7-二(L-谷氨酰)紫杉酚34.2′-(L-精氨酰)紫杉酚35.7-(L-精氨酰)紫杉酚36.2′，7-二(L-精氨酰)紫杉酚本發(fā)明者業(yè)已發(fā)現(xiàn)紫杉酚的2′-和7-位羥基的化學(xué)活性特征，特別是2′-羥基比7-羥基的化學(xué)活性更大。該發(fā)現(xiàn)已被用在制備過(guò)程中給衍生物的定位。
A.2′-酯衍生物的制備根據(jù)衍生物為帶有氨基酸或帶有烷基化的氨基酸，用兩種中的一種來(lái)制備2′-酯的衍生物。
為了制備烷基化氨基酸的酯，可采用如下的反應(yīng)式反應(yīng)式Ⅰ烷基化的氨基酸+紫杉酚→2′-酯紫杉酚衍生物
其中n、R2和R3的定義同上。
為了制備氨基酸的酯，采用如下反應(yīng)式反應(yīng)式Ⅱ
在上述的兩個(gè)反應(yīng)式中(反應(yīng)式Ⅰ和反應(yīng)式Ⅱ)，在縮合試劑存在下且有或無(wú)加入催化劑時(shí)，較好地在室溫下使烷基化的或保護(hù)的氨基酸進(jìn)行縮合反應(yīng)。
合適的縮合試劑包括碳二亞胺類，諸如二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)。
合適的催化劑包括4-二甲基氨基吡啶(PMAP)和吡啶。
在反應(yīng)式(Ⅱ)中，可采用種種已知的氨基保護(hù)基團(tuán)，市售的保護(hù)氨基酸可用作起始物料?？刹捎糜胻-BOC、FMOC或芐氧羰基(CBZ)保護(hù)的氨基酸。用t-BOC或FMOC基團(tuán)保護(hù)的氨基酸較為優(yōu)選。雖然用甲酸水溶液和其它有機(jī)酸可使在2′-酯上的t-BOC基團(tuán)去保護(hù)可引起產(chǎn)物降解及立體化學(xué)的改變，但是使用99%甲酸可得到較好的結(jié)果。在FMOC保護(hù)的氨基酸酯條件下其產(chǎn)品回收率視反應(yīng)條件而定。因此，在最后的去保護(hù)步驟中，除去t-BOC保護(hù)基團(tuán)的條件下可能使紫杉酚分子7-位游離的羥基產(chǎn)生不希望的改變。這些不希望的改變是由分子的立體化學(xué)的改變所構(gòu)成的。
作為舉例，N-保護(hù)的丙氨酸化合物可如下所代表
如上面所提出的那樣，發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)紫杉酚的2′羥基比7-羥基的化學(xué)活性大。因此，在上面的反應(yīng)式Ⅰ和Ⅱ中，使烷基化的或N-保護(hù)的氨基酸與紫杉酚以1∶1的摩爾比或稍大于1∶1摩爾比進(jìn)行反應(yīng)，其取代或酯化直接發(fā)生在2′-位上。雖然在這類等摩爾量反應(yīng)中少量的紫杉酚7-酯衍生物可能作為副產(chǎn)物而產(chǎn)生，但大量2′-酯紫杉酚衍生物可以得到。
B 7-位酯的制備反應(yīng)式Ⅲ既然紫杉酚的2-′羥基比7-位羥基的反應(yīng)活性大，所以該酯化反應(yīng)要使用與制備2′-衍生物方法不同的方法。因此，為了制備7-位酯，采用一種方法從而使2′-羥基首先被保護(hù)或封閉，然后使7-位羥基酯化，接著再除去2′-保護(hù)基團(tuán)或封閉基團(tuán)。
種種封閉基團(tuán)，如現(xiàn)有技術(shù)已知的封閉基團(tuán)可用來(lái)使紫杉酚的2-位封閉。作為一個(gè)例子使用一種封閉基團(tuán)的例子和一種烷基化氨基酸，反應(yīng)式(Ⅲ)也可如下所概括
在上述反應(yīng)式中，在縮合試劑和催化劑存在下使2′-troc-紫杉酚和烷基化氨基酸進(jìn)行縮合反應(yīng)。合適的縮合試劑和催化劑與上述反應(yīng)式Ⅰ和Ⅱ討論的相同。
例如，通過(guò)用鋅和乙酸混合物使2′-(troc)紫杉酚進(jìn)行去保護(hù)。
反應(yīng)式Ⅳ作為替換方法，通過(guò)一種方法也可制備7-取代的紫杉酚衍生物，其中首先使紫杉酚與2-3當(dāng)量N-封閉的氨基酸反應(yīng)生成了2′，7-二取代紫杉酚、使2′-和7-位氨基酸都去保護(hù)，然后使2′-位氨基酸裂解。該方法如下所示，用t-BOC保護(hù)的丙氨酰作為封閉氨基酸的實(shí)例。
在該方法中，與反應(yīng)式Ⅲ相似，在縮合試劑和催化劑存在下使紫杉酚與保護(hù)的氨基酸進(jìn)行反應(yīng)。用已知的氨基酸去保護(hù)方法，諸如用例如甲酸的溫和酸處理使氨基酸進(jìn)行去保護(hù)。
通過(guò)將2′，7-二(氨基酸)紫杉酚溶液調(diào)至pH7-7.4，例如將2′，7-二(氨基酸)紫杉酚放在磷酸緩沖液中使混合物pH為7-7.4使2′-氨基酸進(jìn)行裂解。用該方法調(diào)節(jié)pH來(lái)裂解2′-氨基酸以產(chǎn)生所需的7-(氨基酸)紫杉酚。
這樣，例如讓紫杉酚與在二氯甲烷中的2-3摩爾當(dāng)量N-保護(hù)的氨基酸(t-boc、CBZ或FMOC保護(hù))在DCC和催化量的4-二甲基氨基吡啶存在下進(jìn)行反應(yīng)。在該方法中，保護(hù)的氨基酸被引入至2′和7-位上。用合適的去保護(hù)劑(例如，酸、溫和的堿或氫解劑)來(lái)除去保護(hù)基團(tuán)。讓2′，7-二氨基酸紫杉酚衍生物在中性pH的磷酸緩沖液中靜置24-48小時(shí)，從而在2′-位發(fā)生選擇性的去保護(hù)而得到7-取代的紫杉酚衍生物。
也可以使用相似的反應(yīng)式以生成7-取代的帶有烷基化氨基酸的紫杉酚衍生物。除了用所需的烷基化氨基酸來(lái)代替N-保護(hù)的氨基酸及取消去保護(hù)步驟，這類反應(yīng)與上述的相似。該反應(yīng)式如下所示反應(yīng)式Ⅴ
C，2′，7-二取代紫杉酚衍生物的制備通過(guò)采用上述方法，或部分采用上述方法來(lái)制備二取代的衍生物。這些方法如下所示反應(yīng)式Ⅵ用烷基化的氨基酸取代紫杉酚+烷基化的氨基酸-→2′，7-(二取代烷基化氨基酸)(2-3當(dāng)量) 紫杉酚反應(yīng)式Ⅶ用氨基酸取代
除了用2當(dāng)量烷基化的氨基酸進(jìn)行反應(yīng)外反應(yīng)式Ⅵ基本上與上述反應(yīng)式Ⅰ相同。另外，雖然反應(yīng)式Ⅰ可在催化劑的存在下或無(wú)催化劑時(shí)進(jìn)行，由于7-位羥基紫杉酚的化學(xué)活性降低所以反應(yīng)式Ⅵ方法需有催化劑存在。
反應(yīng)式Ⅶ基本上與上述反應(yīng)式Ⅱ的相同，但是，上面已提到在反應(yīng)式Ⅱ中FMOC是優(yōu)選的保護(hù)基團(tuán)以避免在去保護(hù)步驟中7-位上發(fā)生立體結(jié)構(gòu)的改變。但是，在反應(yīng)式Ⅶ中不會(huì)發(fā)生此問(wèn)題，由于7-位羥基不是游離的。因此，可使用各種已知的保護(hù)基團(tuán)，包括t-BOC和FMOC。
可以相信熟悉該領(lǐng)域的人員用上述方法可制備本發(fā)明范圍內(nèi)的所有化合物。但是，下面參照優(yōu)選的特定實(shí)施例對(duì)制備方法進(jìn)行闡述。
實(shí)施例Ⅰ-2′-(N，N-二甲基甘氨酰)紫杉酚或其鹽
(a)化合物1-2′-(N，N-二甲基甘氨酰)紫杉酚將1，3-二環(huán)己基碳二亞胺(0.15克、0.72毫摩爾)和4-二甲基氨基吡啶(0.025克，0.2毫摩爾)加至紫杉酚(0.21克，0.246毫摩爾)和N，N-二甲基甘氨酸(0.0254克，0.246毫摩爾)的無(wú)水二氯甲烷(12毫升)溶液中。在無(wú)水條件下將反應(yīng)混合物攪拌1天。再加入50毫克DCC并再繼續(xù)攪拌六小時(shí)。過(guò)濾反應(yīng)混合物，在氮?dú)庀抡舭l(fā)濾液。將殘留物在硅烷化的硅膠(35克，26厘米)上進(jìn)行色譜層析并依次用1∶1乙酸乙酯∶石油醚和乙酸乙酯洗脫。慢慢蒸發(fā)乙酸乙酯∶石油醚流份，濾得一種固體。母液再經(jīng)濃縮并加入石油醚直至出現(xiàn)混濁，任其放置以得到更多的化合物?？偟幕厥帐?.14克(61%)。熔點(diǎn)168-171℃(分解)。在化合物2的NMR核磁共振譜(300MHzCDCl3)中，2′質(zhì)子共振從紫杉酚的4.71ppm移至5.59ppm。這表明2′-位發(fā)生了酯化。光譜其它共振與提出的結(jié)構(gòu)是一致的。HPLC純度為98-99.5%。
質(zhì)譜(FAB)m/l939(M+H)+，元素分析C51M58N2O15的計(jì)算值C，65.36，H，6.22，N，2.98測(cè)定值C，65.16，H，6.28，N，313%(b)化合物2-2′-(N，N-二甲基甘氨酰)紫杉酚的甲磺酸鹽將2′-(N，N-二甲基甘氨酰)紫杉酚(0.06克，0.064毫摩爾)溶于叔丁醇(2毫升)和水(15毫升)中。讓混合物冷至-5℃，滴加入甲磺酸(3.1毫升，2毫克/毫升，0.0645毫摩爾)，讓混合物在0-5℃下攪拌1分鐘并通過(guò)20μm濾膜(微孔濾膜)過(guò)濾到一只燒并中該燒并用干冰-異丙醇混合物中快速冷卻。凍干溶液得到0.058克產(chǎn)物(88%)，熔點(diǎn)170-173℃，元素分析C52H68N2SO18·2H2OC H N計(jì)算值 57.83 6.27 2.6測(cè)定值 57.49 6.06 2.73物理性質(zhì)摩爾重量 1035熔點(diǎn) 170-173(分解)溶解度 15mg/ml(稍有模糊)2mg/ml(澄清)化學(xué)穩(wěn)定性研究根據(jù)下列方法對(duì)該化合物進(jìn)行穩(wěn)定性研究。
在25℃和37℃下研究衍生物在各種pH值下的穩(wěn)定性。在37℃下在鼠血漿和人體血漿中進(jìn)行血漿中的降解研究。人體血漿從Watkins醫(yī)院得到，鼠血漿從堪薩斯(Kansas)大學(xué)動(dòng)物培養(yǎng)單位得到。所用的衍生物濃度約為20-25μg/ml，將化合物的貯備溶液制成0.8-1.0mg/ml并使之加入血漿得到所需的濃度(20-25μg/ml)。取出100微升樣品，用250微升乙腈驟冷并離心沉淀出血漿蛋白用HPLC測(cè)繪相對(duì)時(shí)間的峰面積來(lái)研究降解動(dòng)力學(xué)。計(jì)算出t90和t50。通過(guò)高效液相色譜用RP-8柱(15cm)和預(yù)柱(5cm)來(lái)進(jìn)行化學(xué)和血漿中降解研究。在227nm處進(jìn)行檢測(cè)。流動(dòng)相由0.02M乙酸酯(pH5)∶乙腈50∶50或35∶65組成，流動(dòng)速率范圍為1-1.5毫米/分鐘，或相同的溶劑中含有0.001M四丁基硫酸氫銨，其流動(dòng)速率為1毫升/分鐘。
在穩(wěn)定性研究中，該化合物的峰消失，而得到保留時(shí)間與紫杉酚峰的保留時(shí)間相等的峰。通過(guò)新的衍生物降解研究來(lái)進(jìn)一步證實(shí)上面峰的一致性。因此，將2′(DMG)紫杉酚與水放在37℃下保溫，將產(chǎn)物濃縮并用制備型薄層層析純化。純化后的產(chǎn)物用HPLC和光譜學(xué)方法分析。產(chǎn)物顯示的摩爾離子峰在m/e860(N+Li)+處，它表示產(chǎn)物是紫杉酚。
HPLCI工作條件柱 RP-8，150mm長(zhǎng)，4.6mm內(nèi)徑流動(dòng)相50∶50 0.02M乙酚酯(pH5)乙腈檢測(cè)器 Kratos Spectroflow 757流動(dòng)速率 1m L/min保留時(shí)間 11.2mL化合物25.5mL紫杉酚化學(xué)穩(wěn)定性結(jié)果條件 t1/2(小時(shí))
0.02M乙酸酯(0.1mg/mL)(pH3.5，25℃)96.2(pH4.5，25℃)55.4水(2mg/mL)(pH3.8，37℃)89.8血漿穩(wěn)定性，37℃條件 t1/2(分鐘)鼠血漿(20ug/m L) 3.05狗血漿(20ug/m L) 121.6人血漿(20ug/m L) 198.6實(shí)施例Ⅱ-2′(N，N-二乙氨基丙酰)紫杉酚
(a)化合物3-2′-[3-(N，N-二乙氨基)丙酰]紫杉酚的鹽酸鹽將1，3-二環(huán)己基碳二亞胺(0.08克，0.38毫摩爾)和4-二甲氨基吡啶(0.01克，0.081毫摩爾)加至含有N，N-二乙氨基丙酸氫氯化物(0.025，克0.145毫摩爾)的紫杉酚(0.12克，0.14毫摩爾)的CHCl(12毫升)溶液中。在室溫下將所得的混合物攪拌24小時(shí)。過(guò)濾反應(yīng)混合物，在氮?dú)庀抡舭l(fā)濾液。粗材料在硅烷化的硅膠(18克22厘米)柱上進(jìn)行色譜層析，依次用1∶2乙酸乙酯∶石油醚、1∶1乙酸乙酯∶石油醚和乙酸乙酯洗脫。慢慢蒸發(fā)乙酸乙酯∶石油醚組份形成一種固體沉淀再經(jīng)過(guò)濾。合并含有產(chǎn)物的母液，濃縮并加入石油醚至混濁并經(jīng)放置。過(guò)濾產(chǎn)物得到0.068克產(chǎn)物(48%)。熔點(diǎn)188-191℃，質(zhì)譜(FAB)m/e981[M+H]+。NMR(300Hz，CDCl3)表示2′質(zhì)子的共振從紫杉酚的4.71ppm移至5.53ppm。N-乙基基團(tuán)中的甲基共振為1.0ppm，CH共振為2.52ppm?？梢杂^察到預(yù)想化合物的所有其它共振特征。C54H65CIN2O15的元素分析(%)C H N計(jì)算值63.73 6.43 2.75測(cè)定值64.84 6.84 2.89物理性質(zhì)(化合物3)分子量 1017.56熔點(diǎn) 186-189℃(分解)溶解度 -0.8mg/ml條件柱 RP-8，150mm長(zhǎng)，4.6mm內(nèi)徑流動(dòng)相 35∶65 0.02M乙酸酯(pH5)002乙腈檢測(cè)器Kratos Spectroflow 757流動(dòng)速率 1.5ml/min保留體積 16.71ml(化合物3)
化學(xué)穩(wěn)定性條件 t1/2(小時(shí))0.02M乙酸酯(0.01mg.mlpH3.5，25℃) 438.60.02M磷酸鹽(0.02mg/mlpH7.4，25℃) 0.25血漿穩(wěn)定性，37℃條件 t1/2(分鐘)人體血漿 4.2(b)化合物4-2′(N，N-二乙氨基丙酰)紫杉酚的甲磺酸鹽為了制備N，N-二乙氨基丙酸的甲磺酸鹽，將10克QAE-交聯(lián)葡聚糖(pharmacia公司)用0.1MNa Cl濕潤(rùn)75小時(shí)，將該物質(zhì)的75%倒入柱內(nèi)。用蒸餾水(700毫升)洗滌柱。柱用500毫升CH3SO3Na(從0.5M甲磺酸和0.5M氫氧化鈉并滴定至pH6制備)平衡。收集洗脫液至Cl-完全消失，通過(guò)加入幾滴1%。硝酸銀及幾滴硝酸至收集的流出液中來(lái)檢查Cl-。再用蒸餾水將柱洗至中性。
將2.5克N，N-二乙氨基丙酸鹽酸鹽在15毫升中的水倒在柱上并用水洗脫。收集四份50毫升的流份。開始流出的少量流份含有產(chǎn)物。合并這些流份并除去溶劑。將殘留物溶于二氯甲烷-乙醇混合物中并用硫酸鎂干燥，除去溶劑得到3.1克產(chǎn)物。使其從乙醇和醚中沉淀出來(lái)得到2.6克N，N-二乙氨基丙酸的甲磺酸鹽。
將1，3-二環(huán)己基碳二亞胺(0.061克，0.3毫摩爾)加至紫杉酚(0.05克，0.058毫摩爾)和N，N-二乙氨丙酸甲磺酸鹽(0.014克，0.058毫摩爾)的二氯甲烷溶液中。在室溫下使混合物攪拌24小時(shí)。過(guò)濾反應(yīng)混合物，在氮?dú)庀抡舭l(fā)濾液。殘留物在硅烷化的硅柱上進(jìn)行包譜層析，用1∶1乙酸乙酯∶石油醚和乙酸乙酯洗脫。慢慢蒸發(fā)乙酸乙酯∶石油醚流份，得到0.048克產(chǎn)物(74%)熔點(diǎn)170-174℃。
物理性質(zhì)分子量 1077.12熔點(diǎn) 170-74溶解度 ＞10mg/ml純度 ＞99%化學(xué)穩(wěn)定性條件 t1/2(小時(shí))0.02M乙酸鹽(pH4.5，25℃) 3050.02M乙酸鹽(pH5.5，25℃) 20.7實(shí)施例Ⅲ-7-(N，N-二甲基甘氨酰)紫杉酚或其鹽的制備
(a)2′-(troc)紫杉酚(化合物5)將紫杉酚(0.27克，0.316毫摩爾)溶于CH2Cl2(10毫升)和吡啶(1.5毫升)中。讓反應(yīng)混合物冷卻至-20-(-25)℃并加入2，2，2-三氯乙基氯甲酸酯(80微升)。將反應(yīng)混合物在該混度下攪拌三小時(shí)。再加入25微升氯甲酸酯，讓反應(yīng)混合物攪拌過(guò)夜。反應(yīng)混合物用CH2Cl2(50毫升)稀釋并依次用0.1N HCl(25毫升×2)和0.05M冷Na HCO3(25毫升×1)和水洗滌，用無(wú)水Mg SO4干燥有機(jī)萃取物，除去溶劑。粗材料通過(guò)制備型硅烷化過(guò)的硅膠板上，在1∶3乙酸乙酯∶石油醚展開的薄板層析純化，切下紫杉酚以上的區(qū)帶并用乙酸乙酯洗脫，除去溶劑得到0.32克(97%)，熔點(diǎn)221-226℃(分解，軟化點(diǎn)160℃)(b)2′-(troc)-7-(N，N-二甲基甘氨酰)紫杉酚(化合物6)將2′-(troc)紫杉酚(0.27克，0.62毫摩爾)和(N，N-二甲基甘氨酸(0.054克，0.524毫摩爾)的混合物溶于CH2Cl2(15毫升)中，向該溶液中加入1，3-二環(huán)己基碳化二亞胺(0.215克，1.04毫摩爾)和4-二甲氨基吡啶(0.025克，0.2毫摩爾)，讓混合物在室溫下攪拌兩天。過(guò)濾反應(yīng)混合物并除去溶劑。粗物質(zhì)通過(guò)預(yù)制的硅烷化過(guò)的硅膠板在1∶1乙酸乙酯∶石油醚中展開的TLC純化。切下紫杉酚以下的區(qū)帶(Rf0.47，1∶1乙酸乙酯∶石油醚)并用乙酸乙酯洗脫，除去溶劑得到0.26克產(chǎn)物(89%)。熔點(diǎn)176-180℃(分解)。
元素分析C54H60Cl3N2O17的計(jì)算值C，58.12，H，5.42，N，2.51;
測(cè)定值C，58.68，H6.00，N，3.18%(c)7-(N，N-二甲基甘氨酰)紫杉酚(化合物7)將鋅粉(0.275克)加入到2′-(troc)-7-(N，N-二甲基甘氨酰)紫杉酚(0.335克，0.3毫摩爾)的9∶1甲醇-乙酸(12毫升)溶液，將混合物在室溫下攪拌25分鐘并過(guò)濾。將濾液濃縮至-1毫升并用CH2Cl2(35毫升)稀釋，依次用0.01MHCl(20毫升×2)、0.01M冷Na HCO3和水洗滌。用無(wú)水Na2SO4干燥有機(jī)萃取液并除去溶劑得到0.24克產(chǎn)物。該化合物通過(guò)制備型的硅烷化的硅膠板(20×20，第3號(hào))及用7∶1CH2Cl2∶乙酸乙酯展開的TLC來(lái)純化。切下相應(yīng)的7-(DMG)紫杉酚(Rf0.35)區(qū)帶，用乙酸乙酯和乙醇洗脫，除去溶劑得到0.19克產(chǎn)物(68%)。熔點(diǎn)180-185℃(分解，軟化點(diǎn)約140℃)。質(zhì)譜(FAB)m/l939[M+H]+。在NMR光譜中(300Hz，CDCl3)，在紫杉酚中的7-H共振為4.33ppm，此時(shí)為5.65ppm處的雙重線。N-(CH3)2的共振為2.35處的單峰。甘氨酸酯的亞甲基在3.16ppm處發(fā)現(xiàn)。
(d)7-(二甲基甘氨酰)紫杉酚的甲磺酸鹽(化合物8)將7-(二甲基甘氨酰)紫杉酚(0.065克，0.069毫摩爾)溶于叔丁醇(25毫升)和水(1毫升)中。讓溶液冷至5-10℃并加入甲磺酸(3.36毫升，2mg/ml，0.0697毫摩爾)。讓混合物攪拌兩分鐘并通過(guò)微孔濾膜濾一只燒瓶燒揩中該燒瓶用冰使其快速冷卻。讓濾液凍干得到0.066克產(chǎn)物(94%)。熔點(diǎn)(64-168℃)(分解)。
元素分析C52H62N2O18S·2H2O的C H N計(jì)算值58.29 6.19 2.6測(cè)定值58.05 6.00 1.72
物理性質(zhì)分子量 1035熔點(diǎn) 164-168℃溶解度 ＞2mg/mlHPLC條件柱 RP-8mm長(zhǎng)4.6mm內(nèi)徑流動(dòng)相 0.02M乙酸鹽(pH5)乙腈35∶65檢測(cè)器 Kratros Spectroflow757流動(dòng)速率 1.5ml/min保留體積15.07ml(化合物8)化學(xué)穩(wěn)定性條件 t1/2(小時(shí))0.02M乙酸鹽(pH3.5，25℃) 33970.02M乙酸鹽(pH4.5，25℃) 17190.02M磷酸鹽pH7.4(25℃) 33.8小時(shí)血漿穩(wěn)定性，37℃條件 t1/2(小時(shí))鼠血漿(20ug/ml) 17.3人血漿(20ug/ml) 27.7人血漿(10ug/ml) 24.4實(shí)施例Ⅳ-2′7-(二甲基甘氨酰)紫杉酚的制備
將紫杉酚(0.06克，0.0702毫摩爾)溶于無(wú)水二氯甲烷(5毫升)中，向內(nèi)加入N，N-二甲基甘氨酸(0.015克，0.145毫摩爾)。向該混合物中加入1，3-二環(huán)己基碳二亞胺(0.08克，0.388毫摩爾)和4-二甲氨基吡啶(0.008克，0.065毫摩爾)。讓反應(yīng)混合物在室溫下攪拌24小時(shí)并過(guò)濾。除去濾液中的溶劑。殘留物通過(guò)制備型硅烷化過(guò)的硅膠板并在1∶1乙酸乙酯-石油醚中展開的TLC純化。割下二甲氨基吡啶上方的區(qū)帶(Rf0.17)并用乙酸乙酯和乙醇混合物洗脫，除去溶劑。殘留物用乙酸乙酯-石油醚重結(jié)晶得到0.046克產(chǎn)物(64%)。熔點(diǎn)194-198℃。
質(zhì)譜m/e1024(M+)。在NMR光譜(300MHZ，CDCl3)中C2-質(zhì)子(4.71ppm)和C7-質(zhì)子(4.33ppm)相應(yīng)地移至5.5ppm和5.6ppm，這表明2′和7-位已酯化。N-CH3質(zhì)子是在2.3ppm處的單峰。
元素分析C55H66N3O16計(jì)算值C63.39，H6.48，N，4.03，測(cè)定值C63.00，H，6.98，N，3.982′，7-(N，N-二甲基甘氨酰)紫杉酚的二甲磺酸鹽的合成。
將2，7-(二甲基甘氨酰)紫杉酚(60毫克，0.0585毫摩爾)的叔丁醇(2毫升)和水(1毫升)的溶液冷至0-5℃，加入甲磺酸(11.37毫克，3.79毫升，0.117毫摩爾)。讓混合物在0-5℃下攪拌2分鐘，通過(guò)微孔濾膜(0.2μm)過(guò)濾，讓濾液凍干得到62毫克產(chǎn)物，熔點(diǎn)160-163℃。
物理性質(zhì)分子量 1217熔點(diǎn) 160-163℃(分解)溶解度 ＞10mg/mlHPLC純度 -96%HPLC工作條件柱 RP-8，150mm，4.6直徑流動(dòng)相 含0.005M TBA乙酸鹽(pH5)乙腈檢測(cè)器 757流動(dòng)速率 1ml/Min保留體積 6.64ml5.8ml(紫杉酚)實(shí)施例Ⅴ 7-(L-丙氨酰)紫杉酚或其鹽的制備(a)2′，7-二(t-BOC-L-丙氨酰)紫杉酚將1，3-二環(huán)己基碳二亞胺(0.25克，1.21毫摩爾)和二甲氨基吡啶(0.025克，0.20毫摩爾)加至紫杉酚(0.21克，0.246毫摩爾)和N-t-BOC-L-丙氨酸(0.14克，0.739毫摩爾)的二氯甲烷熔液中。將混合物在室溫下攪拌24小時(shí)并過(guò)濾。殘留物在硅烷化的硅膠柱(20克，14厘米)上色譜層析并用1∶1乙酸乙酯∶石油醚和乙酸乙酯洗脫，將含有二取代的衍生物的乙酸乙酯-石油流份合并，除去溶劑得到0.27克化合物(92%)。
熔點(diǎn)158-161℃(分解)(b)7-(L-丙氨酸)紫杉酚使2′，7-二-(t-BOC-L-丙氨酰)紫杉酚(0.29克，0.242毫摩爾)和甲酸(2毫升)混合并在室溫下攪拌40分鐘，在氮?dú)庀鲁ミ^(guò)量的甲酸。將殘留物溶于甲醇中并加入石油醚。濾得固體得到0.27克2′，7-二(丙氨酰)紫杉酚。
將這樣得到的二丙氨酰衍生物粗制品放入乙腈(4毫升)和磷酸緩沖液(0.02M，pH7.4，50毫升)中，使混合物在室溫下攪拌12小時(shí)。用幾毫升5%Na2HPO4使溶液的pH值升至6.8。再在室溫下使渾濁溶液攪拌8小時(shí)。用二氯甲烷(50毫升)稀釋反應(yīng)混合物，向內(nèi)加入冷NaHCO3(0.05M，50毫升)。馬上用二氯甲烷(50毫升×3)萃取反應(yīng)混合物，用水洗滌有機(jī)層一次并用無(wú)水硫酸鈉干燥。除去溶劑得到0.24克產(chǎn)物。該化合物在硅烷化過(guò)的硅膠柱進(jìn)行柱層極得到0.135克產(chǎn)物(63%)。(純度＞95%)。熔點(diǎn)，159-163℃，質(zhì)譜(FAB)m/e925[M+H]+。在NMR光譜(300MHz，CDCl3)中原紫杉酚7-H在4.33ppm處，現(xiàn)在在5.65ppm處為雙重線。丙氨酸部分的CH3基團(tuán)為1.27ppm處的雙重線。
元素分析C50H58N2O16·2.5H2O的計(jì)算值C61.91，H6.54，N，2.89，測(cè)定值C61.41，H，6.59，N，2.78%。
(c)7-(丙氨酰)紫杉酚的甲磺酸鹽將7-(丙氨酰)紫杉酚(6.2毫克，0.0658毫摩爾)的叔丁醇(2毫升)和水(1毫升)溶液冷至0-5℃并加入甲磺酸(6.39毫克，2.13毫升，3毫克/毫升)，將該混合物在該溫度下攪拌2分鐘并通過(guò)微孔濾膜(0.2μM)過(guò)濾。凍干濾液得到66毫克產(chǎn)物。熔點(diǎn)180-194℃。
物理性質(zhì)分子量 1021熔點(diǎn) 180-184℃(分解)溶解度 ＞2mg/mlHPLC工作條件柱 RP-8，150mm，4.6內(nèi)徑流動(dòng)相 含0.001M四丁基硫酸氫銨的50∶50 0.02M乙酸鹽(pH5)∶乙腈檢測(cè)器 Kratos Spectroflow 757流動(dòng)速率 1ml/Min保留體積 8.74ml7.3ml(紫杉酚)血漿穩(wěn)定性，37℃條件 t 1/2 (小時(shí))人體血漿 (20mg/ml)11.9實(shí)施例Ⅵ-2′-(丙氨酰)紫杉酚的制備(a)2′(CBZ-L-丙氨酰)紫杉酚的合成將DCC(45毫克)和4-二甲氨基吡啶(4毫克)加入到紫杉酚(30毫克，0.0036毫摩爾)和CBZ-L-丙氨酸(8.5毫克，0.036毫摩爾)的二氯甲烷(5毫升)溶液中，將混合物在室溫下攪拌3天。過(guò)濾反應(yīng)混合物，從濾液中除去溶劑。殘留物通過(guò)制備型硅烷化過(guò)的硅膠板上并在1∶1乙酸乙酯-石油醚中展開的TLC純度，切下紫杉酚以上的區(qū)帶，并用乙酸乙酯洗脫，除去溶劑得到28毫升2′-(CBZ-L-丙氨酰)紫杉酚。
(b)使2′(CBZ-L-丙氨酰)紫杉酚去保護(hù)來(lái)合成2′(丙氨酰)紫杉酚在諸如乙酸或甲酸的有機(jī)酸存在下使2′(CBP-L-丙氨酰)紫杉酚溶于乙醇，在5%在碳上的鈀存在下于室溫中攪拌2小時(shí)。過(guò)濾反應(yīng)混合物以除去催化劑并除去溶劑。將粗制品溶于乙醇中，加入石油醚以得到2′(丙氨酰)紫杉酚的甲酸鹽或乙酸鹽，其收得率為低至中等。
實(shí)施例Ⅶ-2′(賴氨酰)紫杉酚的制備(a)2′-(N-二-t-boc-賴氨酰)紫杉酚的合成將DCC(100毫克)和4-二甲氨基吡啶(10毫克)加至紫杉酚(30毫克，0.035毫摩爾)和N-二-t-boc-L-賴氨酸(19毫克，0.0368毫摩爾)在二氯甲烷(10毫升)中的混合物，將混合物在室溫下攪拌2天并過(guò)濾。從溶液中除去溶劑。殘留物通過(guò)制備型硅烷化過(guò)的硅膠板上用1∶1乙酸乙酯-石油醚的TLC純化，切下紫杉酚以上的區(qū)帶并用乙酸乙酯洗脫，除去溶劑得到20毫克產(chǎn)物。
(b)通過(guò)t-boc基團(tuán)去保護(hù)以合成2′-(賴氨酰)紫杉酚讓N-t-boc保護(hù)的紫杉酚氨基酸衍生物與甲酸(99%，Sigma)在室溫下反應(yīng)30-40分鐘。在氮?dú)庀峦ㄟ^(guò)蒸發(fā)除去過(guò)量的甲酸。通過(guò)結(jié)晶或色譜層析使粗物料純化得到N-去保護(hù)的紫杉酚氨基酸衍生物的甲酸鹽。
實(shí)施例Ⅷ-2′(L-丙氨酰)紫杉酚的制備(a)2′(FMOC-L-丙氨酰)紫杉酚的合成將DCC(60毫克)和4-二甲氨基吡啶(2毫克)加至紫杉酚(60毫克，0.072毫摩爾)和N-FMOC-L-丙氨酸(22.4毫克)二氯甲烷溶液中，將混合物在室溫下攪拌兩天并過(guò)濾。從濾液中除去溶劑。粗物料通過(guò)硅烷化過(guò)的硅膠板用1∶2乙酸乙酯-石油醚展開制備型TLC純化。切下紫杉酚以上的帶并用二氯甲烷洗脫，除去溶劑得到48毫克包含2′(FMOC-L-丙氨酰)紫杉酚的產(chǎn)物，熔點(diǎn)162-164℃(分解)。
(b)以紫杉酚的保護(hù)氨基酸衍生物中使FMa基團(tuán)去保護(hù)讓N-FMOC保護(hù)的紫杉酚氨基酸衍生物與哌啶在二氯甲烷中反應(yīng)2小時(shí)，并除去溶劑。殘留物通過(guò)色譜層析純化得到去保護(hù)的紫杉酚氨基酸衍生物。
藥物制劑本發(fā)明化合物本身可制成藥制或制成其藥學(xué)上可接受的鹽，特別是制成無(wú)毒的藥學(xué)了可接受的酸加成鹽或堿式鹽。這些鹽可根據(jù)常規(guī)的化學(xué)方法從本發(fā)明的化合物中制得。
通常地說(shuō)，通過(guò)使游離的堿或酸與化學(xué)計(jì)算量或過(guò)量的所需鹽形式的無(wú)機(jī)或有機(jī)酸在合適的溶劑或種種合并的溶劑可反應(yīng)來(lái)制得鹽。作為舉例，將游離堿溶于適當(dāng)?shù)乃崴芤褐胁⒂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)。例如，通過(guò)蒸發(fā)溶液來(lái)回收鹽?？商鎿Q的是，游離堿可溶于諸如低級(jí)鏈烷醇、醚、烷酯或其混合物，例如甲醇、乙醇、醚、乙酸乙酯、乙酸乙酯-醚溶液之類中，此后用適當(dāng)?shù)乃崽幚淼男纬上鄳?yīng)的鹽。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)回收技術(shù)，例如過(guò)濾自發(fā)地從溶液中分離出來(lái)所需的鹽，或加入鹽不溶于其中的溶劑使鹽沉淀出來(lái)并從中回收。
本發(fā)明的紫杉酚衍生物由于它們的細(xì)胞毒性、抗腫瘤活性可用來(lái)治療癌癥。新化合物以片劑、丸劑、粉末混合物、膠囊劑、注射劑、溶液劑、栓劑、乳劑、分散劑、食品預(yù)混合劑及其它合適的形式進(jìn)行使用。含有化合物的藥劑常與無(wú)毒性的藥物有機(jī)載體或無(wú)毒性的藥物無(wú)機(jī)載體相混合，每劑量單位約為0.01毫克直至2500毫克或更高，較好地是每劑量單位為50-500毫克。典型的藥學(xué)上可接受的載體是，例如甘露醇、脲素、葡聚糖、乳糖、土豆和玉米淀粉、硬脂酸鎂、滑石粉、植物油、聚(亞烷基)二醇、乙基纖維素、聚(乙烯基吡咯烷酮)、碳酸鈣、油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、苯甲酸芐酯、碳酸鈉、明膠、碳酸鉀、硅酸和其它常規(guī)使用的可接受載體。藥劑也可含有無(wú)毒性的輔助物質(zhì)諸如乳化劑、防腐劑、濕潤(rùn)劑之類，例如脫水梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸脂、聚氧乙烯單硬脂酸酯、三棕櫚酸甘油酯、二辛基硫代琥珀酸鈉等等。
制備含有活性劑片劑的典型方法是首先將活性劑與諸如明膠、阿拉伯膠、乙基纖維素等的無(wú)毒性粘合劑混合。在標(biāo)準(zhǔn)的V型混合中及通常為無(wú)水條件下可以很好地進(jìn)行混合。接著，通過(guò)常規(guī)的制片機(jī)使剛制備的混合物成漿并將漿狀物制成片劑。新制成的片劑可包衣或不必包衣。合適的包衣材料是無(wú)毒性的包衣材料包括紫膠、甲基纖維素、巴西棕櫚蠟、苯乙烯-馬來(lái)酸共聚物等。用作口服時(shí)根據(jù)上面所揭示的及公知的制備技術(shù)及Remington′s Pharmaceutical Science第39章，Mack Publishing Co.1965所列的來(lái)制造含0.01mg、5mg、25mg、50mg、500mg等直至2500mg的壓制的片劑。
為了制成片劑，將活性化合物、玉米淀粉、乳糖、磷酸二鈣和碳酸鈣在干燥條件下于常規(guī)的V-摻合器中均勻混合直至所有的組份均勻地混合在一起。接著，將玉米淀粉糊制成10%的糊并使之摻入剛制得的混合物中直至得到一均勻的混合物。然后將混合物通過(guò)一個(gè)無(wú)水大氣中干燥的標(biāo)準(zhǔn)目數(shù)的篩網(wǎng)，隨后與硬脂酸鈣相混合并壓成片劑，如果需要再進(jìn)行包衣。用相同的方法可制得含10mg、50mg、100mg、150mg等的其它片劑。
下列配方Ⅰ是包括本發(fā)明化合物片劑配方的一個(gè)實(shí)例。
配方Ⅰ組份 每個(gè)膠囊，mg活性化合物 50.0玉米淀粉 15.0玉米淀粉糊 4.5
碳酸鈣 15.0乳糖 67.0硬脂酸鈣 2.0磷酸二鈣 50.0制備含有10mg-2500mg的口服膠囊主要包括將活性化合物與無(wú)毒性載體相混合，將混合物封入聚合物的膠囊，通常是采用明膠等。膠囊劑可以是該技術(shù)領(lǐng)域中已知的軟膠囊形式，它通過(guò)將已分散在可食用的、可配伍的載體中的化合物封閉在膠囊中而制得，或者可以是硬膠囊，它必須包括將新穎的化合物與諸如，滑石粉、硬脂酸鈣、碳酸鈣之類的無(wú)毒性固體相混合，可以按如下例示的方法制備含有25mg、75mg、125mg等一種新穎化合物或兩種多種新穎化合物混合物的膠囊劑配方Ⅱ組份 每個(gè)膠囊，mg活性化合物 50.0碳酸鈣 100.0乳糖，U.S.P. 200.0淀粉 130.0硬脂酸鎂 4.5在標(biāo)準(zhǔn)混合器中將上述組份摻合在一起然后分裝入市售的膠囊中。當(dāng)使用高濃度的活性組份時(shí)，就要相應(yīng)的降低乳糖的用量。
本發(fā)明的化合物也可凍干，如果需要與藥學(xué)上可接受的賦形劑相結(jié)合制成適合于靜脈注射和注射用的配方。對(duì)于這類使用，配方可重新放入水中(通常為鹽水)或放在水與諸如丙二醇、乙醇之類的有機(jī)溶劑混合物中。
由于化合物效力不同，所選擇的使用途徑不同，接受者的大小不同及病人的病情況不同，所以使用劑量是否是單劑量、多劑量或每天劑量可視本發(fā)明特定的化合物不同而不同。使用的劑量雖無(wú)特定的范圍，但它通常是有效量或在活性藥物代謝釋放時(shí)從劑型中釋放出來(lái)藥物活性組份能達(dá)到所需的藥物效應(yīng)和生理效應(yīng)的相當(dāng)?shù)哪枬舛?。所用的劑量常?.8-8mg/體重公斤或約50-275mg/病人的m2，較好地約在230-275mg/m2。
生物活性如上所述，本發(fā)明的紫杉酚衍生物對(duì)于其抗腫瘤活性是有用的。對(duì)于紫杉酚能顯示活力的相同癌癥這些化合物尤為有效包括人的肺癌、黑素瘤、白血病、乳房腫瘤及結(jié)腸癌。
通過(guò)(A)體外研究來(lái)測(cè)定微管集合動(dòng)力學(xué);(B)體外研究B16黑素瘤細(xì)胞的培養(yǎng)動(dòng)力學(xué);及(C)體內(nèi)研究SRC亞腎囊的MX-1異種移植來(lái)試驗(yàn)紫杉酚的生物活性。
(A)體外微管集合動(dòng)力學(xué)研究微管是具核細(xì)胞的一個(gè)整體部分，微管集合與細(xì)胞分裂和增殖緊緊相關(guān)。已經(jīng)表明微管聚合化對(duì)鈣極敏感;鈣可以抑制小管集聚并使預(yù)裝配的微管解聚。人們已研究了已知的抗腫瘤化合物對(duì)微管集合的作用。
諸如長(zhǎng)春花堿和長(zhǎng)春(花)新堿的長(zhǎng)春花屬生物堿已顯示可以破壞細(xì)胞微管，即在體外它們已表明可以抑制微管集合并使穩(wěn)定狀態(tài)的微管解聚。
相似地是，秋水仙堿已顯示出在細(xì)胞內(nèi)使微管解聚。
另一方面，紫杉酚顯和出排常獨(dú)特的作用機(jī)制，即它促進(jìn)微管集聚但抑制其拆散，從而干擾了細(xì)胞周期和分裂的G2期和M期。體外研究表明，微管一旦聚集，在紫杉酚的存在下它耐住了被其它諸如CaCl2的試劑或低溫所引起的解聚，而諸如CaCl2的試劑或低溫?？墒刮⒐芙饩邸?br> 本發(fā)明者已對(duì)紫杉酚衍生物對(duì)微管聚集的作用進(jìn)行研究。根據(jù)所揭示的體外方法，例如Mellado et al.，Biochemical and Biophysical Research Communications，124卷，第2號(hào)(1984)，329-336頁(yè);Magri et al.，J.Org Chem.51，797-802(1986)和Parness et al.，Biochemical and B iophysical Research Communications 105卷，第3號(hào)1082-1091頁(yè)(1982)，對(duì)α和7-衍生物進(jìn)行微管聚集研究。這些化合物的聚集微管能力順序如下紫杉酚＞7-(N，N-二甲基甘氨酰)紫杉酚(11)＞2′(N，N-二乙氨基丙氨酰)紫杉酚(8)＞2′(N，N-二甲基甘氨酰)紫杉酚(2)。該研究表明游離的2′-羥基對(duì)于微管聚集是必不可少的。在實(shí)驗(yàn)期間如果能使2′-羥基游離的2′衍生物才是有活性的。具有游離的2′羥基的7-衍生物因而是有活性的。在文獻(xiàn)Mellado et，al，Biochemicaland Biophysical Research Commuications第129卷第2號(hào)(1989)第329-332頁(yè)中已報(bào)告了2′和7-乙?；仙挤拥幕钚越Y(jié)果。
(B)體外B16細(xì)胞培養(yǎng)研究為了證實(shí)本發(fā)明紫杉酚衍生物的活性，本發(fā)明者用B-16黑素瘤細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。根據(jù)DONCSC和HIMES，CANCER BIOCHEM BIOPHYSICS第7卷(1984)第133頁(yè)所述的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行研究。
在B-16黑素瘤細(xì)胞增殖研究中，有效的順序是紫杉酚＞2′-(N，N-二甲基甘氨酰)紫杉酚＞2′-(N，N-二乙氨基丙氨酰)紫杉酚＞7-(N，N-二甲基甘氨酰)紫杉酚。該研究及其它動(dòng)力學(xué)研究表明2′衍生物回復(fù)成紫杉酚并顯示出活性。因此，2′-衍生物可作為前體藥物。另一方面，7-衍生物擁有它們自己的活性而不顯示作為前體藥物的作用。
(C)體內(nèi)研究證實(shí)紫杉酚衍生物的生物活性而進(jìn)行的第三種實(shí)驗(yàn)包括，在小鼠體內(nèi)亞腎囊上研究人體乳房癌癥MX-1異種移植。下面方法是NIH公開第84-2635號(hào)In Vivo Cancer Model(1984年2月)所述的。
方法在該方法中，采用每組12個(gè)小鼠的對(duì)照組和試驗(yàn)組(每組6個(gè)小鼠)。將腫瘤碎片(人體乳房癌MX-1異種移植)植入至每個(gè)小鼠覆蓋腎的膜下。
試驗(yàn)方法如下第0天麻醉動(dòng)物，記錄體重(第1天重量)。植入腫瘤，測(cè)量并記錄，在動(dòng)物麻醉后使動(dòng)物隨機(jī)化。進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。測(cè)定試劑的溶解度。記錄每天的死亡數(shù)。
第1天檢查培養(yǎng)物，如果污染則舍棄實(shí)驗(yàn)物，制備試驗(yàn)物質(zhì)。在個(gè)體體重基礎(chǔ)上開始注射試驗(yàn)劑(注射在頸背)。在第1、5和9天用Q4D處理。在注射的每天制備新鮮的試驗(yàn)試劑，并根據(jù)那天的個(gè)體體重類使用。
第2天再檢查培養(yǎng)物。如果污染則中止試驗(yàn)并記錄下來(lái)。
第5天和第9天在每次注射那天制備新鮮的試驗(yàn)試劑并根據(jù)個(gè)體的那天體重給藥。
第11天結(jié)束并評(píng)估實(shí)驗(yàn)，記錄體重(第2天稱重)。測(cè)量腫瘤，單位為OMu′s(目測(cè)的微米單位-10 OMU′S＝1毫米)并記錄評(píng)價(jià)根據(jù)腫瘤長(zhǎng)度和寬度(單位毫米)的基礎(chǔ)上測(cè)量平均腫瘤重量改變(delta)的參數(shù)。計(jì)算第1天和第11天的平均動(dòng)物體重，對(duì)第11天存活率＞65%的所有試驗(yàn)組計(jì)算T/C。在評(píng)作毒性時(shí)也可使用超體重改變的差異(試驗(yàn)組減去對(duì)照組)用目測(cè)的微米單位(OMU)測(cè)量并記錄尺寸范圍。用計(jì)算器進(jìn)行如下的計(jì)算。
1)將OMU′S轉(zhuǎn)變成毫米。
2)從下式計(jì)算長(zhǎng)椿球體積的式中算出腫瘤范圍從而算出腫瘤重量(L×W2)/2 (其中L是兩次測(cè)量中較長(zhǎng)的軸)3)計(jì)算每組小鼠平均腫瘤重量的改變(δ)平均腫瘤重量的改變＝1平均腫瘤重量)最終(平均腫瘤重量)4)計(jì)算試驗(yàn)組(T)和對(duì)照組(C)的平均腫瘤重量改變值(δ)5)對(duì)最后一天存活率＞65%的所有試驗(yàn)組計(jì)算T/C%T/C%＝ (△Wt T)/(△Wtc) ×100-如果△WT為正T/C%＝ (△Wt T)/(試驗(yàn)組的平均腫瘤重量起始) ×100-如果△Wt T為負(fù)數(shù)活性依據(jù)T/C≤20%被認(rèn)為是具有中等活性，再現(xiàn)的T/C≤10%被認(rèn)為具有顯著活性。
結(jié)果對(duì)一些紫杉酚衍生物的試驗(yàn)結(jié)果如表1和2所示從這些結(jié)果可見本發(fā)明的紫極酚衍生物表現(xiàn)出優(yōu)良的抗腫瘤活性。因此，這些化合物由于它們的生物活性以及與紫杉酚相比它們的水溶性增加故它們是有用的抗腫瘤劑。
本發(fā)明作了這樣的闡述，明顯地可作出許多改變。這些變動(dòng)被認(rèn)為不背離本發(fā)明的精神和范圍，所有的這類變動(dòng)對(duì)該技術(shù)領(lǐng)域的人員來(lái)說(shuō)是明顯的，它們是在下列權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種化合物或其酸加成鹽，其特征在于它有下列結(jié)構(gòu)式
其中R和R′各自是H或選自由丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、賴氨酸和精氨酸所組成組的氨基酸殘基或是式為
的基團(tuán)，其中n是1-3的整數(shù)，R2和R3各自是氫或是有1-3個(gè)碳原子的烷基，或者R2和R3與N原子一起形成有4-5碳個(gè)碳原子的飽和雜環(huán)，條件是R和R1中至少有一個(gè)不是氫。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其特征在于R和R的至少其中的一個(gè)是選自由L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-賴氨酸和L-精氨酸所組成組的成份。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于其中R和R′的至少其中的一個(gè)是下式基團(tuán)
其中n是1-3的整數(shù)，R2和R3是有1-3個(gè)碳原子的烷基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于它是2′-(N，N-二甲基甘氨酰)，紫杉酚或是其酸加成鹽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于它是2′-(N，N-二乙氨基丙氨酰)紫杉酚或其酸加成鹽。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于它是7-(N，N-二甲基甘氨酰)紫杉酚或其酸加成鹽。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于它是2′，7-二(N，N-二甲基甘氨酰)紫杉酚或其酸加成鹽。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于它是7-(丙氨酰)紫杉酚或其酸加成鹽。
9.一種藥物組合物，其特征在于它包括至少一種有效抗腫瘤量的下式化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
其中R和R′各自是H或是選自由丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、賴氨酸和精氨酸所組成組的氨基酸殘基或是下式的基團(tuán)
其中n是1-3的整數(shù)，R2和R3各自氫或是有1-3個(gè)碳原子的烷基，或R2、R3和N原子連接在一起形成有4-5個(gè)碳原子的飽和雜環(huán)，條件是R和R′中至少有一個(gè)不是氫。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的藥物組合物，其特征在于其是所述的至少一種化合物是2′-(N，N-二甲基甘氨酰)紫杉酚。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于其中所述的至少一種化合物是2′-(N，N-二乙氨基丙氨酰)紫杉酚。
12.一種治療腫瘤的方法，其特征在于它包括給病人使用抗腫瘤有效量的至少一種權(quán)利要求1化合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于其中所述的治療包括治療選自由人體肺癌、黑素瘤、白血病、乳房腫瘤和結(jié)腸癌所組成組的腫瘤。
14.一種制備下式化合物的方法
其中R和R′各自是H或是下式的基團(tuán)
其中n是1-3整數(shù)，R2和R3各自是氫或是有1-3個(gè)碳原子的烷基，或者R2和R3與氮原子結(jié)合在一起形成有4-5個(gè)碳原子的飽和雜環(huán)，條件是R和R′中至少一個(gè)不是氫，其特征在于所述的方法包括使紫杉酚與下式化合物反應(yīng)
其中n、R2和R3的定義同上。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于其中所述的紫杉酚和所述的式(Ⅳ)化合物以1∶1的等當(dāng)量比率進(jìn)行反應(yīng)，從而形成了式Ⅱ)的2′-取代化合物，其中R是式(Ⅲ)基團(tuán)，R′是H。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于其中將2當(dāng)量所述式(Ⅳ)化合物與1當(dāng)量紫杉酚反應(yīng)從而形成式(Ⅱ)的2′，7-二(取代的)化合物，其中R和R′是式(Ⅲ)的基團(tuán)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于其中所述的2′，7-二(取代)化合物進(jìn)行裂解反應(yīng)，從而使2′-取代基被裂解形成式(Ⅱ)的7-取代化合物，其中R是H，R′是式(Ⅲ)的基團(tuán)。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于其中所述的反應(yīng)是在縮合試劑存在下，有或無(wú)催化劑時(shí)進(jìn)行的。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于其中所述的裂解反應(yīng)包括將2′7-二(取代)化合物的pH調(diào)至7-7.4。
20.一種制備下式化合物的方法，
其中R和R′各自是H或是氨基酸殘基，條件是R和R′至少有一個(gè)不是H，其特征在于所述的反應(yīng)包括使紫杉酚與N-保護(hù)的氨基酸反應(yīng)，接著使所述的氨基酸去保護(hù)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于其中所述的紫杉酚和所述的N-保護(hù)的氨基酸以1∶1的等當(dāng)量比率進(jìn)行反應(yīng)從而形成2′-取代紫杉酚衍生物。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于其中所述的紫杉酚和所述的N-保護(hù)的氨基酸以1∶2的當(dāng)量比率進(jìn)行反應(yīng)從而形成2′，7-二取代紫杉酚衍生物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于使其中所述的式(Ⅱ)化合物進(jìn)行裂解反應(yīng)，從而使2′-取代氨基酸裂解從而形成7-(氨基酸)紫杉酚衍生物。
24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于其中所述的去保護(hù)步驟是通過(guò)溫和酸處理而進(jìn)行的。
25.一種制備下式化合物的方法，
其中R是選自由丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、賴氨酸和精氨酸所組成的氨基酸殘基，或是下式的基團(tuán)
其中n是1-3整數(shù)，R2和R3各自是氫原子或是有1-3個(gè)碳原子的烷基或R2和R3與氮原子連接在一起形成有4-5個(gè)碳原子的飽和雜環(huán)，其特征在于所述的方法包括(a)使紫杉酚與羥基保護(hù)基團(tuán)化合物反應(yīng)形成2′-(保護(hù)的)紫杉酚;(b)使所述的2′-(保護(hù)的)紫杉酚與丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、賴氨酸、精氨酸或下式化合物
(其中R2、R3和n的定義同上)反應(yīng)以形成2′-(保護(hù)的)、7-(取代的)的紫杉酚;以及(c)使2′-位去保護(hù)。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于其中所述的去保護(hù)步驟是通過(guò)使所述的2′-(保護(hù)的)7-(取代的)紫杉酚與鋅和乙酸混合物反應(yīng)而進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明涉及式(II)表示的紫粉酚衍生物，其中R和R′各自是氫或氨基酸殘基，或是式(III)的基團(tuán)，其中n是1-3整數(shù)，R
文檔編號(hào)A61K31/40GK1058018SQ9010468
公開日1992年1月22日 申請(qǐng)日期1990年7月13日 優(yōu)先權(quán)日1989年3月9日
發(fā)明者瓦倫弟諾·J·斯特拉, 阿伯拉罕E·馬修 申請(qǐng)人:堪薩斯大學(xué)