專利名稱：乳蛋白部分水解產(chǎn)物及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及酶催制備乳蛋白部分水解產(chǎn)物的方法和含該水解產(chǎn)物的低抗原性嬰兒配方食品。
大量嬰兒配方基于牛乳蛋白。對乳蛋白確實過敏的嬰兒就要求嬰兒配方中的蛋白大量水解而含有最少量的剩余分子結構。對于非過敏性嬰兒，低抗原性嬰兒配方具有預防作用，其中該配方延遲或防止了敏化作用，否則就會導致臨床過敏癥狀。牛乳蛋白配方的潛在過敏性可通過蛋白水解而降低。
為了理想地滿足人乳組成，嬰兒配方中的牛乳蛋白應含適當比例的乳清蛋白和酪蛋白。盡管有大量全乳蛋白食品滿足了要求的乳清蛋白/酪蛋白比例，但幾乎所有的市售部分水解配方都基于100%乳清蛋白。
文獻中所述部分水解產(chǎn)物制備方法一般涉及多步驟水解及水解后的物理分離以去除酶和/或剩余蛋白。大多數(shù)方法要求在水解期間進行恒定pH值控制。而且，除非引入另外的工藝步驟，否則所得水解產(chǎn)物通常含大量鹽，這可給嬰兒配方帶來組成上的問題，其中礦物質(zhì)量通常要調(diào)為一定量。
US 5039532說明了酶法水解而得要求特性水解產(chǎn)物的兩個步驟。該專利還說明了嬰兒配方制備方法，其中該配方進行超高溫(UHT)滅菌。US 4293571和4981704均說明了用胰酶得到的部分水解產(chǎn)物，其中涉及水解后的膜分離工藝，以除去剩余蛋白和酶。
蛋白水解產(chǎn)物，尤其是含酪蛋白水解產(chǎn)物的普通特性是帶來了苦味，據(jù)推測這是因為有帶疏水端基的肽釋放出來。而且，蛋白的乳化性一般隨水解程度的提高而降低。日本專利JP 1160458說明了乳蛋白水解產(chǎn)物(5-20%)水解)，該產(chǎn)物在食品如冰淇淋和攪打稀奶油中具有表面活性和乳化性。但是，在經(jīng)歷敏化過程的食品如液體嬰兒配方中，蛋白水解產(chǎn)物的進一步變性使其在乳液中的功能降低。這在食品中表現(xiàn)為乳清和奶油分層。通常優(yōu)選在常用高壓殺菌釜中采用UHT滅菌工藝的高溫短時條件以防止極為不利的受熱。
因此，仍急需低抗原性蛋白部分水解產(chǎn)物，其中乳清蛋白/酪蛋白比例可使其達到類似于人乳的蛋白組成，并且其味道和/或乳化性得到改進。
本發(fā)明涉及蛋白混合物部分水解產(chǎn)物，其中該蛋白混合物包括乳清蛋白和酪蛋白，該水解產(chǎn)物的水解程度為4-10%，并且還涉及含該部分水解產(chǎn)物的嬰兒配方。
本發(fā)明還涉及蛋白混合物部分水解產(chǎn)物的制備方法，其中包括在可使水解程度達到4-10%的條件下將乳清蛋白和酪蛋白的混合物與包括至少1800USP胰蛋白酶單位/mg和至少350USP胰凝乳蛋白酶單位/mg的水懸浮液態(tài)酶混合物接觸。
本發(fā)明提出宜于制成低抗原性營養(yǎng)食品的乳清蛋白和酪蛋白混合物的部分水解產(chǎn)物及其制備方法。與現(xiàn)有蛋白部分水解產(chǎn)物相比，本發(fā)明的部分水解產(chǎn)物還與人乳的乳清蛋白/酪蛋白比例較為接近。此外，本發(fā)明部分水解產(chǎn)物優(yōu)選還改進了其味道和乳化活性。
本發(fā)明方法用包括乳清蛋白和酪蛋白的混合物并且其比例優(yōu)選類似于人乳中該比例的原料進行。優(yōu)選蛋白混合物包括約60-約80%乳清蛋白和約40-約20%酪蛋白，更優(yōu)選約40-約60%乳清蛋白和約60-約40%酪蛋白(均以重量計)。乳清蛋白可源于干酪制造過程中得到的乳清，尤其是甜乳清如酪蛋白經(jīng)凝乳酶凝固而得到的乳清。乳清蛋白也可以35-80%超濾得到的蛋白(UF乳清)濃縮物形式應用。該乳清原料還可任選經(jīng)離子交換和/或電滲析而脫礦物質(zhì)(ED乳清)。酪蛋白源也可是酸酪蛋白或無脂肪乳固體(NFDM)。乳清蛋白和酪蛋白也可以液體濃縮物或粉狀應用。本發(fā)明方法中，蛋白可稀釋或復原成含約10-約60g蛋白/升，優(yōu)選約40-約60g蛋白/升的溶液。
本發(fā)明方法中，應用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的混合物，其中各酶的特異性或專一性是互相補充的。該酶混合物中優(yōu)選不含其它污染性蛋白酶如羧基肽酶A和B或亮氨酸氨基肽酶。該混合物中的胰蛋白酶量等于或大于800USP單位/mg，優(yōu)選等于或大于1000USP單位/mg，更優(yōu)選等于或大于1800USP單位/mg。1個USP胰蛋白酶單位為5分鐘試驗時間，pH7.6,25±1℃和N-苯甲酰-L-精氨酸乙基酯鹽酸鹽(BAEE)作為底物的條件下引起的吸收率變化為0.003/分鐘的活性。
該混合物中的胰凝乳蛋白酶量等于或大于150USP單位/mg，優(yōu)選等于或大于200USP單位/mg，更優(yōu)選等于或大于350USP單位/mg。1個USP胰凝乳蛋白酶單位為5分鐘試驗時間，pH7.6，25±1℃和N-乙?；?L-酪氨酸乙基酯(ATEE)作為底物的條件下引起的吸收率變化為0.0075/分鐘的活性。
宜用于本發(fā)明的市售酶源包括Novo Nordisk Bioindustrials,Inc.，Danbury, CT，U.S.A.(尤其是PEM2500S)，Enzyme Development Corp.，New York，NY，U.S.A.，Intergen Company，Purchase，NY，U.S.A.和Scientific Protein Labs.，Waunakee，WI，U.S.A.。
為了得到要求性能的水解產(chǎn)物，一般需使胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶混合物中以上述的USP單位計的胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶之比達到約1.3-約18，優(yōu)選約1.3-約10，更優(yōu)選約4-約6。本發(fā)明中酶混合物用量一般為被水解總蛋白量的約0.4-約1.2Wt%(重量百分比)，優(yōu)選約0.6-約0.8Wt%。
水解前的任選預操作步驟是使蛋白液預熱以保證乳清蛋白組分如血清白蛋白(BSA)和免疫球蛋白(尤其是IgG)變性。該步驟通常會使免疫化學評價(如下所述)時的剩余抗原性降低。該預處理步驟中通常是經(jīng)過約10-約30分鐘加熱到約75-約85℃。而水解本身通常是在約30-約50℃下進行約2-約6小時，其中下限溫度對應于上限時間，反之亦然。水解期間通常不要求保持pH，因為水解一般在pH6.5-6.8下進行而無需另外進行pH控制。pH應保持在約6.5-8.0范圍內(nèi)，其中調(diào)節(jié)或不調(diào)節(jié)pH。
不管水解條件如何，水解產(chǎn)物優(yōu)選還另外進行酶失活步驟。這種酶失活作用可為熱處理，其中包括歷經(jīng)約10分鐘加熱到約85℃。另一方面，可通過超高溫滅菌(如約130℃進行大約45分鐘)使酶失活，然后以液態(tài)保存產(chǎn)物。該水解產(chǎn)物也可通過蒸發(fā)濃縮或噴霧干燥。
為了監(jiān)控水解程度，可采用the United States Pharmacopeia(USP)甲醛滴定法，其中可通過氫氧化鈉滴定而評估肽水解期間游離氨基的增加量。水解程度為4-10%，優(yōu)選為5-7%。水解程度低于某些現(xiàn)有方法達到的程度正是本發(fā)明的優(yōu)點，本發(fā)明還可使抗原性明顯降低。
用尺寸篩析層析法(SEC)確定水解產(chǎn)物肽分子量分布。在TSKG-2000SWXL柱中按分子尺寸將水解產(chǎn)物中的肽分開，柱保持在37℃并用TFA和乙腈在KCL中以0.7ml/分鐘的速度洗脫。用UV檢測器測出214nm下的吸收性與保持時間的關系并將其與已知分子量的標準蛋白和肽的同樣曲線比較。本發(fā)明部分水解產(chǎn)物優(yōu)選平均分子量為2000，最大分子量19000，由如下分布的肽構成，以下按其摩爾質(zhì)量列出摩爾質(zhì)量 %分子量分布(ɡ/mo1)MM＞5000 8.25000＞MM＞3000 14.53000＞MM＞2000 15.82000＞MM＞1000 26.21000＞MM＞500 17.8MM＞500 17.5本發(fā)明水解產(chǎn)物優(yōu)選不含可檢測到的全乳蛋白。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)可顯示出水解產(chǎn)物中不存在全乳蛋白。SDS-PAGE用4-20%Tris-甘氨酸梯度凝膠進行。15μg水解蛋白用SDS處理，用2-巰基乙醇還原，加熱后涂在單線上。電泳分離結束時，凝膠上涂銀以顯示出剩余肽。在相同凝膠中用5μg未被水解的蛋白原料直接進行對比。
水解產(chǎn)物的剩余抗原性用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)確定。將未被水解的乳蛋白固定在固相上，其濃度落入該試驗中確定的線性劑量-反應范圍內(nèi)。水解產(chǎn)物制劑也類似地被固定。后續(xù)用兔抗牛乳蛋白和可與兔IgG反應的酶綴合體順序保溫表明有抗原性可識別的蛋白和肽存在。以質(zhì)量為基礎將用水解產(chǎn)物得到的結果與用未被水解的蛋白原料得到的結果進行比較。然后計算水解產(chǎn)物的抗原性降低百分比。本發(fā)明水解產(chǎn)物的抗原性降低至少約80%，優(yōu)選至少約85%，更優(yōu)選至少約90%，最優(yōu)選至少約95%。
本發(fā)明水解產(chǎn)物宜用于嬰兒配方，并經(jīng)常用于食品工業(yè)按普通單元操作加工?？捎蒙鲜龅腅LISA方法測定這些配方與相應的未被水解蛋白比較的抗原性降低。
用本發(fā)明水解產(chǎn)物得到的本發(fā)明嬰兒配方與相應的未被水解的蛋白混合物比較，其抗原性降低至少約80%，優(yōu)選至少約85%，更優(yōu)選至少約90%，最優(yōu)選至少約95%。本發(fā)明嬰兒配方可為粉狀，濃縮液態(tài)或即用液體。
此外，本發(fā)明嬰兒配方與用部分水解的乳清蛋白得到的相應配方相比，其味道得到改善。
本發(fā)明嬰兒配方可含有用來滿足嬰兒營養(yǎng)需求的成分。因此，除本發(fā)明部分蛋白水解產(chǎn)物之外，典型嬰兒配方可含有脂源，碳水化合物源和其它營養(yǎng)素如維生素和礦物質(zhì)。一般來說，可將動物油，植物油，淀粉，蔗糖，乳糖和/或玉米糖漿固體加入配方中以提供部分或全部以上營養(yǎng)素。
優(yōu)選的是，本發(fā)明嬰兒配方是營養(yǎng)完全的。所謂“營養(yǎng)完全”，指其組成中可含適當營養(yǎng)素以長期維持健康人的生活。
蛋白部分水解產(chǎn)物量/100kcal總配方一般為約1.8g-約4.5g，脂源量/100kcal總配方一般為約3.3g-約6g，而碳水化合物源量/100kcal總配方一般為約7g-約14g。
在嬰兒配方中的碳水化合物源可為本技術領域已知的任何適宜的碳水化合物以使其宜用于嬰兒配方。典型的碳水化合物源包括蔗糖，果糖，葡萄糖，麥芽糖糊精，乳糖，玉米糖漿，玉米糖漿固體，大米糖漿固體，大米淀粉，改性玉米淀粉，改性木薯淀粉，米粉，豆粉等。
嬰兒配方中的脂源可為本專業(yè)已知的任何宜用于嬰兒配方的類脂或脂肪。典型類脂源包括乳脂肪，紅花油，蛋黃脂，橄欖油，椰子油，棕櫚油，棕櫚仁油，豆油，葵花籽油，魚油及其衍生物如甘油三棕櫚油酯，中等鏈長甘油三酸酯(MCT)以及脂肪酸酯，其中脂肪酸例子為例如花生四烯酸，亞油酸，棕櫚酸，硬脂酸，二十二碳六烯酸，二十碳五烯酸，亞麻酸，油酸，月桂酸，癸酸，辛酸，已酸等。各種形式的高油酸油如高油酸葵花籽油和高油酸紅花油也可用于此。中等錠長甘油三酸酯的辛酸和癸酸濃度高于常用油，如總脂肪酸含量中的約四分之三為辛酸，而四分之一為癸酸。
含本發(fā)明蛋白部分水解產(chǎn)物的嬰兒配方中還可任意補充各種游離氨基酸以提供營養(yǎng)平衡的氨基酸含量。這類游離氨基酸例子包括L-色氨酸，L-蛋氨酸，L-賴氨酸，L-酪氨酸和L-精氨酸。
營養(yǎng)完全的組合物含有日常飲食中被認為是基本的維生素和礦物質(zhì)并且這些成分應以足夠營養(yǎng)量存在。所屬技術領域里的技術人員應知道發(fā)揮正常生理功能所需維生素和礦物質(zhì)最低量。本發(fā)明實施人員也明白，需提供適當附加量(過量)維生素和礦物質(zhì)成分以補償這些組合物加工和貯存過程中的某些損失。
用于嬰兒配方的特定維生素或礦物質(zhì)的選擇要求考慮所選化合物適應加工和貯存的化學性質(zhì)。
可任選存在于本發(fā)明組合物中的礦物質(zhì)，維生素和其它營養(yǎng)素例子包括維生素A，維生素B6，維生素B12，維生素E，維生素K，維生素C，葉酸，硫胺素，肌醇，核黃素，煙酸，生物素，泛酸，膽堿，鈣，磷，碘，鐵，鎂，銅，鋅，錳，氯化物，鉀，鈉，硒，鉻，鉬，牛磺酸和L-肉毒堿。礦物質(zhì)通常以鹽的形式加入。除考慮到相容性和穩(wěn)定性之外，特定礦物質(zhì)和其它維生素的存在與否及其量可在一定程度上根據(jù)考慮到的嬰兒群體而變化。
本發(fā)明嬰兒配方一般還含乳化劑和穩(wěn)定劑如大豆卵磷脂，卡拉膠等。
本發(fā)明嬰兒配方還可任選含有可起有利作用的其它物質(zhì)如乳鐵蛋白，核苷酸，核苷，免疫球蛋白等。
本發(fā)明液體嬰兒配方(準備消費時)的重量滲透壓濃度一般為約100-約500mOsm/kgH2O，更通常為約200-約400mOsm/kgH2O。
本發(fā)明嬰兒配方必要時可滅菌，例如用本領域已知的技術如高壓蒸汽滅菌或過熱蒸汽滅菌等熱處理技術滅菌。
本發(fā)明嬰兒配方可用本領域已知用于保藏營養(yǎng)食品的任何類型容器如玻璃，加內(nèi)襯紙板，塑料，涂層金屬罐等包裝。
以下實施例詳述本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明。
實施例1蛋白質(zhì)50℃下溶解而達到4-6%蛋白濃度。這相當于10-25%固體，具體值取決于所用蛋白類型。預熱處理時在75℃下保持30分鐘?；旌衔锢渲?0℃后加酶混合物。水解可在30-50℃溫度范圍內(nèi)進行2-6小時。水解時間和溫度相互關聯(lián)，其中溫度下限對應于時間上限，反之亦然。混合物的pH可在水解期間加以調(diào)節(jié)或不調(diào)節(jié)。為了使酶失活，可向水解產(chǎn)物中注入130℃蒸汽達45秒鐘。該高溫處理步驟與預熱處理和酶法水解步驟一起產(chǎn)生低抗原性水解產(chǎn)物。必要時用氫氧化鉀將pH調(diào)為至少6.6以防止在熱處理期間出現(xiàn)熱凝固。
實施例2重復例1的操作，只是85℃下預熱處理10分鐘前用KOH將pH調(diào)為7.5。為了使酶失活，10分鐘內(nèi)將部分水解產(chǎn)物加熱到85℃。如例1將pH調(diào)為至少6.6后再進行下一步驟。
不同工藝參數(shù)到在下表中，其中示出了例1和2的水解產(chǎn)物制備方法。在所有情況下，乳清蛋白酪蛋白重量比為80∶20。
實施例3對于液體嬰兒配方，向例1的部分水解產(chǎn)物中加入乳糖和先溶解的礦物質(zhì)?；旌衔镌趽Q熱板中加熱到70℃。然后加入由甘油三棕櫚油酯，葵花籽油，椰子油，豆油，卵磷脂，甘油單和二酸酯及脂肪可溶維生素組成的脂肪。油熔化后再加入混合物中。預熱到約75℃后混合物中45秒鐘內(nèi)直接注入蒸汽，加熱到140℃后用冷卻板冷卻到70℃。然后分兩步均化，第一步在175巴下進行，第二步在35巴下進行?；旌衔镌俳?jīng)冷卻板冷卻到5-7℃并貯存在中間貯存罐中，該罐中加入了水可溶維生素。該工藝的主體產(chǎn)品熱凝固時間均超過30分鐘。該產(chǎn)品經(jīng)常用高壓滅菌系統(tǒng)滅菌。
所得液體組成如下肽 1.65%脂肪 3.60%碳水化合物 6.52%礦物質(zhì) 0.48%維生素 微量實施例4對于另一液體嬰兒配方，則用例2的部分水解產(chǎn)物按例1的方法制造，只是直接注入蒸汽溫度為121℃并且液體于145℃下滅菌4.97秒后無菌包裝在容器中。產(chǎn)品組成同于例3。
實施例5對于嬰兒配方奶粉，則用例1或2的部分水解產(chǎn)物按例3的方法制造，只是所得產(chǎn)品不注入高溫蒸汽而直接于125巴和50巴下進行2步均化。該奶粉基底物料可蒸發(fā)到50%固體后再噴霧干燥。
該奶粉組成如下肽 13.1%脂肪 28.6%碳水化合物 51.8%礦物質(zhì) 3.8%維生素 0.2%水分 2.5%
按例1-5的方法得到的嬰兒配方如下表所示表現(xiàn)出低抗原性。
*UF=超濾**NFDM=無脂肪干燥乳品***ED=電滲析實施例640位消費者評審團評價并比較基本如例4所述的本發(fā)明嬰兒配方和含有類似成分，但蛋白組分為部分水解的100%乳清蛋白的市售配方(Good StartTMIron Fortified Infant Formula，可從Carnation Company，Glendale，CA，USA得到)。樣品室溫下配給并由評審團評價。采用9點嗜好程度評定標準(9=極相似，1=極不相似)比較嬰兒配方的特殊感官特性如苦味，余味，口感以及整體香味評價。結果見下表。
本發(fā)明配方Good Start外觀7.36.7*香味4.03.3*風味濃度4.54.0
甜味4.84.1*奶味5.45.1奶油味5.04.5肉味4.44.1苦味3.63.6余味3.03.7總體評價4.23.6*受歡迎程度68%32%結論苦味8％苦味18％顏色差8％*表明95%信任程度下樣品間有明顯差異。
本發(fā)明配方明顯優(yōu)于Good Start。評審團成員的評價表明Good Start的苦味是導致本發(fā)明配方優(yōu)于Good Start的主要原因。
以上特別參照本發(fā)明優(yōu)選實施方案詳述了本發(fā)明，但應注意到在本發(fā)明構思和保護范圍內(nèi)還可進行各種改變和修飾。
權利要求
1.蛋白混合物的部分水解產(chǎn)物，其中該蛋白混合物包括乳清蛋白和酪蛋白并且該水解產(chǎn)物的水解程度為4-10%。
2.如權利要求1的部分水解產(chǎn)物，其中與相應的未被水解蛋白混合物相比，該水解產(chǎn)物經(jīng)ELISA測定的抗原性降低至少約80%。
3.如權利要求1的部分水解產(chǎn)物，其中與相應的未被水解蛋白混合物相比，該水解產(chǎn)物經(jīng)ELISA測定的抗原性降低至少約85%。
4.如權利要求1的部分水解產(chǎn)物，其中與相應的未被水解蛋白混合物相比，該水解產(chǎn)物經(jīng)ELISA測定的抗原性降低至少約90%。
5.如權利要求1的部分水解產(chǎn)物，其中與相應的未被水解蛋白混合物相比，該水解產(chǎn)物經(jīng)ELISA測定的抗原性降低至少約95%。
6.如權利要求1的部分水解產(chǎn)物，其中該蛋白混合物包括約60-約80Wt%乳清蛋白和約40-約20Wt%酪蛋白。
7.如權利要求1的部分水解產(chǎn)物，其中該蛋白混合物包括約40-約60Wt%乳清蛋白和約60-約40Wt%酪蛋白。
8.如權利要求1的部分水解產(chǎn)物，其中該水解產(chǎn)物平均分子量為2000，最大分子量為19000并且包括其分布如下的肽，以下按其摩爾質(zhì)量列出摩爾質(zhì)量 %分子量分布(g/mol)MM＞5000 8.25000＞MM＞3000 14.53000＞MM＞2000 15.82000＞MM＞1000 26.21000＞MM＞500 17.8MM＞500 17.5
9.蛋白混合物水解產(chǎn)物的制備方法，其中包括在可使水解程度達到4-10%的條件下將乳清蛋白和酪蛋白的混合物與包括至少1800USP胰蛋白酶單位/mg和至少350USP胰凝乳蛋白酶單位/mg的水懸浮液態(tài)酶混合物接觸。
10.如權利要求9的方法，其中胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶的USP單位之比為約1.5-10。
11.如權利要求9的方法，其中酶混合物量以混合物中蛋白重量計為約0.4-約1.2%。
12.如權利要求9的方法，其中該方法在溫度為約30℃-約50℃和pH為約6.5-約8.0的條件下進行約2-約6小時。
13.如權利要求9的方法，其中包括預處理步驟，該步驟又包括在約75℃-約85℃下將蛋白混合物加熱約10分鐘-約30分鐘。
14.如權利要求9的方法，其中該方法后續(xù)進行使酶混合物失活的另外步驟。
15.如權利要求9的方法，其中歷經(jīng)約10分鐘加熱到約85℃或歷經(jīng)45秒加熱到約130℃而使酶混合物失活。
16.如權利要求15的方法，其中該方法后續(xù)進行蒸發(fā)或噴霧干燥脫水的另外步驟。
17.嬰兒配方，其中包括蛋白混合物的部分水解產(chǎn)物，該蛋白混合物包括乳清蛋白和酪蛋白并且該水解產(chǎn)物的水解程度為4-10%。
18.如權利要求17的嬰兒配方，其中該嬰兒配方進行滅菌。
19.如權利要求17的嬰兒配方，其中該嬰兒配方進行高壓滅菌。
20.如權利要求17的嬰兒配方，其中該嬰兒配方呈粉狀。
21.如權利要求17的嬰兒配方，其中與相應的未被水解蛋白混合物比較，該嬰兒配方經(jīng)ELISA測定的抗原性降低至少約80%。
22.如權利要求17的嬰兒配方，其中與用部分水解乳清蛋白所得相應的配方相比，該嬰兒配方的味道得到改善。
全文摘要
本發(fā)明公開經(jīng)酶法水解得到的乳蛋白部分水解產(chǎn)物及用其制成的嬰兒配方。該水解產(chǎn)物的抗原性得以降低，要用乳清蛋白和酪蛋白的混合物得到該水解產(chǎn)物，其水解程度為4—10％。
文檔編號C12P21/06GK1105818SQ9410657
公開日1995年8月2日 申請日期1994年6月30日 優(yōu)先權日1993年6月30日
發(fā)明者S·B·馬丁內(nèi)茲, 小·H·L·李爾利, D·J·尼科斯 申請人:布里斯托爾-邁爾斯斯奎布公司