專(zhuān)利名稱(chēng)：13－已基黃藤素的制備及其抗病毒和抗菌作用的制作方法
專(zhuān)利說(shuō)明13-己基黃藤素的制備及其抗病毒和抗菌作用 概述1.13-己基黃藤素(其鹽酸鹽見(jiàn)化學(xué)式〔I〕)是以黃藤素為原料，經(jīng)結(jié)構(gòu)改造而得的黃藤素衍生物。黃藤素收載于1977年版中華人民共和國(guó)藥典，又名氯化巴馬汀，原是一種抑菌抗炎藥，據(jù)報(bào)道在70年代臨床已應(yīng)用15萬(wàn)例以上。黃藤素有季銨鹽結(jié)構(gòu)(化學(xué)式〔II〕)，與小檗堿的結(jié)構(gòu)十分接近，它能作用和影響病毒和細(xì)菌的DNA、蛋白質(zhì)、酶，因而在臨床上具有相對(duì)廣譜的抗菌活性。但是季銨鹽的親脂性較差，難以通過(guò)組織的脂質(zhì)膜，因此影響其吸收利用和作用強(qiáng)度。本發(fā)明采用正交優(yōu)化的新型衍生制備方法，制備了13-己基黃藤素(鹽酸鹽)。體外抗菌試驗(yàn)表明，本品抗葡萄菌的作用最高可比黃藤素強(qiáng)32倍以上。藥理動(dòng)物模型試驗(yàn)首創(chuàng)發(fā)現(xiàn)，13-己基黃藤素還具有很強(qiáng)的抗病毒作用。抗病毒所需劑量很低，對(duì)感染流感病毒小鼠腹腔給藥，只需0.2mg/kg劑量就有顯著的保護(hù)效果。而測(cè)定13-己基黃藤素鹽酸鹽的靜注急性毒性，與黃藤素的毒性十分接近，LD50＞30mg/kg，說(shuō)明衍生物的毒性并無(wú)增加。因此，13-己基黃藤素作為一種新的抗病毒和抗生藥物，具有巨大潛力，是十分有前途的。
13-己基黃藤素(鹽酸鹽) 黃藤素(鹽酸鹽) 二氫黃藤素[2]工藝方法1.13-己基黃藤素合成路線 2.二氫黃藤素(鹽酸鹽)制備將20.0g黃藤素溶解于400mL0.3～5％氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液。另取0.5～3.0g硼氫化鈉溶于200mL0.3～5％氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液，得到穩(wěn)定化的硼氫化鈉溶液。將經(jīng)堿穩(wěn)定化處理的硼氫化鈉溶液滴入黃藤素溶液，室溫下攪拌反應(yīng)2～4小時(shí)。抽濾，將濾上物水洗至濾液呈中性，得到二氫黃藤素粗品；將二氫黃藤素粗品以10～40％乙醇和60～95％乙醇精制，在50％丙酮中析出二氫黃藤素鹽粉狀晶體，產(chǎn)率約80％。
3.13-己基黃藤素鹽酸鹽的合成取二氫黃藤素10.0g，以800mL50～100％乙醇溶液溶解，加150～300mL冰醋酸，正己醛10～200mL，搖勻后80～95℃水浴加熱回流1～8小時(shí)，減壓濃縮后加入1～10％鹽酸溶液(v/v)500mL，攪勻后靜置，將析出物過(guò)濾并用水充分洗滌，得到13-己基黃藤素粗品；將13-己基黃藤素粗品溶于5～20％乙醇——鹽酸混合溶液，以非極性(或弱極性)大孔吸附樹(shù)脂吸附，依次用鹽酸溶液及不同濃度的乙醇——鹽酸混合溶液洗脫，解吸液濃縮至無(wú)醇，靜置后析出13-己基黃藤素(鹽酸鹽)晶體。產(chǎn)率＞55％。13C-NMR測(cè)定1.13-己基黃藤素(鹽酸鹽)的13C-NMR測(cè)定13C-NMR(CD3OD，AV-500)，測(cè)定圖譜見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖
。
δ31.37(1’C)，32.86(2’C)，31.37(3’C)，24.15(4’C)，33.17(5’C)，14.81(6’C)，29.41(C-5)，59.68(C-6)，57.27(C(3)-Ome)，57.83(C(2)-Ome)，58.15(C(10)-Ome)，63.19(C(9)-Ome)，112.95(C-4)，115.59(C-1)，122.58(C-12)，127.95(C-11)，121.36(C-1a)，123.68(C-8a)，135.20(C-12a)，134.31(C-4a)，136.53(C-13)，138.51(C-13a)，145.76(C-8)，146.98(C-9)，150.15(C-2)，153.80(C-3)，152.21(C-10).藥理和毒理1.13-己基黃藤素的藥理試驗(yàn)對(duì)感染致死劑量甲型流感病毒的小鼠，腹腔給予0.4mg/kg的13-己基黃藤素，5日內(nèi)給藥3次，即可顯著降低流感小鼠的肺病變指數(shù)并顯著降低死亡率。而對(duì)照陽(yáng)性藥利巴韋林在相同條件下則需劑量50mg/kg方才有類(lèi)似的效果。此外，體外抗菌試驗(yàn)表明，13-己基黃藤素對(duì)于抗性金黃色葡萄球菌(氨芐青霉素抗性+帕那沙星抗性+頭孢霉素抗性)及對(duì)常規(guī)金葡菌的最低抑菌濃度(MIC)分別為8μg/ml和16μg/ml，作用強(qiáng)度比黃藤素強(qiáng)16倍至32倍以上。而毒性試驗(yàn)(LD50)則表明，13-己基黃藤素血管給藥的急性毒性與黃藤素十分接近，LD50＞30mg/kg，毒性無(wú)明顯增加。由此說(shuō)明，13-己基黃藤素鹽酸鹽作為黃藤素的衍生改造產(chǎn)品是十分成功的，它將成為一種新的抗病毒藥和抗菌藥，具有良好前途。
實(shí)施例1二氫黃藤素的制備將20.0g黃藤素溶解于400mL0.5％氫氧化鈉溶液。另取1.6g硼氫化鈉溶于200mL0.5％氫氧化鈉溶液，得到穩(wěn)定化的硼氫化鈉溶液。將經(jīng)堿穩(wěn)定化處理的硼氫化鈉溶液滴入黃藤素溶液，室溫下攪拌反應(yīng)3.0小時(shí)。抽濾，將濾上物水洗至濾液呈中性，得到二氫黃藤素粗品；將二氫黃藤素粗品以100mL溫?zé)岬?0％乙醇溶液溶解，冷卻后抽濾，濾上物以100mL70％乙醇溶液溶解，迅速抽濾，濾上物以200ml鹽酸的丙酮溫?zé)崛芙?，加等體積水，攪勻后靜置，將析出物抽濾并用水充分洗滌至濾液呈中性，經(jīng)干燥后得到二氫黃藤素粉末狀晶體17.0g，產(chǎn)率為85.0％。
實(shí)施例213-己基黃藤素鹽酸鹽的合成取二氫黃藤素10.0g，以800mL80％乙醇溶液溶解，加200mL冰醋酸，正己醛30mL，搖勻后95℃水浴加熱回流3小時(shí)，減壓濃縮后加入2％鹽酸溶液500mL，攪勻后靜置，將析出物過(guò)濾并用水充分洗滌，得到13-己基黃藤素粗品將13-己基黃藤素粗品溶于5～20％乙醇——0.5～2％鹽酸混合溶液，以D-101(或AB-8或D-130或其它類(lèi)似非極性或弱極性)大孔吸附樹(shù)脂吸附，依次用鹽酸溶液及20％、40％、60％、95％乙醇——1％鹽酸溶液洗脫，收集60％乙醇——1％鹽酸溶液的洗脫液，濃縮至無(wú)醇，冷卻、靜置，抽濾析出物，得到13-己基黃藤素(鹽酸鹽)晶體5.2g，純度99.6％，產(chǎn)率為52.0％。
實(shí)施例313-己基黃藤素的抗病毒試驗(yàn)1.材料病毒甲型流感病毒A/PR/8/34(中國(guó)預(yù)防醫(yī)科院病毒所)，制備成雞胚尿囊液，血凝滴度640以上。
小鼠ICR鼠，13-16g，雌雄各半。
2.方法 小鼠先分組，各組用乙醚輕度麻醉，以病毒尿囊液(20倍半致死量)滴鼻感染小鼠。1日后按設(shè)定劑量腹腔給受試藥，對(duì)照給生理鹽水。隔日給藥一次，5日共給藥3次，首次給藥量加倍，5天后介剖測(cè)定病變肺指數(shù)(下表1)。另批小鼠在給藥后14天后作死亡率統(tǒng)計(jì)(下表2)。
3.結(jié)果表113-己基黃藤素(簡(jiǎn)稱(chēng)13-HP)對(duì)甲型流感病毒感染小鼠肺指數(shù)的影響(x±s)組別劑量 動(dòng)物數(shù)肺指數(shù)值 肺指數(shù)抑制率(mg/kg)(只) (g/10g) (％)病毒對(duì)照組 - 100.180±0.088利巴韋林組 50.0 100.103±0.014*42.813-HP1組0.1100.160±0.062 1113-HP2組0.2100.140±0.038 2213-HP3組0.4100.120±0.034 3313-HP4組0.8100.101±0.046*44與病毒對(duì)照組比較*p＜0.05；肺指數(shù)＝小鼠肺重/小鼠體重。
表213-己基黃藤素(13-HB)對(duì)甲型流感病毒感染小鼠死亡的保護(hù)作用組別 動(dòng)物數(shù) 劑量 死亡數(shù) 保護(hù)率存活天數(shù)(只)(mg/kg) (只)(％) (x±s)正常對(duì)照組16 -- 0 100.0 14.0病毒對(duì)照組16 -14 12.5 7.13±3.45利巴韋林組16 50.0 6 50.0*10.30±3.40*13-HPI組 16 0.1 4 61.5**10.63±3.26*13-HPII組 16 0.2 3 68.8**11.67±3.40**13-HPIII組16 0.4 2 75.0**12.20±3.41**與病毒對(duì)照組比較*p＜0.05**p＜0.01表1和表2結(jié)果表明，13-己基黃藤素具有減輕甲型流感病毒感染小鼠肺部病變的作用，延長(zhǎng)感毒小鼠存活天數(shù)降低死亡數(shù)。
實(shí)施例413-己基黃的抗菌試驗(yàn)1.材料與方法菌株金黃色葡萄球菌(ATCC25925)、金黃色葡萄球菌(氨芐青霉素抗性+帕那沙星抗性)、金黃色葡萄球菌(氨芐青霉素抗性+帕那沙星抗性+頭孢霉素抗性)、表皮葡萄球菌的肉湯培養(yǎng)物以及白色念球菌(ATCC10231)標(biāo)準(zhǔn)菌株的查氏培養(yǎng)基培養(yǎng)物。
培養(yǎng)基M-H(Mueller-Hinton Agar)培養(yǎng)基，白念菌用查氏培養(yǎng)基。平板培養(yǎng)，用多點(diǎn)接種儀接種。37℃培養(yǎng)18小時(shí)。
2.結(jié)果1、13-己基黃藤素抗菌活性
①ATCC25925；②氨芐青霉素抗性+帕那沙星抗性③氨芐青霉素抗性+帕那沙星抗性+頭孢霉素抗性。
2、黃藤素抗菌活性
①②③菌種特性如前。
3、鏈霉素抗菌活性
①②③菌種特性如前。
以上1.2.3.表表明，13-己基黃藤素對(duì)金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)株及抗藥性株都有較強(qiáng)的抗菌作用，其作用比黃藤素增強(qiáng)8倍至32倍以上。13-己基黃藤素在16μg/ml以上濃度表現(xiàn)有抗白色念珠菌的作用，具有一般抗菌素所不多見(jiàn)的特色。
權(quán)利要求
1.一種具有高效抗病毒作用的黃藤素衍生物，其特征是在黃藤素13位具有正己基的取代基，定名為13-己基黃藤素，其鹽酸鹽化學(xué)式如圖。 13-己基黃藤素(鹽酸鹽)
2.按權(quán)利要求1所提出的13-己基黃藤素(鹽酸鹽)，以不同種類(lèi)的有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸取代其鹽酸所形成的13-己基黃藤素的有機(jī)酸鹽或無(wú)機(jī)酸鹽。
3.一種以黃藤素為原料，制備13-己基黃藤素的方法，方法的特征是先制備二氫黃藤素，然后與正己醛反應(yīng)合成13-己基黃藤素。
4.按權(quán)利要求3制備方法中二氫黃藤素的制備，其特征是使用稀堿液中穩(wěn)定化的硼氫化鈉，室溫下與黃藤素在水介質(zhì)中反應(yīng)的工藝。具體配比及步驟為將20.0g黃藤素溶解于400mL 0.3～5％氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液。另取0.5～3.0g硼氫化鈉溶于200mL0.3～5％氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液，得到穩(wěn)定化的硼氫化鈉溶液。將經(jīng)堿穩(wěn)定化處理的硼氫化鈉溶液滴入黃藤素溶液，室溫下攪拌反應(yīng)2～4小時(shí)。抽濾，將濾上物水洗至濾液呈中性，得到二氫黃藤素粗品；將二氫黃藤素粗品用10～40％乙醇溶液和60～95％7醇溶液各精制一次，最后在50％丙酮中結(jié)晶，淋洗并干燥后得到二氫黃藤素的粉末狀晶體。
5.按權(quán)利要求3中合成13-己基黃藤素的方法，其特征是采用正己醛與二氫黃藤素在醋酸乙醇液中反應(yīng)，生成13-己基黃藤素。具體配比和步驟為 取二氫黃藤素10.0g，以800mL50～100％乙醇溶液溶解，加150～300mL冰醋酸，正己醛10～200mL，搖勻后80～95℃水浴加熱回流1～8小時(shí)，減壓濃縮后加入1～10％鹽酸溶液(v/v)500mL，攪勻后靜置，將析出物過(guò)濾并用水充分洗滌，得到13-己基黃藤素粗品；將13-己基黃藤素粗品溶于5～20％乙醇——鹽酸混合溶液，以非極性(或弱極性)大孔吸附樹(shù)脂吸附，依次用鹽酸溶液及不同濃度的乙醇——鹽酸混合溶液洗脫，解吸液濃縮至無(wú)醇，靜置后析出13-己基黃藤素(鹽酸鹽)晶體。
6.用專(zhuān)利要求1和專(zhuān)利要求2所述的13-己基黃藤素及其各種鹽類(lèi)，配加藥用賦形劑或載體而制成的抗病毒藥品或抗生素類(lèi)藥品，其特征是具有抗病毒作用和抗生素作用。
全文摘要
采用經(jīng)正交優(yōu)化的新型衍生制備方法，制得13－己基黃藤素。經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)和微生物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，此品具有高效的抗病毒作用和抗菌作用。
文檔編號(hào)A61P31/12GK1629159SQ20031011263
公開(kāi)日2005年6月22日 申請(qǐng)日期2003年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月15日
發(fā)明者李耐三, 汪海峰 申請(qǐng)人:李耐三, 汪海峰