專(zhuān)利名稱(chēng)：：降血壓的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新穎肽的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
：高血壓是人中相對(duì)常見(jiàn)的疾病，并代表了心血管疾病、腎衰竭和中風(fēng)的主要風(fēng)險(xiǎn)因素。大量藥物產(chǎn)品(鈣阻斷劑、e阻斷劑、利尿藥、a阻斷劑、中央a拮抗劑、血管緊張素II拮抗劑和ACE抑制劑)的可用性說(shuō)明高血壓的根本生理學(xué)機(jī)制是多方面的。在高血壓的生理機(jī)制中，腎素-血管緊張素機(jī)制特別地受到大量的科學(xué)關(guān)注。在該機(jī)制中，血管緊張素由肝分泌，并被肽酶腎素切割產(chǎn)生無(wú)生物活性的十肽血管緊張素I。當(dāng)血管緊張素I經(jīng)過(guò)肺毛細(xì)管時(shí)，稱(chēng)為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(下文稱(chēng)作ACE)的另一肽酶作用于血管緊張素I，將血管緊張素I的最后兩個(gè)殘基(His-Leu)去除形成辛肽血管緊張素H。血管緊張素II辛肽顯示強(qiáng)烈的血管收縮活性，從而提高血壓。導(dǎo)致較低水平血管緊張素II的ACE抑制阻止血管收縮，從而阻止高血壓。除切割血管緊張素外，ACE還可水解緩激肽——也參與血壓調(diào)節(jié)的一種九肽。在后一機(jī)制中，ACE抑制引起提高的緩激肽原水平，這也促進(jìn)血管舒張并降低血壓。抑制ACE因此通過(guò)至少兩個(gè)分離的機(jī)制導(dǎo)致血壓降低效應(yīng)。還已知辛肽血管緊張素II刺激腎上腺皮質(zhì)釋放醛固酮。醛固酮的靶器官是腎，在那里醛固酮促進(jìn)提高的從腎小管的鈉再吸收。ACE抑制還通過(guò)該第三種機(jī)制降低血壓，但是在該情況下是通過(guò)減少鈉的再吸收。由于多重的生理學(xué)效應(yīng)，抑制ACE的蛋白質(zhì)水解活性是降低血壓的有效途徑。該觀察結(jié)果導(dǎo)致大量有效的藥物性降血壓產(chǎn)品，例如卡托普利(captopril)禾口依那普禾lj(enalapril)(Ondetti,M.A.etal.,1977,Science,WashingtonDC,196,441-444)。因?yàn)楦哐獕菏窍鄬?duì)常見(jiàn)的疾病狀態(tài)，因此用溫和活性的天然成分對(duì)抗現(xiàn)代生活方式的這種不期望的結(jié)果會(huì)是有利的。特別溫和的活性天然成分可被摻入食品或飲品中，因?yàn)檫@類(lèi)產(chǎn)物是例行被消耗的?；蛘哌@類(lèi)^M和活性的天然成分可以被摻入飲食添加物中。最近十年內(nèi)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在于經(jīng)發(fā)酵乳中的特異肽具有ACE抑制能力，并能在高血壓受試者中降低血壓。現(xiàn)在，大量體外實(shí)驗(yàn)和一些動(dòng)物試驗(yàn)已經(jīng)證明得自多種蛋白質(zhì)來(lái)源的不同肽的ACE抑制效應(yīng)。盡管體外ACE抑制測(cè)定法已經(jīng)揭示許多不同的肽序列，但是需要強(qiáng)調(diào)ACE抑制肽需要在血中循環(huán)以顯示體內(nèi)效應(yīng)。意義在于有效的ACE抑制肽應(yīng)當(dāng)?shù)挚刮改c蛋白質(zhì)水解消化體系的降解并應(yīng)當(dāng)在隨后穿過(guò)腸壁的轉(zhuǎn)運(yùn)中保持完整。多種ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)-功能研究提示它們常在C端序列中具有Pro-Pro、Ala-Pro或Ala-Hyp(Maruyama,S.andSuzuki,H.,1982;AgricBiolChem.,46(5):1393-1394)。ACE是不能切割脯氨酸相關(guān)肽鍵的肽基二肽酶(EC3.4.15.1)的事實(shí)部分地揭示了上述發(fā)現(xiàn)。因此，不能從具有Xaa-Pro-Pro結(jié)構(gòu)的三肽去除二肽Pro-Pro,因?yàn)閄aa-Pro鍵不能被切割。因此可以想像以相對(duì)高的濃度存在時(shí)，具有Xaa-Pro-Pro結(jié)構(gòu)的三肽會(huì)抑制ACE活性。因?yàn)椴粌HACE，而且所有的蛋白質(zhì)水解酶都在切割Xaa-Pro或Pm-Pro鍵時(shí)有困難，因此肽羧基端存在(多)脯氨酸殘基導(dǎo)致相對(duì)抗蛋白酶的分子的概念幾乎是不證自明的。含羥脯氨酸(Hyp)代替脯氨酸的相似肽是相對(duì)抗蛋白酶的。由此可推斷羧基端帶有一個(gè)或多個(gè)(羥基)脯氨酸殘基的肽很可能在胃腸道中免受蛋白水解降解。這些結(jié)論會(huì)幫助我們理解特異ACE抑制肽可觀的體內(nèi)降血壓效應(yīng)它們不僅滿足了ACE抑制的結(jié)構(gòu)需要，而且抵抗胃腸蛋白水解消化系統(tǒng)的降解，并在隨后穿過(guò)腸壁轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)保持完整。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)三肽Leu-Pro-Pro(JP02036127)、Val-Pro-Pro(EP0583074)和Ile-Pro-Pro(J.DairySci.,78:777-7831995))具有強(qiáng)烈的ACE抑制活性。最初所有的ACE抑制肽根據(jù)它們對(duì)ACE活性的體外效應(yīng)被表征，三肽Ile-Pro-Pro(下文稱(chēng)作IPP)、Val-Pro-Pro(下文稱(chēng)作VPP)禾卩Leu-Pro-Pro(下文稱(chēng)作LPP)因?yàn)樗鼈儚?qiáng)烈的ACE抑制效應(yīng)(其引起相對(duì)低的IC50值)而與眾不同。后來(lái)，三肽VPP和IPP的推測(cè)的抗高血壓效應(yīng)可在自發(fā)性高血壓大鼠中被證實(shí)(Nakamuraetal.,J.DairySci.,78:12531257(1995))。在這些實(shí)施方案中，抑制性三肽來(lái)自經(jīng)乳酸細(xì)菌發(fā)酵的乳。在乳發(fā)酵中，所需肽由蛋白酶生產(chǎn)，所述蛋白酶由生長(zhǎng)的乳酸細(xì)菌生產(chǎn)。ACE抑制肽已通過(guò)電滲析、中空纖維膜透析或色譜方法從經(jīng)發(fā)酵的乳產(chǎn)物中濃縮，使得它們能夠以濃縮的飲食添加物(如片劑或錠劑)形式被銷(xiāo)售o
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及新穎的三肽MAP和/或ITP或MAP鹽和/或ITP鹽。本發(fā)明還涉及包含MAP和/或ITP或MAP鹽和/或ITP鹽的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物具有5%到50%的DH，更優(yōu)選地為10%到40%,最優(yōu)選地20%到35%的DH。另外，本發(fā)明涉及包含MAP和/或ITP或MAP鹽和/或ITP鹽的肽混合物。優(yōu)選地，該肽混合物包含至少1mgMAP/克蛋白質(zhì)，更優(yōu)選地至少2mg/g和最優(yōu)選地至少4mg/克蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，肽混合物還包含LPP禾n/或IPP。因此，肽混合物還優(yōu)選地包含至少1mgIPP/克蛋白質(zhì)，更優(yōu)選地至少2mg/g和最優(yōu)選地至少4mg/克蛋白質(zhì)，和/或肽混合物還優(yōu)選地包含至少1mgLPP/克蛋白質(zhì)，更優(yōu)選地至少2mg/g和最優(yōu)選地至少4mg/克蛋白質(zhì)。該肽混合物優(yōu)選地包含至少30wt%(干物質(zhì))的肽具有小于500Da的MW，更優(yōu)選地肽混合物的35%到70%wt(干物質(zhì))是具有小于500DaMW的肽。另外，本發(fā)明涉及生產(chǎn)MAP禾口/或ITP的酶方法，優(yōu)選地通過(guò)酶水解蛋白質(zhì)源來(lái)生產(chǎn)。發(fā)明詳述如本申請(qǐng)中所示，三肽MAP和ITP在抑制ACE時(shí)是非常有效的。這些抑制效應(yīng)對(duì)應(yīng)于驚人低的IC50值，在本文實(shí)驗(yàn)部分測(cè)定為分別是MAP為0.4和ITP是10(以mM計(jì))。另夕卜，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)肽MAP和I丁P均抵抗胃腸蛋白水解降解，因此被期望在人腸道中是穩(wěn)定的。因此三肽MAP和/或三肽ITP及其鹽非常適用于有效的ACE抑制，并可在例如功能性食物中被用作營(yíng)養(yǎng)藥物或藥物。本文使用術(shù)語(yǔ)營(yíng)養(yǎng)藥物是指在應(yīng)用的營(yíng)養(yǎng)學(xué)和藥物學(xué)領(lǐng)域中均有有用性。因此，包含MAP和減ITP的新穎營(yíng)養(yǎng)藥物性組合物可用作食物或飲料的添加物和用作用于腸內(nèi)或腸胃外應(yīng)用的藥物配方或藥物，其可以是固體配方如膠囊或片劑，或液體配方如溶液、懸液或乳劑。三肽MAP(Met-Ala-Pro)和ITP(Ile-Thr-Pro)可通過(guò)多種方法制備，所述方法包括化學(xué)合成、酶水解和含蛋白質(zhì)的溶液發(fā)酵。在復(fù)雜的混合物(如蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物或得自發(fā)酵的液體)中鑒定生物活性肽是具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。除基本的問(wèn)題(是否使用正確的蛋白質(zhì)底物、是否使用正確的酶、是否使用正確的微生物培養(yǎng)物)夕卜，可期望含數(shù)千種肽的復(fù)雜樣品中存在若干生物活性肽。使用重復(fù)循環(huán)高效液相色譜(HPLC)分級(jí)和生物化學(xué)評(píng)價(jià)的傳統(tǒng)鑒定途徑通常是費(fèi)時(shí)的并且易于丟失存在的生物活性肽，使得相關(guān)生物活性的檢測(cè)極度困難。在本發(fā)明中使用非常復(fù)雜的設(shè)備并篩選許多不同的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物和發(fā)酵培養(yǎng)基，這最終導(dǎo)致我們鑒定了具有ACE抑制特征的兩個(gè)新肽MAP禾nITP。在我們的途徑中，連續(xù)流動(dòng)生物化學(xué)測(cè)定法與HPLC分級(jí)體系聯(lián)機(jī)配對(duì)(coupledonline)。HPLC柱流出物在連續(xù)流動(dòng)ACE生物測(cè)定法和化學(xué)分析技術(shù)(質(zhì)譜法)之間分流。粗水解產(chǎn)物和發(fā)酵培養(yǎng)基通過(guò)HPLC分離，之后借助于聯(lián)機(jī)生物化學(xué)測(cè)定法檢測(cè)生物活性化合物的存在。連續(xù)記錄質(zhì)譜圖，使得當(dāng)肽在生物化學(xué)測(cè)定中顯示活性信號(hào)時(shí)可立即獲得結(jié)構(gòu)信息。通過(guò)上述途徑鑒定的三肽MAP和ITP可通過(guò)多種方法產(chǎn)生，包括經(jīng)濟(jì)學(xué)有活力的生產(chǎn)途徑。如例如"Peptides:ChemistryandBiology"byN.SewaldandH.D.Jakubke,Eds.Wiley-VCHVerlagGmbH,2002，Chapter4中所述，使用常規(guī)技術(shù)通過(guò)化學(xué)合成生產(chǎn)是可能的。適用于大規(guī)模生產(chǎn)的化學(xué)肽合成的具體成本有效的方法基于烷基氯甲酸鹽或pivaloylchlonde用于激活羧基的用途，以及甲基酯用于C端保護(hù)的用途和芐氧羰基(Z)或叔丁氧羥基用于N保護(hù)的用途。例如在MAP的情況下，L-脯氨酸甲基酯可以與異丁基氯甲酸鹽激活的Z-Ala偶聯(lián)；產(chǎn)生的二肽可以使用氫和Pd在C上通過(guò)氫解來(lái)Z-去保護(hù)，并再次與異丁基氯甲酸鹽激活的Z-Met偶聯(lián)；在產(chǎn)生的三肽中，使用NaOH水解甲基酯，并在通過(guò)氫解Z-去保護(hù)后獲得三肽Met-Ala-Pro。相似地，可合成Ile-Thr-Pro，但是在偶聯(lián)反應(yīng)中Thr的羥基功能需要芐基保護(hù)；然后在最后的歩驟中，在Z-去保護(hù)時(shí)將該基團(tuán)同時(shí)去除。MAP禾n/或ITP也可通過(guò)酶水解或發(fā)酵途徑，使用含有氨基酸序列MAP和/或ITP的任何蛋白質(zhì)底物制造。有利地，蛋白質(zhì)底物含有MAP和ITP二者。這類(lèi)酶或發(fā)酵途徑優(yōu)選的底物是牛乳或牛乳的酪蛋白級(jí)分。通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵或水解條件，可最大化生物活性分子MAP和/或ITP的產(chǎn)生。嘗試最大化產(chǎn)生的技術(shù)人員會(huì)知道如何調(diào)節(jié)所述方法的參數(shù)，例如水解/發(fā)酵時(shí)間、水解/發(fā)酵溫度、酶/微生物類(lèi)型和濃度等。有利地，MAP和/或ITP或包含MAP和/或ITP的組合物是水解產(chǎn)物，并優(yōu)選根據(jù)涉及以下步驟的方法制造(a)酶水解其氨基酸序列中包含MAP或ITP的合適蛋白質(zhì)底物，得到包含三肽MAP和/或ITP的經(jīng)水解蛋白質(zhì)產(chǎn)物；(b)從經(jīng)水解的蛋白質(zhì)產(chǎn)物中分離富含三肽MAP和/或三月太I(xiàn)TP的級(jí)分；和任選地(c)濃縮和/或干燥來(lái)自步驟b)的級(jí)分以得到富含三肽MAP和/或三肽ITP的濃縮液體或固體。酶水解步驟(a)可以是引起蛋白質(zhì)水解、導(dǎo)致MAP和域ITP三肽釋放的對(duì)合適蛋白質(zhì)底物的任何酶處理。盡管若干種酶組合可用于從蛋白質(zhì)底物中釋放所需三肽，但是本方法中所使用的優(yōu)選酶是脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶或脯氨酸特異寡肽酶。合適的蛋白質(zhì)底物可以是包含氨基酸序列MAP和/或ITP的任何底物。已知包含MAP的蛋白質(zhì)底物是例如酪蛋白、小麥谷蛋白、向日葵蛋白質(zhì)分離物、稻蛋白、卵蛋白。優(yōu)選地，合適的蛋白質(zhì)底物包含氨基酸序列AMAP或PMAP，如存在于牛P-酪蛋白、小麥谷蛋白的a-麥醇溶蛋白級(jí)分和向日葵蛋白質(zhì)分離物2S級(jí)分中的。酪蛋白底物可以是含有大量0-酪蛋白和a-s2-酪蛋白的任何材料。合適底物的實(shí)例是乳以及酪蛋白、酪蛋白粉末、酪蛋白粉末濃縮物、酪蛋白粉末分離物，或P-酪蛋白，或a-s2-酪蛋白。優(yōu)選地，底物具有高含量的酪蛋白，例如酪蛋白蛋白質(zhì)分離物(CPI)。酶可以是能夠水解蛋白質(zhì)(例如P-酪蛋白和/或a-s2-酪蛋白)導(dǎo)致一種或多種三肽MAP和/或ITP釋放的任何酶或酶組合物。分離步驟(b)可以以技術(shù)人員已知的任何途徑進(jìn)行，例如通過(guò)沉淀、過(guò)濾、離心、抽提或色譜及其組合。優(yōu)選地，分離步驟(b)使用微濾或超濾技術(shù)進(jìn)行。過(guò)濾步驟中使用的膜孔尺寸以及膜的電荷可用于控制三肽MAP和/或三肽ITP的分離。使用帶電的UF/NF膜對(duì)酪蛋白水解產(chǎn)物分級(jí)描述于Y.Poilotetal,JournalofMembraneScience158(1999)105-114。濃縮步驟(c)可涉及納米過(guò)濾或蒸發(fā)通過(guò)步驟(b)產(chǎn)生的級(jí)分，以產(chǎn)生高度濃縮的液體。被合適地配制時(shí)(例如具有低水活性(Aw)、{氏pH和優(yōu)選地如苯甲酸鹽或山梨酸鹽的防腐劑)，這類(lèi)濃縮液體組合物形成儲(chǔ)存本發(fā)明三肽的吸引人的方式。任選地，蒸發(fā)步驟之后進(jìn)行干燥步驟，例如通過(guò)噴霧干燥或冷凍干燥產(chǎn)生含高濃度MAP和/或ITP的固體。優(yōu)選地，酶方法包含一個(gè)單酶孵育步驟。根據(jù)本發(fā)明的該酶方法還涉及脯氨酸特異蛋白酶的使用，所述脯氨酸特異蛋白酶優(yōu)選地不含酶活性。脯氨酸特異蛋白酶定義為水解脯氨酸羧基端一側(cè)的肽鍵。優(yōu)選的脯氨酸特異蛋白酶是水解脯氨酸和丙氨酸殘基羧基端側(cè)肽鍵的蛋白酶。優(yōu)選地，脯氨酸特異蛋白酶能夠水解大的蛋白質(zhì)分子，如多肽或蛋白質(zhì)自身。根據(jù)本發(fā)明的方法通產(chǎn)具有少于24小時(shí)的孵育時(shí)間，優(yōu)選地孵育時(shí)間少于10小時(shí)，更優(yōu)選地少于4小時(shí)。孵育溫度通常是高于30°C，優(yōu)選地高于40°C，更優(yōu)選地高于5(TC。本發(fā)明的另一方面是從經(jīng)水解的蛋白質(zhì)中純化和/或分離三肽MAP和ITP。優(yōu)選地，大部分本發(fā)明的經(jīng)水解蛋白質(zhì)能夠在所選擇的pH條件下沉淀。該純化方法包含將pH改變?yōu)榇蟛糠纸?jīng)水解的和未水解的蛋白質(zhì)沉淀的pH，和從溶液中殘留的(生物活性)三肽中分離經(jīng)沉淀的蛋白質(zhì)。為了獲得羧基端具有脯氨酸殘基的本發(fā)明三肽，使用能夠在羧基端側(cè)脯氨酸殘基處切割的蛋白酶提供優(yōu)選的選項(xiàng)。所謂的脯氨酰寡肽酶(EC3.4.21.26)具有優(yōu)先在脯氨酸殘基的羧基側(cè)切割肽的獨(dú)特可能性。脯氨酰寡肽酶也具有在丙氨酸殘基的羧基側(cè)切割肽的可能性，但是后一反應(yīng)不如涉及脯氨酸殘基的切割肽鍵有效。在分離自哺乳動(dòng)物及微生物來(lái)源的所有充分表征的脯氨酸特異蛋白酶中，已鑒定一個(gè)獨(dú)特的肽酶結(jié)構(gòu)域，其從酶活性位點(diǎn)排除了大肽。事實(shí)上，這些酶不能降解含有多于30個(gè)氨基酸殘基的肽，因此現(xiàn)在這些酶被稱(chēng)為"脯氮酰寡肽酶"(Fulopetal:Cell,Vol.94，161-170,July24,1998)。因此，在它們可以顯示其水解作用之前，這些脯氨酰寡肽酶需要用其他內(nèi)蛋白酶的預(yù)水解。然而，如WO02Z45523中所述，甚至脯氨酰寡肽酶與這類(lèi)其他內(nèi)蛋白酶的組合也導(dǎo)致下述水解產(chǎn)物，所述水解產(chǎn)物表征為顯著增強(qiáng)的、具有羧基端脯氨酸殘基的肽的比例。因此，這類(lèi)水解產(chǎn)物形成了用于分離下述三肽的極佳起始點(diǎn)，所述三肽具有體外ACE抑制效應(yīng)和對(duì)胃腸蛋白水解降解經(jīng)改進(jìn)的抗性。"肽"或"寡肽"在本文定義為至少兩個(gè)通過(guò)肽鍵連接的氨基酸的鏈。術(shù)語(yǔ)"肽"和"寡肽"被認(rèn)為是同義的(如其通常被認(rèn)為的)，并且每個(gè)術(shù)語(yǔ)可根據(jù)語(yǔ)境的需要交換使用。"多肽"在本文中定義為含有多于30個(gè)氨基酸殘基的鏈。根據(jù)普遍實(shí)踐，木文中所有的(寡)肽和多肽式或序列從左向右書(shū)寫(xiě)為氨基端到羧基端的方向。本文使用的單字母密碼為本領(lǐng)域普遍已矢口，可見(jiàn)于Sambrook,etal.(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nd,ed.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor，NY，1989)。肽混合物是包含至少30%wt(干物質(zhì))肽的組合物，其以基礎(chǔ)KjeWahlNitrogen為基礎(chǔ)結(jié)合具有小于3500Da的MW的肽的測(cè)定而測(cè)定。內(nèi)蛋白酶在本文定義為以?xún)?nèi)切方式水解多肽中肽鍵并屬于EC3.4的酶。內(nèi)蛋白酶根據(jù)催化機(jī)制被分為亞-亞類(lèi)。存在絲氨酸內(nèi)蛋白酶(EC3.4.21)、半胱氨酸內(nèi)蛋白酶(EC3.4.22)、天冬氨酸內(nèi)蛋白酶(EC3.4.23)、金屬內(nèi)蛋白酶(EC3.4.24)和蘇氨酸內(nèi)蛋白酶(EC3.4.25)的亞-亞類(lèi)。內(nèi)蛋白酶在本文中定義為水解鄰近末端a-氨基("氨基肽酶")或末端羧基和次末端氨基酸之間肽鍵("羧肽酶")的酶。WO02/45524描述了可得自黑曲霉U^wg"/1^m'ge。的脯氨酸特異蛋白酶。來(lái)自黑曲霉的酶優(yōu)先在脯氨酸的羧基端切割，但是也可在羥脯氨酸的羧基端切割和以較低效率在丙氨酸的羧基端切割。WO02/45524還教導(dǎo)該來(lái)自黑曲霉的酶和已知的來(lái)自其他微生物或哺乳動(dòng)物來(lái)源的脯氨酰寡肽酶之間不存在清晰的同源性。與已知的脯氨酰寡肽酶相反，黑曲霉酶具有酸性的pH最適度。盡管已知的脯氨酰寡肽酶以及來(lái)自黑曲霉的酶是所謂的絲氨酸蛋白酶，但是我們?cè)诖孙@示(實(shí)施例)黑曲霉酶屬于完全不同的亞家族。經(jīng)分泌的黑曲霉酶顯示是絲氨酸肽酶家族S28的成員，而不是大部分胞質(zhì)脯氨酰寡肽酶被歸入其中的S9家族(Rawling.N.D.andBarrett,A丄;Biochim.Biophys.Acta1298(1996)1-3)。在實(shí)施例2中，我們顯示來(lái)自黑曲霉的脯氨酸特異蛋白酶的pH和溫度最適度。在實(shí)施例3中，我們闡述了來(lái)自黑曲霉的脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶用于切割脯氨酸和丙氨酸殘基羧基端的高度偏好。另外，我們?cè)谠搶?shí)施例中證明本發(fā)明方法中使用的來(lái)自黑曲霉的酶制劑優(yōu)選地是基本純凈的，即不存在除純凈的脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶固有的內(nèi)切蛋白水解活性外的顯著的內(nèi)蛋白酶活性。我們還證明根據(jù)本發(fā)明所優(yōu)選使用的我們的來(lái)自黑曲霉的酶制劑不含有任何外切蛋白水解活性，更特別地不含氨基肽水解的副作用。優(yōu)選地，在本發(fā)明方法中使用的來(lái)自黑曲霉的酶制劑中沒(méi)有外切蛋白水解活性。"脯氨酸特異內(nèi)切蛋白水解活性基本上不存在于非重組的曲霉菌株中"的見(jiàn)解的實(shí)驗(yàn)證據(jù)可見(jiàn)于WO02/45524，也闡述于本發(fā)明的實(shí)施例3中。由于本發(fā)明的方法通過(guò)將酪蛋白底物僅與脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶孵育是可能的，因此最佳的孵育條件如溫度、pH等可以被容易地選擇，并不必需固定為亞最佳條件，如在使用兩種或更多酶的情況下時(shí)。另外，另外，防止形成不需要的副產(chǎn)物(例如造成培養(yǎng)基異味的額外的、非生物活性肽或游離氨基酸)。在選擇反應(yīng)條件上具有更大程度的自由使得可能更容易選擇其他標(biāo)準(zhǔn)。例如，現(xiàn)在相對(duì)于隨后對(duì)蛋白質(zhì)沉淀步驟而言，選擇對(duì)微生物感染和最佳pH條件較不敏感的條件容易得多。在實(shí)施例4中，我們顯示曲霉酶不是寡肽酶，而是能夠水解完整蛋白質(zhì)、大肽以及較小肽分子而不需要附加的內(nèi)蛋白酶的真正內(nèi)肽酶。該新穎的、驚人的發(fā)現(xiàn)打開(kāi)了使用黑曲霉酶制備具有空前高肽(帶有羧基端脯氨酸殘基)含量的水解產(chǎn)物的可能性，因?yàn)椴恍枰郊拥膬?nèi)蛋白酶。這類(lèi)新的水解產(chǎn)物可以從不同的蛋白質(zhì)性起始材料(來(lái)自植物或動(dòng)物來(lái)源)制備。這類(lèi)起始材料的實(shí)例為酪蛋白、明膠、魚(yú)或卵蛋白、小麥谷蛋白、大豆和豌豆蛋白以及稻蛋白和向日葵蛋白。因?yàn)榧褐c在高血壓中起重要作用，制備ACE抑制肽的優(yōu)選底物是這些蛋白質(zhì)的鈣鹽和鉀鹽而不是鈉鹽。來(lái)自黑曲霉的脯氨酰內(nèi)蛋白酶的pH最適度是4.3左右(見(jiàn)圖1)。因?yàn)樵摰蚿H最適度，將牛乳酪蛋白酸鹽與來(lái)自黑曲霉的脯氨酰內(nèi)蛋白酶孵育不是不證自明的。如果pH低于6.0，則牛乳酪蛋白酸鹽會(huì)沉淀，但是在pH6.0時(shí)黑曲霉酶僅有有限活性。然而，我們?cè)趯?shí)施例5中顯示即使在這個(gè)非常惡劣的條件下，與來(lái)自黑曲霉的脯氨酰內(nèi)蛋白酶孵育能夠產(chǎn)生若干已知的ACE抑制肽，例如IPP和LPP。非常驚人的是在這些條件下不產(chǎn)生VPP。牛乳酪蛋白摻合大量不同的蛋白質(zhì)，包括P酪蛋白和k酪蛋白。根據(jù)已知的氨基酸序列，13酪蛋白包括ACE抑制性三肽IPP、VPP和LPP。k酪蛋白僅包括IPP。來(lái)自黑曲霉的酶不含有任何可測(cè)量的氨肽酶活性的事實(shí)強(qiáng)烈地提示所形成的IPP是從存在于k酪蛋白中的-A107-1108-P109-P110-序列中釋放的?？赏茰y(cè)IPP羧基端肽鍵被來(lái)自黑曲霉的內(nèi)蛋白酶的主要活性切割，而之前Ala-Ile鍵的切割通過(guò)其Ala特異的副活性完成。相似地，VPP的缺失可以根據(jù)氨肽酶副活性的缺失來(lái)解釋。vpp包含在e酪蛋白的序列-P8rV82-V83-Vs4-P85-P中。因此，脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶切除VVVPP序列但是不能釋放VPP。這些結(jié)果基于將酪蛋白酸鹽與來(lái)自黑曲霉的內(nèi)蛋白酶在簡(jiǎn)單的一步方法中孵育而獲得。含有蛋白質(zhì)的水性溶液對(duì)微生物感染高度敏感，特別是當(dāng)其在大于5.0的pH下和在5(TC或低于5(TC的溫度下保持?jǐn)?shù)小時(shí)時(shí)。特別地，在這類(lèi)延長(zhǎng)的孵育步驟中可形成微生物毒素并很可能在隨后的加熱歩驟中幸存，形成對(duì)食品級(jí)別方法的可能威脅。優(yōu)選地，本發(fā)明使用大于5(TC的孵育溫度。結(jié)合所述一步酶過(guò)程(其中酶孵育進(jìn)行少于24小時(shí)的階段，優(yōu)選少于8小時(shí)，更優(yōu)選地少于4小時(shí))，根據(jù)本發(fā)明的方法提供經(jīng)改進(jìn)的微生物穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn)。使用本發(fā)明的酶-底物比例，結(jié)合高溫度條件，IPP和LPP的切除在3小時(shí)的孵育階段中完成。因?yàn)锳CE抑制肽IPP和LPP可以使用單一的、基本上純凈的內(nèi)蛋白酶從酪蛋白切除，所以本發(fā)明造成與技術(shù)背景方法中相比更小數(shù)量的水溶性肽。在這些水溶性肽中，IPP和LPP以主要量存在。在需要高濃度ACE抑制三肽而不需要其他(通常較低活性的化合物)的情況下，這尤其重要。根據(jù)本方法，蛋白質(zhì)中存在的至少20%，更優(yōu)選地至少30%，最優(yōu)選地至少40%的-I-P-P-或-L-P-P-序列分別被轉(zhuǎn)化為三肽IPP或LPP。在實(shí)施例6中，我們闡述通過(guò)新的、驚人的純化步驟的生物活性肽的5倍純化效應(yīng)。該純化方法的基礎(chǔ)由來(lái)自黑曲霉的脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶的獨(dú)特特征形成。與該酶的孵育將底物分子最具生物活性的部分以水溶性三肽的形式釋放。底物分子的無(wú)生物活性或較低生物活性的部分在很大程度上保持未經(jīng)切割，從而是底物分子更大的肽或多肽部分。由于這些較大的肽或多肽部分在選定的pH條件下有限的水溶性，底物的這些無(wú)生物活性或較低生物活性的部分可從可溶得多的生物活性三肽中容易地被分離。在該過(guò)程中，最初的水解產(chǎn)物在55°C、pH6.0的短暫酶孵育階段中形成，然后被任選地加熱至大于8(TC的溫度以殺死所有污染微生物并滅活來(lái)自黑曲霉的脯氨酰內(nèi)肽酶。隨后將水解產(chǎn)物酸化，實(shí)現(xiàn)pH降至4.5或至少低于5.0。在該pH值(其不能用于滅活來(lái)自黑曲霉的脯氨酰內(nèi)肽酶，因?yàn)槠浯砹嗽撁傅淖钸m條件)下，來(lái)自酪蛋白酸鹽的所有大肽沉淀，從而僅較小的肽殘留在溶液中。由于沉淀的酪蛋白酸鹽可通過(guò)傾析或過(guò)濾步驟或低速(即低于5000rpm)離心容易地去除，因此水相含有相對(duì)于存在的蛋白質(zhì)數(shù)量高比例的生物活性肽。根據(jù)KjddaW數(shù)據(jù)，通過(guò)低速離心步驟，80%到70%的酪蛋白酸鹽蛋白質(zhì)被去除，意味著ACE抑制肽四倍或五倍的純化。我們發(fā)現(xiàn)該純化原理可有利地被應(yīng)用，以獲得得自除酪蛋白以外的蛋白質(zhì)性材料的生物活性肽。另外，酶產(chǎn)生的水解產(chǎn)物和由合適微生物發(fā)酵的蛋白質(zhì)均能夠根據(jù)本方法被分離和純化。在與底物沉淀、酶仍然有活性的pH接近的pH值孵育酶和底物會(huì)允許該純化步驟進(jìn)行。因?yàn)閬?lái)自黑曲霉的脯氨酰內(nèi)蛋白酶的低pH最適度，能夠認(rèn)為底物在pH1.5到6.5的范圍內(nèi)沉淀?？紤]到它們特異的沉淀行為，谷蛋白在高于pH3.5沉淀，向日葵蛋白在高于pH4.0、低于pH6.0沉淀，卵白在高于pH3.5、低于pH5.0沉淀，這形成經(jīng)水解的蛋白質(zhì)沉淀和經(jīng)沉淀的蛋白質(zhì)可從經(jīng)水解的蛋白質(zhì)或肽中分離的條件的實(shí)例。傾析、過(guò)濾或低速離心后，能夠以純化的狀態(tài)回收含有生物活性肽的上清液。隨后的蒸發(fā)和噴霧干燥步驟會(huì)產(chǎn)生用于獲得具有高生物活性的食品級(jí)別糊劑或粉末的經(jīng)濟(jì)途徑。根據(jù)所述方法消化酪蛋白酸鹽后，獲得具有高濃度ACE抑制肽的白色、無(wú)味粉末?；蛘呖墒褂谜舭l(fā)或納米過(guò)濾進(jìn)一步濃縮生物活性肽。通過(guò)提高水活性結(jié)合pH調(diào)節(jié)和添加食品級(jí)別防腐劑(如苯甲酸鹽或山梨酸鹽)配制這類(lèi)濃縮物會(huì)得到微生物學(xué)穩(wěn)定的、食品級(jí)別的、降血壓肽的液體濃縮物。如果適當(dāng)?shù)叵♂屩琳_的三肽濃度，可獲得通用起始材料，其適用于制造具有ACE抑制特征的所有種類(lèi)的食物和飲料。需要時(shí)在傾析、過(guò)濾或低速離心后獲得的上清液可被進(jìn)一步加工以改善最終產(chǎn)物的味道。例如，上清液可與粉末狀的激活的活性炭接觸，隨后是去除活性炭的過(guò)濾步驟。為了最小化最終產(chǎn)物的苦味，傾析、過(guò)濾或低速離心后獲得的上清液還可進(jìn)行與另一蛋白酶(例如枯草桿菌蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶或谷氨酸特異的內(nèi)蛋白酶)的孵育。需要時(shí)，生物活性成分MAP和/或ITP的濃度可通過(guò)隨后的純化步驟被進(jìn)一步地提高，所述純化步驟中使用三肽MAP和ITP的特異親水/疏水性質(zhì)。優(yōu)選的純化方法包括納米過(guò)濾(根據(jù)尺寸分離)、用例如己垸或丁醇萃取然后蒸發(fā)/沉淀或接觸用色譜樹(shù)脂從AmberliteXAD范圍(Roehm)獲得的經(jīng)酸化水解產(chǎn)物。還可以使用由Pharmacia提供的丁酰-瓊脂糖樹(shù)脂。在實(shí)施例7中，我們描述使用來(lái)自黑曲霉的脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶結(jié)合新的肽純化方法制備的酪蛋白中新穎的ACE抑制肽MAP和ITP的鑒定。只有將該單一的、(基本純凈的)內(nèi)蛋白酶與大比例的無(wú)生物活性肽和高度復(fù)雜的分離和鑒定設(shè)備組合使用，才能允許我們追蹤并鑒定這些新穎的ACE抑制三肽。在根據(jù)實(shí)施例7(在沉淀后)制備的、來(lái)自酪蛋白的生物活性肽(CDBAP)中，三肽MAP禾nITP被鑒定為數(shù)量對(duì)應(yīng)于2.9mgMAP/克CDBAP(4.8mgMAP/克CDBAP中的蛋白質(zhì))和0.9mgITP/克CDBAP(1.4mgITP/克CDBAP中的蛋白質(zhì))。CDBAP的另一特征在于其格外高的、以摩爾數(shù)計(jì)24%的脯氨酸含量。該實(shí)施例7中描述的測(cè)試闡述了經(jīng)改進(jìn)的Matsui測(cè)試中兩種新穎三肽的非常低的IC50值，即MAP為0.5micromoi/l,ITP為10micromol/1。如果我們意識(shí)到已知最有效的天然ACE抑制肽IPP在該經(jīng)改進(jìn)的Matsui測(cè)試中具有2.0micromol/1的IC50值，該發(fā)現(xiàn)就更令人驚訝了。根據(jù)本方法，優(yōu)選地至少20%，更優(yōu)選地至少30。％，最優(yōu)選地至少40X的存在于蛋白質(zhì)中的-M-A-P-或-I-T-P-序列被分別轉(zhuǎn)化為三肽MAP或ITP。實(shí)施例8中進(jìn)一步闡述了新鑒定的ACE抑制肽MAP和ITP的有用性。在后一實(shí)施例中，我們顯示兩種肽均在模擬典型地存在于胃腸道的消化條件的條件下幸存。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，我們推斷新穎的三肽很可能在哺乳動(dòng)物(例如人)的胃腸道中幸存，意味著用于治療高血壓的可觀的經(jīng)濟(jì)潛力。在實(shí)施例9中，我們證明高級(jí)的ACE抑制肽MAP不僅能在酶水解實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生，而且可以在用適當(dāng)?shù)氖称芳?jí)別微生物發(fā)酵的乳制劑中檢測(cè)。然而，我們不能證明這類(lèi)經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)物中肽ITP的存在。額外的(例如色譜)純化步驟之前或之后獲得的肽MAP和/或ITP可用于整合進(jìn)以常規(guī)基礎(chǔ)被消耗的食品產(chǎn)物中。這類(lèi)產(chǎn)物的實(shí)例是人造黃油、spreads、多種乳制品如黃油或酸乳或含乳或乳清的飲料。盡管這類(lèi)組合物通常被施用給人類(lèi)，但是它們也可被施用給動(dòng)物，優(yōu)選地施用給哺乳動(dòng)物，以緩解高血壓。另外，所獲得的產(chǎn)物中高含量的ACE抑制劑使得這些產(chǎn)物非常適用于以丸劑、藥片或高度濃縮的溶液或糊或粉末的形式被整合進(jìn)食品添加物中。確保連續(xù)釋放ACE抑制肽的緩釋飲食添加物尤其值得注意。根據(jù)本發(fā)明的MAP和/或ITP肽可作為干粉被配制在例如藥丸、藥片、顆粒、藥囊或膠囊中?；蛘吒鶕?jù)本發(fā)明的酶可作為液體被配制在例如糖漿或膠囊中。用在多種配方中并含有本發(fā)明酶的組合物也可摻入至少一種下述化合物生理學(xué)可接受載體、佐劑、賦形劑、穩(wěn)定劑、緩沖液和稀釋液，這些術(shù)語(yǔ)以其常規(guī)含義使用以表示有助于包裝、遞送、吸收、穩(wěn)定或(在佐劑的情況下)增強(qiáng)酶生理學(xué)效應(yīng)的物質(zhì)?？梢苑勰钚问脚c根據(jù)本發(fā)明的酶組合使用的多種化合物的相關(guān)背景可見(jiàn)于"PharmaceuticalDosageForms",secondedition,Volumes1,2and3，ISBN0-8247-8044-2MarcelDekker,Inc.。盡管作為干粉被配制的本發(fā)明的ACE抑制肽可被儲(chǔ)存相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，但是應(yīng)通過(guò)選擇合適的包裝(例如鋁泡aluminiumblister)來(lái)避免與潮濕或濕潤(rùn)空氣接觸。相對(duì)新穎的口服應(yīng)用形式是使用多種類(lèi)型的明膠膠囊或以明膠為基礎(chǔ)的藥片?？紤]到天然ACE抑制肽抵抗高血壓的相關(guān)性，該新的和成本有效的途徑為溫和降壓的飲食產(chǎn)品或甚至是獸醫(yī)產(chǎn)品提供了吸引人的起點(diǎn)。因?yàn)樵撏緩竭€包括驚人的簡(jiǎn)單純化步驟，所以也擴(kuò)大了降血壓的、濃縮的飲食添加物的可能性。根據(jù)本發(fā)明的或根據(jù)本發(fā)明使用的脯氨酸特異內(nèi)切蛋白酶是指WO02/45524的權(quán)利要求1-5、11和13中提到的多肽。因此，該脯氨酸特異內(nèi)切蛋白酶是具有脯氨酸特異內(nèi)切蛋白水解活性的多肽，其選自(a)具有下述氨基酸序列的多肽或其片段，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的氨基酸1到526具有至少40%的氨基酸序列同一性；(b)由下述多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在低嚴(yán)格度條件下與(i)SEQIDNO:l的核酸序列，或大于60個(gè)、優(yōu)選地大于100個(gè)核苷酸至少80%或90%與之同一，更優(yōu)選大于200個(gè)核苷酸至少90%與之同一的片段，或(ii)與SEQIDNO:l的核酸序列互補(bǔ)的核酸序列雜交。SEQIDNO:l和SEQIDNO:2顯示于WO02/45524中。優(yōu)選地，多肽是經(jīng)分離的形式。根據(jù)本發(fā)明使用的優(yōu)選的多肽具有與SEQIDNO:2的氨基酸1到526至少50%，優(yōu)選地至少60%，優(yōu)選地至少65%，優(yōu)選地至少70%，更優(yōu)選地至少80%，進(jìn)一步更優(yōu)選地至少90%，最優(yōu)選地至少95%和進(jìn)一步最優(yōu)選地至少約97%同一的氨基酸序列，或包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。優(yōu)選地，多肽由下述多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴(yán)格度條件下，更優(yōu)選地在中嚴(yán)格度條件下，最優(yōu)選地在高嚴(yán)格度條件下與(i)SEQIDNO:l的核酸序列或其片段，或(ii)與SEQIDNO:l核酸序列互補(bǔ)的核酸序列雜交。術(shù)語(yǔ)"能夠雜交"是指本發(fā)明的靶多核苷酸能夠與用作探針的核酸(例如SEQ.IDNO:1中公開(kāi)的核苷酸序列或其片段，或SEQ.IDNO:1的補(bǔ)體)以顯著高于背景的水平雜交。本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明脯氨酸特異內(nèi)切蛋白酶的多核苷酸，以及與之互補(bǔ)的核苷酸序列。核苷酸序列可以是RNA或DNA，包括基因組DNA、合成DNA或cDNA。優(yōu)選地，核苷酸序列是DNA，最優(yōu)選地是基因組DNA序列。典型地，本發(fā)明的多核苷酸包含核苷酸的連續(xù)序列，所述連續(xù)序列能夠在選擇性條件下與SEQIDNO:1的編碼序列或SEQIDNO:1編碼序列的補(bǔ)體雜交。這類(lèi)核苷酸可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法來(lái)合成。本發(fā)明的多核苷酸能與SEQIDNO:1的編碼序列或SEQIDNO:1編碼序列的補(bǔ)體以顯著高于背景的水平雜交。背景雜交可由于cDNA文庫(kù)中存在的其它c(diǎn)DNA而發(fā)生。典型地，通過(guò)本發(fā)明多核苷酸與SEQIDNO:1編碼序列或SEQIDNO:1編碼序列的補(bǔ)體之間相互作用而產(chǎn)生的信號(hào)水平是其它多核苷酸與SEQIDNO:1編碼序列之間相互作用的至少10倍、優(yōu)選地至少20倍、更優(yōu)選地至少50倍、進(jìn)一步更優(yōu)選至少100倍強(qiáng)。相互作用的強(qiáng)度可通過(guò)例如放射性(例如用32P)標(biāo)記探針來(lái)測(cè)量。典型地，可使用低嚴(yán)格度條件(0.3M氯化鈉和0.03M檸檬酸鈉在約4(TC)或高嚴(yán)格度條件(例如0.3M氯化鈉和0.03M檸檬酸鈉在約60°C)進(jìn)行選擇性雜交。UWGCGPackage提供BESTFIT程序，該程序可用于計(jì)算同一性(例如按其默認(rèn)設(shè)定使用)。PILEUP和BLASTN算法也可以用于計(jì)算序列同一性或比對(duì)序列(例如鑒定等價(jià)物或響應(yīng)序列，例如按照它們的默認(rèn)設(shè)定)。用于進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過(guò)NationalCenterforBiotechnologyInformation(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開(kāi)地獲得。該算法首先涉及通過(guò)鑒定查詢(xún)序列中長(zhǎng)度為W的短詞來(lái)鑒定高分值序列對(duì)(HSP)，所述短詞與數(shù)據(jù)庫(kù)序列中相同長(zhǎng)度的詞比對(duì)時(shí)匹配或滿足一些閾值為正的得分T。T是指相鄰詞的得分閾值。這些初始的相鄰詞擊中作為種子起始了尋找包含它們的HSP的搜索。所述詞擊中沿著每個(gè)序列在兩個(gè)方向上延伸，直到累積的比對(duì)得分能夠提高為止。當(dāng)累積的比對(duì)得分與其達(dá)到的最大值相比下降X量時(shí)；由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)分殘基比對(duì)的累積，累積得分達(dá)到零或零下時(shí)；或達(dá)到任一序列末端時(shí)，停止每個(gè)方向上的詞擊中延伸。BLAST算法參數(shù)W、T和X確定比對(duì)的敏感性和速度。BLAST算法使用如下的默認(rèn)值詞長(zhǎng)(W)ll、BLOSUM62評(píng)分矩陣比對(duì)(B)為50、期望(E)為10、M=5、N二4和兩鏈均比較。BLAST算法進(jìn)行了兩個(gè)序列間的相似性統(tǒng)計(jì)分析。BLAST算法提供的一種相似性測(cè)量是最小總概率(smallestsumprobabmty(P(N)))，其提供對(duì)兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列間隨機(jī)發(fā)生的匹配可能性的提示。例如，當(dāng)?shù)谝粋€(gè)序列與第二個(gè)序列比較時(shí)最小總概率是小于約1、優(yōu)選地小于約0.1、更優(yōu)選地小于約0.01，最優(yōu)選地小于約0.001時(shí)，認(rèn)為一個(gè)序列與另一序列相似。Aspergillus屬的菌株具有食品級(jí)別的狀態(tài)，來(lái)自這些微生物的酶已知形成不受懷疑的食品級(jí)別來(lái)源。根據(jù)另一優(yōu)選的實(shí)施方案，酶由其生產(chǎn)細(xì)胞分泌而不是非分泌的，因此稱(chēng)為胞質(zhì)酶。這樣，酶可以從細(xì)胞培養(yǎng)基中不經(jīng)昂貴的純化步驟以基本純凈的級(jí)別被回收。優(yōu)選地，所述酶在主要的pH和溫度條件下對(duì)其底物具有高親和力。圖l:來(lái)自黑曲霉的脯氨酰內(nèi)蛋白酶pH最適度的圖示。圖2:來(lái)自黑曲霉的脯氨酰內(nèi)蛋白酶的特異性圖。圖3:與經(jīng)色譜純化的、來(lái)自黑曲霉的脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶孵育后，完整卵清蛋白和合成的27-mer肽的SDS-PAGE。材料和方法可食用酪蛋白酸鉀噴霧(88%)得自DMVInternational,TheNetherlands。合成的生色肽得自PepscanSystemsB.V.TheNetherlands或來(lái)自Bachem,Switzerland。脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶來(lái)自黑曲霉。從黑曲霉過(guò)量聲場(chǎng)脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶如WO02/45524所描述完成。該酶的活性在檸檬酸鹽/磷酸氫二鈉緩沖液pH4.6中，在37"C下根據(jù)合成的肽Z-Gly-Pro-pNA來(lái)測(cè)試。在405nm處用分光光度計(jì)測(cè)量監(jiān)測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物。一個(gè)單位定義為在這些條件下每分鐘釋放1/miol對(duì)-硝基苯胺的酶來(lái)自黑曲霉的內(nèi)蛋白酶的色譜純化得自過(guò)量生產(chǎn)的黑曲霉菌株的培養(yǎng)物培養(yǎng)基用于色譜純化蛋白酶，以去除任何污染的內(nèi)蛋白水解和外蛋白水解活性。為此，首先離心發(fā)酵培養(yǎng)基以去除大塊真菌物質(zhì)，然后將上清液經(jīng)過(guò)大量孔徑遞減的濾紙以去除所有的細(xì)胞碎片。最后在20毫摩/升醋酸鈉pH5.1中將獲得的超濾液稀釋十倍，并上于Q-SepharoseFF柱上。將蛋白質(zhì)用10毫摩/升醋酸鈉pH5.1中0到0.4摩爾/升NaCl的梯度洗脫。根據(jù)WorldJournalofMicrobiology&Biotechnology11，209-212(1995)中描述的方案，在輕微改進(jìn)的測(cè)定條件下收集并合并對(duì)Z-Gly-Pro-pNA切割顯示活性的峰級(jí)分?？紤]到來(lái)自黑曲霉的脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶的酸性pH最適度，酶測(cè)定在檸檬酸鹽/磷酸氫二鈉緩沖液中在37'C下pH4.6進(jìn)行。合并活性成分然后濃縮，最終產(chǎn)生在SDS-PAGE中僅顯示單一條帶、在HP-SEC中僅顯示一個(gè)峰的制劑。通過(guò)疏水相互作用色譜的進(jìn)一步分析證實(shí)所獲得的酶制劑的純度。LC/MS/MS分析用于IPP、LPP和VPP的檢測(cè)。使用與P4000泵(Thermoquest,Breda,theNetherlands)偶聯(lián)的離子阱質(zhì)譜儀(Thermoquest,Breda,theNetherlands)的HPLC，用于定量通過(guò)本發(fā)明酶混合物產(chǎn)生的酶蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中的目的肽，包括三肽IPP、LPP和VPP。使用Inertsil3ODS3,3/mi,150*2.1mm(VarianBelgium,Belgium)柱，結(jié)合MilliQ水中0.1%甲酸(Millipore,Bedford,MA,USA;溶液A)和乙腈中0.1%甲酸(溶液B)的梯度用于洗脫來(lái)分離所形成的肽。所述梯度從100%的溶液A開(kāi)始，保持5分鐘，在10分鐘內(nèi)線性增長(zhǎng)至5%B，隨后在30分鐘內(nèi)線性增長(zhǎng)至45X的溶液B，立即進(jìn)入起始條件并在此保持15分鐘用于穩(wěn)定。使用的注射體積是50微升，流速是200微升每分鐘，柱溫度保持在55。C。經(jīng)注射樣品的蛋白質(zhì)濃度約為50微克/毫升。通過(guò)使用專(zhuān)門(mén)用于目的肽的MS/MS，使用約30%的最佳碰撞能量獲得個(gè)體肽的詳細(xì)信息。通過(guò)使用在MS/MS模式中觀察到的最多碎片離子，使用外標(biāo)進(jìn)行個(gè)體肽的定量。三肽LPP(M二325.2)被用于調(diào)節(jié)MS模式中的最佳敏感度和MS/MS模式中的最佳碎裂(進(jìn)行5/xg/ml的恒量輸注，導(dǎo)致MS模式中經(jīng)質(zhì)子化的分子)和MS/MS模式中約30%的最佳碰撞能量(產(chǎn)生B-和Y-離子組)。在LC/MS/MS之前，在環(huán)境溫度下和13000rpm將酶蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物離心10分鐘，濾過(guò)0.22Aim濾紙并用MilliQ水1:IOO稀釋上清液。KieldahlNitrogen通過(guò)FlowInjectionAnalysis測(cè)量KjeldahlNitrogen。使用裝備有TKNMethodCassette5000-040、帶有SOFIA軟件的Pentium4計(jì)算機(jī)和Tecator5027Autosampler的TecatorFIASTAR5000FlowInjectionSystem,在590nM處將從含蛋白質(zhì)溶液中釋放的氨定量。將對(duì)應(yīng)于所述方法動(dòng)態(tài)范圍(0.5-20mgN/1)的樣品量與95-97%的硫酸和Kjeltab—起置于消化管中，在20(TC進(jìn)行30分鐘的消化程序，之后在36(TC進(jìn)行90分鐘。注射進(jìn)FIASTAR5000體系后，測(cè)量氮峰，從中可以推斷所測(cè)量的蛋白質(zhì)量。氨基酸分析將精確稱(chēng)重的蛋白質(zhì)性材料樣品溶于稀酸中，通過(guò)在Eppendorf離心機(jī)中離心去除沉淀。根據(jù)AminoAcidAnalysisSystemofWaters(MilfordMA,USA)的操作員手冊(cè)中說(shuō)明的PicoTag方法，對(duì)澄清的上清液進(jìn)行氨基酸分析。為此，從液體中獲得合適的樣品，然后干燥并進(jìn)行蒸汽相酸水解并使用異硫氰酸苯質(zhì)來(lái)衍生化。使用HPLC方法對(duì)存在的多種經(jīng)衍生化的氨基酸定量，并合計(jì)以計(jì)算稱(chēng)重樣品中游離氨基酸的總水平。氨基酸Cys和Trp不包括在得自該分析的數(shù)據(jù)中。使用快速OPA測(cè)試測(cè)量蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的水解程度(DegreeofHydrolysis(DH))并如所述計(jì)算(Nielsenetal，JFS，Vol66,NO5,642-646,2001)。水解產(chǎn)物中存在的肽和蛋白質(zhì)的分子量分布。在自動(dòng)化HPLC體系上分析經(jīng)蛋白酶處理的蛋白質(zhì)樣品的肽尺寸分布，所述自動(dòng)化HPLC體系裝備有高壓泵、能夠注射10-100//l樣品的注射設(shè)備和能夠在214nm處監(jiān)測(cè)柱流出液的UV檢測(cè)器。用于該分析的柱是用20mM磷酸鈉/250mM氯化鈉pH7.0緩沖液平衡的SuperdexPeptideHR10/300GL(Amersham)。注射樣品(典型地50/xl)后，在90分鐘內(nèi)0.5ml/min的流速下用緩沖液將多種成分從柱中洗脫。使用細(xì)胞色素C(Mw13500Da)、抑肽酶(Mw6510Da)和四甘氨酸(Mw246Da)的混合物作為分子量標(biāo)記來(lái)校準(zhǔn)該體系。實(shí)施例1得自黑曲霉的酶代表新一類(lèi)的脯氨酸特異蛋白酶從WO02/45524中提供的來(lái)自黑曲霉的脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶的整個(gè)編碼序列可以確定526個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)序列。該酶的新穎性通過(guò)BLAST搜索數(shù)據(jù)庫(kù)(例如SwissProt、PIR和trEMBL)來(lái)證實(shí)。讓我們驚訝的是，在黑曲霉酶和已知的脯氨酰寡肽酶之間不能檢測(cè)到清晰的同源性。然而，氨基酸序列更接近的檢查揭示了與Pro-X羧肽酶(EC3.4.16.2)、二肽基氨肽酶I(EC3.4.14.2)和胸腺特異絲氨酸蛋白酶的低但是顯著的同源性。所有的這些酶已被歸為絲氨酸肽酶S28家族?；钚晕稽c(diǎn)絲氨酸周?chē)腉xSYxG構(gòu)型在這些酶和來(lái)自黑曲霉的內(nèi)蛋白酶之間也是保守的。另外，S28家族的成員具有酸性pH最適度，具有在脯氨酸殘基羧基端側(cè)切割的特異性，并用與來(lái)自黑曲霉的脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶相似的信號(hào)序列和前肽合成。黑曲霉酶的尺寸也與S28家族成員的相似。因此，黑曲霉脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶顯示是絲氨酸蛋白酶S28家族而不是S9家族的成員，大部分胞質(zhì)脯氨酰寡肽酶(包括得自F/aw^acter^mmem'wgfwe/^cwm的酶)被歸入所述S9家族。根據(jù)這些結(jié)構(gòu)和生理特征，我們推斷黑曲霉酶屬于絲氨酸蛋白酶的S28家族而不是S9家族。將來(lái)自黑曲霉的酶與屬于S9家族的脯氨酰寡肽酶區(qū)別的另一特征在于下述事實(shí)與屬于后一家族的胞質(zhì)脯氨酰內(nèi)蛋白酶不同，新鑒定的黑曲霉酶被分泌進(jìn)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。這是對(duì)來(lái)自低等真核生物S28家族成員的分離和表征的首次報(bào)導(dǎo)。實(shí)施例2從黑曲霉獲得的脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶的pH和溫度最適度為了確立來(lái)自黑曲霉的脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶的pH最適度，制備具有不同pH的緩沖液。使用0.05mo1/1醋酸鈉和0.02MCaCl2制造pH為4.0-4.5-4.8-5.0-5.5和6.0的緩沖液；使用含有0.02MCaCl2的0.05MTris/HCl緩沖液制造pH7.0和8.0的緩沖液。分別使用醋酸和HC1調(diào)節(jié)pH值。生色的合成肽Z-Gly-Pro-pNA被用作底物。緩沖溶液、底物溶液和脯氨酰內(nèi)蛋白酶預(yù)稀釋液(0.1U/mL的活性)在水浴中被精確地加熱至37.00°C?；旌虾髮⒎磻?yīng)在405nm處37.0CTC下分光光度計(jì)測(cè)量，每0.5分鐘測(cè)量一次。根據(jù)圖1顯示的結(jié)果，清楚的是來(lái)自黑曲霉的脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶具有4左右的pH最適度。還確立了脯氨酰內(nèi)蛋白酶的溫度最適度。為此使用CasdneResorufme(Rocheversion3)作為底物，將經(jīng)純化的酶制劑在含有0.1mol/1醋酸鈉的0.02mol/lCaCl2中，pH5.0下孵育2小時(shí)，并通過(guò)在574nm處測(cè)量來(lái)定量酶活性。根據(jù)獲得的結(jié)果，來(lái)自黑曲霉的脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶具有5(TC左右的溫度最適度。實(shí)施例3來(lái)自黑曲霉的脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶的特異性和純度將得自黑曲霉菌株的粗酶樣品以及經(jīng)色譜純化的酶樣品針對(duì)一系列生色肽底物測(cè)試，以確立被編碼的內(nèi)蛋白酶的特異性，所述黑曲霉菌株含有多個(gè)拷貝的表達(dá)盒(cfWO02/45524)。使用不同組的生色肽確立可能的污染酶活性的存在。被編碼的內(nèi)蛋白酶的內(nèi)蛋白水解特異性在不同的Ala-Ala-XpNA(AAXpNA)底物上檢測(cè)。在該語(yǔ)境中，"X"是指不同的天然氨基酸殘基，"p-NA"是指對(duì)-硝基苯胺。"X"殘基與分子的pNA部分之間肽鍵的切割引起色彩改變，所述色彩改變可通過(guò)A=405或410nm處光吸光度的提高而被監(jiān)測(cè)。AAXpNA底物。為此，在含有20CaC12的0.1M醋酸鹽緩沖液pH4.0中IOOX地稀釋AAX-pNA底物(150mmol/l)的儲(chǔ)存液。405nm處在TECANGeniosMTPReader(Salzburg,Vienna)中的10分鐘動(dòng)力學(xué)測(cè)量記錄了光密度的提高，通過(guò)在Excel中的數(shù)據(jù)加工得到圖2所示的圖。根據(jù)該結(jié)果，明顯的是來(lái)自黑曲霉的內(nèi)蛋白酶對(duì)脯氨酰肽鍵高度特異，帶有對(duì)丙胺酰鍵的副活性。粗制劑和經(jīng)色譜純化的制劑顯示相似的活性情況。外來(lái)酶活性對(duì)來(lái)自黑曲霉的內(nèi)蛋白酶的可能污染引起大量不期望的副反應(yīng)。例如，外蛋白酶(例如羧肽酶或氨肽酶)的存在造成具有提高水平游離氨基酸的肽制劑。這些額外的氨基酸稀釋了存在的生物活性氨基酸的相對(duì)濃度，還作為提高的Mamard反應(yīng)的結(jié)果給予了培養(yǎng)基異味。如果過(guò)表達(dá)的脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶制劑中存在嚴(yán)重水平的污染內(nèi)蛋白酶，則引入除脯氨酸或丙氨酸殘基的羧基端外其他位置的切割位點(diǎn)。這類(lèi)額外的切割位點(diǎn)產(chǎn)生額外的肽，從而也稀釋了具有羧基端脯氨酸殘基的生物活性肽的濃度。為了最小化所有這些不期望的副反應(yīng)，優(yōu)選使用基本純凈的脯氨酸特異蛋白酶?；炯儍羰侵冈谒褂玫姆跤龡l件下污染內(nèi)蛋白酶以及污染外肽酶的活性是最小的或優(yōu)選地不具活性。給出以下的測(cè)試步驟以定量這類(lèi)污染的內(nèi)肽酶和外肽酶活性。所述測(cè)試步驟的基礎(chǔ)通過(guò)收集多種選擇性生色肽形成。因?yàn)橹挥懈彼崽禺惖墓训鞍酌负蛢?nèi)蛋白酶能夠從肽Z-AAAP-pNA釋放pNA，因此該具體的肽被用于定量所需的脯氨酸特異內(nèi)蛋白水解活性。因?yàn)樵S多內(nèi)蛋白酶能夠從肽Z-AAAF-pNA和Z-AAAR-pNA釋放pNA，所以這兩種肽被用于定量污染的、非脯氨酸特異的內(nèi)蛋白水解活性。因?yàn)樵S多氨肽酶能夠從肽底物有效地釋放Phe和Gln，所以生色肽Q-pNA和V-pNA被用于定量污染的氨肽酶活性。因?yàn)樵S多羧肽酶能夠從肽底物釋放Phe和Arg殘基，因此選擇含有這些殘基的肽以定量污染的羧肽酶活性。然而，不能得到用于測(cè)量羧肽酶活性的合適生色組，從而必需開(kāi)發(fā)使用合成的肽Z-AF和Z-AR的備選方法。該備選方法在下文提供。在所有的合成肽中使用的"Z"表示芐氧羰基，"pNA"表示生色團(tuán)對(duì)-硝基苯胺。所有的生色肽得自Pepscan(Lelystad,TheNetherlands)。肽Z-AF和Z-AR購(gòu)自Bachem(Switserland)。所有的孵育在4(TC下進(jìn)行。經(jīng)稀釋的酶制劑被再計(jì)算為商業(yè)產(chǎn)品的濃度。為了闡述規(guī)則地存在于工業(yè)可獲得的酶制劑中多種酶活性的水平，在該實(shí)施例中我們描述三種市售酶制劑的多種蛋白水解活性的測(cè)試，即Flavourzyme1000LBatchHPN00218(Novozymes)、SumizymeFP(ShinNihon,Japan)禾口CorolaseLAPCh.:4123(ABEnzymes,UK)。Flavourzyme和SmmzymeFP均已知是除非特異性?xún)?nèi)蛋白水解和羧肽水解活性活性外，含有若干氨肽水解酶活性的復(fù)雜酶制劑。CorolaseLAP顯示來(lái)自曲霉的相對(duì)純凈的、經(jīng)克隆和過(guò)表達(dá)的亮氨酸氨肽酶活性。氨肽酶活性測(cè)量100%DMSO中150mmol/l的F-pNA和Q-pNA的儲(chǔ)存溶液在0.1MBisTris緩沖液pH6中被稀釋80倍，以制造含1:1比例的F-pNA和Q-pNA的3.75mmol/1F-pNA+Q-pNA底物溶液。將該氨肽酶底物溶液的200Ml等分式樣吸入微量滴定板(MTP)的分離孔中。將MTP在4(TC下、運(yùn)行Magellan4軟件的TecanGeniosMTP(Salzburg,Vienna)中預(yù)孵育。通過(guò)添加50^1適當(dāng)?shù)拿溉芤洪_(kāi)始反應(yīng)，使得孵育在3mM的底物濃度下進(jìn)行。典型地，使用液體酶樣品Flavourzyme,CorolaseLAP和脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶的1:50的稀釋液。對(duì)干燥的SumizymeFP產(chǎn)品，使用1%的溶液。作為氨基酸-pNA鍵切割結(jié)果而顯影的、在405nm處通過(guò)TecanGemosMTP測(cè)量的黃色隨后是至少20個(gè)動(dòng)力學(xué)循環(huán)(約10分鐘)。該軟件將所獲得數(shù)據(jù)產(chǎn)生為OD4()5/min。測(cè)量脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶活性該測(cè)量基本上與氨肽酶測(cè)定法相同地進(jìn)行，但是在該情況下使用終濃度3mmo1/1的Z-AAAP-pNA作為唯一的底物。通過(guò)將pH6緩沖液中的懸浮液加熱至50-55。C使該底物溶解得到室溫下澄清的溶液。測(cè)量在4(TC下進(jìn)行。典型地，使用液體酶樣品Flavourzyme禾nCorolaseLAP的1:50稀釋液。以1%的溶液使用SumizymeFP。典型地以1:5000的稀釋液使用脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶。軟件將數(shù)據(jù)產(chǎn)生為OD4Q5/min。測(cè)量污染的非脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶活性該測(cè)量也與氨肽酶測(cè)定法所述基本相同地進(jìn)行，但是在該測(cè)試中，使用1:1比例和3mmo1/1終濃度地Z-AAAF-pNA和Z-AAAR-pNA作為底物。在使用地pH6.0測(cè)試條件下，底物Z-AAAF-pNA顯示弱可溶性，但是與枯草桿菌蛋白酶的測(cè)試孵育導(dǎo)致伴隨pNA釋放的底物快速增溶。測(cè)量在4(TC下進(jìn)行。然而，為了補(bǔ)償該弱可溶性，將MTP讀數(shù)器編程為在動(dòng)力學(xué)循環(huán)之間搖動(dòng)。軟件還將數(shù)據(jù)產(chǎn)生為OD4Q5/min。測(cè)量污染的羧基肽酶活性因?yàn)椴荒艿玫矫舾械纳囊詼y(cè)量羧基肽酶活性，所以使用基于Boehringer方案的方法用于定量羧基肽酶C。兩種乙醇中150mmol/l的Z-A-F和Z-A-R儲(chǔ)存溶液在0.1mol/1BisTris緩沖液pH6中被稀釋80倍，以制造含1:1比例的Z-A-F和Z-A-R的3.75mmol/1Z-A-F+Z-A-R底物溶液。然后將該氨肽酶底物溶液的200等分式樣吸入eppendorf小管中并在40。C預(yù)孵育。通過(guò)添加50/d適當(dāng)?shù)拿赶♂屢洪_(kāi)始反應(yīng)。典型地，使用Flavourzyme和CorolaseLAP和脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶的1:50的稀釋液。對(duì)SumizymeFP,使用1%的溶液。5分鐘后通過(guò)添加250pi的茚三酮試劑終止反應(yīng)。茚三酮試劑由溶解于15mlDMSO中的400mg茚三酮(Merck)和60mg茚氮蘭組成，其中添加了5ml的4.0mol/1醋酸鋰緩沖液pH5.2。4.0mol/1醋酸鋰緩沖液通過(guò)將LiOH(Sigma)溶解，之后使用冰醋酸(Merck)將溶液的pH調(diào)節(jié)至pH5.2來(lái)制備。終止反應(yīng)后，將每種樣品在95。C加熱15分鐘以便于顏色形成，隨后用純乙醇稀釋10倍。在578nm處在Uvikon分光光度計(jì)中測(cè)量所形成的顏色。以與活性樣品相同的方式制造空白，但是茚三酮試劑和酶的添加被反轉(zhuǎn)。為了定量由羧肽酶活性產(chǎn)生的游離氨基酸量，使用氨基酸L-苯丙氨酸創(chuàng)建校準(zhǔn)曲線。以與樣品相同的方式處理含有0.1875、0.375、0.75、1.5和3.0mmol/1的L-苯丙氨酸(Sigma)的pH6緩沖液中的溶液，即在小管中250/4。根據(jù)獲得的OD578值，在Excel中構(gòu)建曲線。使用該曲線計(jì)算含Z-A-F和Z-A-R的樣品中存在的游離氨基酸的濃度。根據(jù)獲得的值，以每微摩爾每分鐘每經(jīng)測(cè)試的酶量計(jì)算羧基肽酶活性。計(jì)算活性比例為了確立多種酶制劑用于本發(fā)明方法的合適性，計(jì)算相關(guān)酶活性的商(quotients)。在基于MTP讀數(shù)器的測(cè)定法中，酶活性被表征為隨時(shí)間的pNA釋放，即表征為AOD4。5/min。通過(guò)MTP讀數(shù)器獲得的酶活性的商通過(guò)將得自相同量酶的AOD/min值簡(jiǎn)單相除來(lái)計(jì)算。然而，在羧肽酶測(cè)定法的情況下，產(chǎn)生不能與基于MTP-pNA測(cè)定法產(chǎn)生的AOD/min直接比較的OD。這時(shí)所測(cè)量的OD首先被轉(zhuǎn)化為每分鐘釋放的/imol氨基酸(/xmol/min)。然后將釋放的pNA的AOD/min轉(zhuǎn)化為ptmol/min。為此，在MTP讀數(shù)器上產(chǎn)生校準(zhǔn)曲線，其中測(cè)量0.25、0.125、0.0625、0.0312和0.015mmol/1純pNA(Sigma)的稀釋液，每孔測(cè)量250/xl。根據(jù)獲得的數(shù)據(jù)，在Excel中構(gòu)建校準(zhǔn)曲線。根據(jù)該校準(zhǔn)曲線，將AOD/min轉(zhuǎn)化為/miol/min，使得基于pNA的測(cè)量可以與基于茚三酮的測(cè)量進(jìn)行比較。以上述測(cè)試中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，所使用的多種酶制劑根據(jù)目的脯氨酸(和丙氨酸)特異活性和污染內(nèi)蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶活性被表征。每種酶制劑中存在的脯氨酸特異寡蛋白水解活性或內(nèi)蛋白水解活性顯示在表1中"脯氨酸特異活性"列中。關(guān)于污染的氨肽酶活性(AP/ProlSpecAct)、污染的羧肽酶(CPD/ProlSpecAct)和污染的內(nèi)蛋白水解活性(Endo/ProlSpecAct)的數(shù)據(jù)相對(duì)于存在的脯氨酸特異活性而被顯示。每種制劑中存在的污染的氮肽酶活性相對(duì)于污染的羧肽酶活性水平被顯示為(AP/CPD)。明顯的是所測(cè)試的市售酶制劑中均不含有任何顯著的脯氮酸特異寡蛋白水解活性或內(nèi)蛋白水解活性。另外，所測(cè)試的所有市售酶制劑均含有顯著的污染內(nèi)蛋白水解或外蛋白水解活性。表1:目的(脯氨酸和丙氨酸特異的)內(nèi)蛋白酶活性水平相對(duì)于污染的內(nèi)蛋白水解和外蛋白水解活性水平<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>*Sumizyme以1%的溶液領(lǐng)1]量，F(xiàn)lavourzyme禾卩Corolase作為1:50的稀釋液測(cè)量。得自黑曲霉的脯氨酸特異活性以1:5000的稀釋液測(cè)量。然后由數(shù)據(jù)計(jì)算存在于所提供產(chǎn)物中的活性。實(shí)施例4來(lái)自黑曲霉的脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶能夠水解大蛋白質(zhì)和小肽，從而是真正的內(nèi)蛋白酉每由于特異的結(jié)構(gòu)特征，屬于S9家族的脯氨酸寡肽酶不能消化大于30個(gè)氨基酸的肽。該限制對(duì)旨在盡可能快和盡可能有效地水解不同蛋白質(zhì)的酶而言是明顯的缺點(diǎn)。為了了解來(lái)自黑曲霉的脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶是否顯示與底物分子尺寸相關(guān)的相同限制，我們將經(jīng)色譜純化的、來(lái)自黑曲霉的脯氨酰內(nèi)蛋白酶與小的合成肽和大的卵清蛋白分子孵育，并分析由SDS-PAGE形成的水解產(chǎn)物。所使用的合成肽是27-mer的序列NH2-FRASDNDRVIDPGKVETLTIRRLHIPR-COOH，是Pepscan公司(Lelystad.TheNetherlands)的贈(zèng)品。如其氨基酸序列所顯示的，該肽含有2個(gè)脯氨酸殘基，一個(gè)位于中間，一個(gè)位于肽的末端。完整的卵清蛋白分子(PierceImject，小管含有20mg冷凍干燥的材料)由385個(gè)氨基酸組成，具有42750Da的分子量。該分子含有14個(gè)脯氨酸殘基，其中之一位于分子的最C-末端，不能被脯氨酸內(nèi)蛋白酶切割。卵清蛋白和寡肽在50。C與經(jīng)純化的、來(lái)自黑曲霉的脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶獨(dú)立地被孵育。在若干時(shí)間間隔取樣，樣品使用SDS-PAGE被分析。用含有20mMCaCl2的0.1M醋酸鹽緩沖液pH4將具有4.5單位/ml活性的、經(jīng)色譜純化的、來(lái)自黑曲霉的脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶稀釋100倍。將卵清蛋白在醋酸鹽緩沖液pH4中溶解為1mg/ml(22pM)的濃度。將27-mer溶解于相同的緩沖液中以達(dá)到0.48mg/ml(152^M)的濃度。選擇卵清蛋白和27-mer溶液的容積摩爾數(shù)，使得兩種溶液含有相同的可切割脯氨酸殘基容積摩爾數(shù)。卵清蛋白含有13個(gè)潛在的脯氨酸切割位點(diǎn)，而27-mer肽僅含有兩個(gè)。用0.5ml的每種底物與10^1(0.45milliU)的酶溶液在Eppendorf恒溫混合儀中在5CTC下孵育。在若干時(shí)間間隔中，從孵育混合物中取出10/d樣品，并保持在2(TC直至進(jìn)行SDS-PAGE。用于SDS-PAGE和染色的所有材料均購(gòu)自Invitrogen。使用LDS緩沖液根據(jù)制造商說(shuō)明制備樣品，并使用MES-SDS緩沖體系根據(jù)制造商說(shuō)明在12%Bis-Tris凝膠上分離。使用SimplyBlueSafeStain(CollodialCoomassieG250)進(jìn)行染色。如圖3中可看到的，在孵育的前4.75個(gè)小時(shí)，卵清蛋白被來(lái)自黑曲霉的酶切割為約35到36kD的離散條帶(第3泳道)。延長(zhǎng)的孵育周期導(dǎo)致進(jìn)一步降解為不同分子量的更小產(chǎn)物(第7泳道)。根據(jù)泳道4、6禾Q8比泳道2更模糊的條帶所判斷，27-mer的肽也被降解。產(chǎn)物很小的分子量遷移(比較泳道9和8)最可能是由于肽羧基端精氨酸殘基的切割。該差異為約200D(使用Alphalmager3.3d軟件在Alphalmager2000系統(tǒng)上測(cè)量)，精氨酸具有174的MW。該分子量的小遷移可能是肽降解的第一步。產(chǎn)物的進(jìn)一步降解僅可通過(guò)SDS凝膠上條帶強(qiáng)度的減弱看到。進(jìn)一步降解的產(chǎn)物不是可見(jiàn)的，因?yàn)榫哂屑s1000MW的成分的凝膠染色不可能用考馬斯亮藍(lán)實(shí)現(xiàn)。根據(jù)該實(shí)驗(yàn)可以推斷與已知的屬于S9家族的脯氨酰寡肽酶不同，來(lái)自黑曲霉的脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶不具有對(duì)切割小尺寸肽高于較大蛋白質(zhì)的特異偏好。同樣，來(lái)自黑曲霉的酶表現(xiàn)為真正的內(nèi)蛋白酶和水解不同類(lèi)型蛋白質(zhì)的優(yōu)選的酶。該發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致該酶的驚人用途，如以下實(shí)施例中所闡述。實(shí)施例5酪蛋白酸鉀與來(lái)自A.niger的脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶孵育快速地產(chǎn)生IPP和LPP而非VPP在該實(shí)驗(yàn)中，將來(lái)自A.niger的過(guò)量產(chǎn)生的、基本純凈的脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶與酪蛋白酸鉀孵育，以檢測(cè)ACE抑制肽IPP、VPP以及LPP的釋放。使用的內(nèi)蛋白酶基本純凈是指不存在除純凈的脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶固有的內(nèi)切蛋白水解活性(即羧基端切除脯氨酸和丙氨酸殘基)以外的顯著內(nèi)切蛋白水解活性。為了盡可能地限制作為攝食ACE抑制肽的結(jié)果的鈉攝入，使用酪蛋白酸鉀作為該孵育的底物。以10X(w/w)的蛋白質(zhì)濃度將酪蛋白酸鹽懸浮于65。C的水中，然后使用磷酸將pH調(diào)節(jié)為6.0。然后將懸液冷卻至55°C并以4單位/克(關(guān)于單位的定義，參閱材料&方法部分)的蛋白質(zhì)濃度添加來(lái)自A.niger的脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶。將該混合物在連續(xù)攪拌下孵育24小時(shí)。該階段不再進(jìn)行pH調(diào)節(jié)。在孵育的1、2、3、4、8和24小時(shí)取樣。通過(guò)將樣品立刻加熱至90°C5分鐘終止每個(gè)樣品的酶活性。冷卻后使用磷酸將每個(gè)樣品的pH迅速降低至4.5，之后在Hereaus床面離心機(jī)中將懸液在3000rpm離心5分鐘。完全澄清的上清液用于LC/MS/MS分析，以定量上清液中的VPP、IPP、LPP、VWPP禾BVWPPF肽(參閱材料&方法部分)。牛乳酪蛋白摻合大量不同的蛋白質(zhì)，包括3-酪蛋白和k-酪蛋白。根據(jù)己知的氨基酸序列，P-酪蛋白包括ACE抑制性三肽IPP、VPP和LPP。在P-酪蛋白中，IPP包含在序歹lJ-P7廣Q72-N73-l74-P75國(guó)P76-中，VPP包含在序列-P8廣V82-V83-V84-P85-P86-中，LPP包含在序列-P15Q-L151-P152-P15r中。k-酪蛋白(其以約50%的3-酪蛋白濃度存在于經(jīng)酸沉淀的酪蛋白制劑)進(jìn)包含IPP。在k-酪蛋白中，IPP包含在序歹IJ-Ak)7-I柳-P則-Puo-中。酪蛋白的其它蛋白質(zhì)成分不含IPP、VPP或LPP。表2和表3顯示存在于經(jīng)酸化和離心的上清液中的肽濃度，其被計(jì)算為添加進(jìn)孵育混合物中的每克酪蛋白酸鉀。如表2所示，孵育1小時(shí)后IPP到達(dá)其最大濃度。之后IPP濃度沒(méi)有再提高。五肽VVVPP的形成顯示與IPP產(chǎn)生相同的動(dòng)力學(xué)。如理論所期望的，VVVPP的摩爾產(chǎn)率與LPP肽的摩爾產(chǎn)率相似。LPP禾nVVVPP的產(chǎn)率均達(dá)到理論可行產(chǎn)率的約60%。LPP的最大濃度僅在孵育3小時(shí)后達(dá)到的事實(shí)提示P-酪蛋白分子具體部分的切割可能更難一些。與VVVPP相反，完全不形成六肽VVVPPF。該現(xiàn)象提示脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶有效地切割-P-F-鍵，從而產(chǎn)生VVVPP。三肽IPP立刻被形成，但是其摩爾產(chǎn)率不大于VVVPP或LPP最大摩爾產(chǎn)率的約三分之一。因?yàn)镮PP既包含在e-酪蛋白中也包含在k—酪蛋白中，因此其產(chǎn)出是無(wú)法預(yù)期的。對(duì)該現(xiàn)象的可能解釋是脯氨酸特異蛋白酶可以產(chǎn)生IPP，但是僅從酪蛋白酸鹽的k-酪蛋白部分產(chǎn)生?？紤]到相關(guān)的k-酪蛋白氨基酸序列，這提示-Aw7-I，-肽鍵被酶的丙氨酸特異活性切割。如果是真的，則所釋放的IPP數(shù)量達(dá)到k-酪蛋白中存在量的約40%，但是不大于P加k酪蛋白中理論存在的IPP的約10%。釋放IPP的該切割機(jī)制也解釋了VPP為何不能從其前體分子VVVPP形成的原因所需的內(nèi)切蛋白水解活性不僅存在于所使用的來(lái)自A.mger的酶制劑中。表2按每克添加的蛋白質(zhì)己酸的經(jīng)酸化上清液的摩爾肽含量。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表3按添加的mg/g蛋白質(zhì)己酸的經(jīng)酸化的上清液中的肽濃度。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>實(shí)施例6酸性酪蛋白沉淀步驟的摻入導(dǎo)致5倍濃度的ACE抑制肽如實(shí)施例5所述，在pH6.0將10X(w/w)蛋白質(zhì)濃度的酪蛋白酸鉀與來(lái)自A.niger的脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶孵育。多種孵育時(shí)間段后加熱樣品以停止進(jìn)一步的酶活性，之后將pH降至4.5以最小化酪蛋白可溶性。通過(guò)低速離心去除不溶性酪蛋白分子。在表2和表3中，我們提供了基于10%蛋白質(zhì)的起始濃度計(jì)算的ACE抑制肽濃度。然而，作為酸化和隨后的離心歩驟的結(jié)果，大部分添加的蛋白質(zhì)已被去除。而為了將該經(jīng)酸化的上清液的經(jīng)減少的蛋白質(zhì)含量計(jì)算在內(nèi)，進(jìn)行氮(Kjeldahl)分析。根據(jù)后一數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)多種上清液含有表4顯示的蛋白質(zhì)水平。表4酸化的上清液中蛋白質(zhì)的含量<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>考慮到這些數(shù)據(jù)，我們?cè)儆?jì)算了每種上清液中存在的ACE抑制肽的濃度，但是這次使用它們的實(shí)際蛋白質(zhì)含量。再計(jì)算的數(shù)據(jù)顯示在表5中。表5按存在的每克蛋白質(zhì)計(jì)算的經(jīng)酸化上清液中肽濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表3和表5中存在的數(shù)據(jù)的比較清晰地顯示之后進(jìn)行工業(yè)可行的傾析、過(guò)濾或低速離心步驟的簡(jiǎn)單的酸化步驟導(dǎo)致特異ACE抑制肽濃度5倍的提高。實(shí)施例7在濃縮的酪蛋白水解產(chǎn)物中鑒定新穎的和可能的ACE抑制三肽MAP和ITP為了便于更徹底地分析存在的生物活性肽，以制備規(guī)模制備酪蛋白水解產(chǎn)物，所述酪蛋白水解產(chǎn)物通過(guò)用純凈的來(lái)自A.niger的脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶消化并通過(guò)酸沉淀來(lái)獲得。為此，將3000克酪蛋白酸鉀重懸于25升75t:的水中。徹底的均質(zhì)化后用經(jīng)稀釋的磷酸將pH緩慢調(diào)節(jié)至6.0。冷卻至55X:后，以4個(gè)酶單位/克酪蛋白酸鹽(單位的定義參閱材料&方法部分)的濃度添加來(lái)自A.niger的脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶。在55。C孵育(攪拌)3小時(shí)后，通過(guò)緩慢地添加濃縮的磷酸將pH降低至4.5。在該更大規(guī)模的制備中，省略所述方法該部分中用于滅活脯氨酸特異內(nèi)蛋白酶的加熱處理步驟。然后將懸浮液快速冷卻至4T并在該溫度保持過(guò)夜(不攪拌)。第二天早上，將澄清的上層傾析并蒸發(fā)，以達(dá)到40%干物質(zhì)的水平。將后一濃縮的液體在14(TC下進(jìn)行UHT處理4秒鐘，然后在5CTC下超濾。微生物過(guò)濾后噴霧干燥液體。該材料在下文中稱(chēng)為來(lái)自酪蛋白的生物活性肽(CDBAP)。使用材料&方法部分中加下劃線的LC/MS操作測(cè)定粉末狀產(chǎn)物的IPP、LPP和VPP含量。根據(jù)其氮含量，粉末狀的產(chǎn)物具有約60%的蛋白質(zhì)含量(使用6.38的轉(zhuǎn)換因子)。粉末的IPP、LPP和VPP含量提供在表6中。CDBAP產(chǎn)物的氨基酸組成提供在表7中。非常值得注意的是酸沉淀后獲得的噴霧干燥材料中摩爾脯氨酸含量的提高從最初的12%提高至約24%。表6:CDBAP白勺IPP、LPP禾口VPP含量<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>通過(guò)使用與at-lineACE抑制測(cè)定法和用于鑒定的質(zhì)譜法組合的2維色譜分離來(lái)研究CDBAP中新穎ACE抑制肽的存在。在一種分析中，肽混合物在ODS3液體色譜(LC)柱上被分離，從獲得的多個(gè)級(jí)分產(chǎn)生ACE抑制圖譜。在另一分析中，顯示高ACE抑制的來(lái)自第一種柱的級(jí)分在BiosmteLC柱上使用不同的梯度形式被進(jìn)一步地分離。將收集自第二種柱的級(jí)分分為兩部分一部分用于at-lineACE抑制測(cè)量，而另一部分進(jìn)行MS和MS-MS分析以鑒定存在的肽。使用裝備了二元追蹤UV檢測(cè)器的Alliance2795HPLC系統(tǒng)(Waters,Etten-Leur，theNetherlands)進(jìn)行所有的分析。為了鑒定肽，HPLC體系被與來(lái)自相同供應(yīng)商的Q-TOF質(zhì)譜儀配對(duì)。在測(cè)試中，20/xlMiffi-Q水中10%(w/v)CDBAP的溶液被注射在5/xm顆粒大小的150x2.1lnertsil5ODS3柱上(Varian,Middelburg，theNetherlands)。流動(dòng)相A由Mffli-Q水中0.1。/。的三氟乙酸(TFA)溶液組成。最初的洗脫液組成為100%A。洗脫液被保持為100%A5分鐘。然后開(kāi)始10分鐘到達(dá)5%B的線性梯度，之后是IO分鐘到達(dá)30%B的線性梯度。通過(guò)將B的濃度在5分鐘內(nèi)提高至70%并在70%B再保持5分鐘來(lái)沖洗柱。之后在1分鐘內(nèi)將洗脫液改變?yōu)?00%A，平衡9分鐘?？傔\(yùn)行時(shí)間為50分鐘。洗脫液流為0.2ml每分鐘，柱溫度設(shè)定為6(TC。記錄215nm處的UV色譜圖。使用1分鐘的間隔時(shí)間(導(dǎo)致200Ml的級(jí)分體積)將洗脫級(jí)分收集在96孔板中。通過(guò)添加800.05%的水性氨水(25%)溶液來(lái)中和孔中的流出物。在氮?dú)庵?(TC下蒸發(fā)溶劑直至干燥。之后將殘余物重溶于40Ml的MiIIi-Q水中并混合1分鐘。為了進(jìn)行at-lineACE抑制測(cè)定，添加27yl磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)pH7.4中的33.4mUml"ACE(酶得自Sigma)溶液(有260mM的氯化物濃度)，允許混合物在％孔板中700rpm下孵育5分鐘。孵育周期后添加13^PBS緩沖液中的0.35mM馬尿酸-組氨酸-亮氨酸(HHL)溶液，在700ROM混合1分鐘。允許混合物在GC-烘箱中反應(yīng)60分鐘。反應(yīng)后將平板在熔化的冰上冷卻。然后在flash-HPLC柱上分析96孔板。將30/xl每孔的反應(yīng)混合物注射進(jìn)裝配了來(lái)自相同供應(yīng)商的10x4.6mmRP18e保護(hù)柱的ChromlithFlashRP18e25x4.6mmHPLC柱(Merck,Darmstadt,Germany)上。等度流動(dòng)相由水/乙腈79/21中0.1%的TFA溶液組成。洗脫流為2ml每分鐘，柱溫度為25°C。注射以1分鐘的間隔時(shí)間進(jìn)行。在280nm處監(jiān)測(cè)馬尿酸(H)和HHL。測(cè)量H和HHL的峰高并根據(jù)以下等式計(jì)算每種級(jí)分的ACE抑制(ACEI):<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>分析物的ACEIcx抑制百分比DCW水中ACE將HHL切割為H和HL的程度DC3分析物將HHL切割為H和HL的程度通過(guò)將H峰高表達(dá)為H和HHL峰高和的部分來(lái)計(jì)算切割的程度在18分鐘和26分鐘之間洗脫的級(jí)分中測(cè)量到最高的ACE抑制。收集該區(qū)并再注射于顆粒大小為3/mi的150x2.1mmBiosuite柱(Waters,Etten-Leur，theNetherlands)上。流動(dòng)相A由MiIIi-Q水中0.1%的甲酸(FA)溶液組成。流動(dòng)相B由甲醇中0.1%FA溶液組成。最初的洗脫成分為100%A。洗脫液被保持為100%A5分鐘。然后開(kāi)始15分鐘到達(dá)5%B的線性梯度，之后是30分鐘到達(dá)60%B的線性梯度。將洗脫液維持為60%B5分鐘。之后在l分鐘內(nèi)將洗脫液降低為100%流動(dòng)相A，平衡10分鐘?？傔\(yùn)行時(shí)間為65分鐘。洗脫液流為0.2ml每分鐘，柱溫度設(shè)定為60°C。記錄215nm處的UV色譜圖。使用10秒的間隔時(shí)間從Biosmte柱收集級(jí)分。再次將級(jí)分分為兩份，一份用于使用前文所述at-lineACE抑制方法測(cè)量活性，而另一份用于使用MS和MS-MS鑒定活性肽。分子離子326.2080Da的兩個(gè)色譜峰和分子離子330.2029Da和318.1488Da的另外兩個(gè)峰對(duì)應(yīng)于再18禾卩26分鐘之間區(qū)域測(cè)量的提高的ACE抑帝iJ。使用MS-MS將這些肽分別鑒定為IPP禾nLPP(扁0.6ppm)、ITP(-4.8ppm)和MAP(+2.8ppm)的結(jié)構(gòu)同分異構(gòu)體。肽的蛋白質(zhì)來(lái)源是K酪蛋白fl08-110(IPP)、|3-酪蛋白fl51-153(LPP)、a-s2-酪蛋白fll9-121(ITP)和/3-酪蛋白fl02-104(MAP)。先前IPP和LPP被報(bào)導(dǎo)為IC50值分別為5禾口9.6//M的ACE抑制肽(Y.Nakamura,M.Yamamoto.,K.Sakai.，A.Okubo.，S.Yamazaki,T.Takano,J.DairySci.78(1995)777-783;Y.Aryoshi,TrendsinFoodScienceandTechnol.4(1993)139-144)。然而，就我們所已知，三肽ITP和MAP從未被報(bào)導(dǎo)為可能的ACE抑制肽。MAP、ITP和IPP被化學(xué)合成，并使用下文所述的經(jīng)改進(jìn)的Matsui測(cè)定法測(cè)量每種肽的活性。在MicromassQuattraIIMS設(shè)備(再正電噴射、多重反應(yīng)監(jiān)控模式下運(yùn)行)上進(jìn)行多種樣品中MAP和ITP的定量。使用的HPLC方法與上述的方法相似。MS設(shè)定(ESI+)如下錐部電壓37V、毛細(xì)管電壓4kV、3001/h的干燥氮?dú)?。?lái)源和霧化溫度分別為IO(TC和250°C。使用合成的肽制備校準(zhǔn)線，對(duì)MAP使用先驅(qū)離子(precursorion)318.1和總和產(chǎn)物離子(summedproductions)227.2和347.2，對(duì)ITP使用先驅(qū)離子320.2和總禾口產(chǎn)物離子282.2和501.2。根據(jù)這些分析，新穎的ACE抑制三肽MAP和ITP以下述響應(yīng)量存在于CDBAP產(chǎn)物中2.9mgMAP/克CDBAP或4.8mgMAP/克CDBAP中的蛋白質(zhì)，0.9mgITP/克CDBAP禾Q1.4mgITP/克CDBAP中的蛋白質(zhì)。為了測(cè)定MAP和ITP的ACE抑制活性，根據(jù)Matsui等(Matsui,T.etaL(1992)Biosci.Biotech.Biochem.56:517-518)的方法進(jìn)行一些小修飾來(lái)測(cè)定化學(xué)合成的三肽。多種孵育顯示于表8中。表8:用于MatsuiACE抑制測(cè)定法的步驟。成分添加于1.5mL管中，終體積為120^1。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>四種樣品的每一種含有75/zl溶解于250mM硼酸鹽溶液的3mM馬尿酰組氨酸亮氨酸(Hip-His-Leu,Sigma),所述硼酸鹽溶液含有200mMNaCl,pH8.3。ACE得自Sigma?；旌衔镌?7。C孵育，30分鐘后通過(guò)添加125^0.5MHC1終止。隨后加入225bicine/NaOH溶液(lMNaOH:0.25Mbicine(4:6))，之后加入25jLtl0.1MTNBS(0.1MNa2HP04中的2,4,6-三石肖基苯磺酸，F(xiàn)luka，Switzerland)。再37。C孵育20分鐘后，加入4ml0.2MNa2HP04中的4mMNa2S03，用UV/Vis分光光度計(jì)(帶有CPS控制器的ShimadzuUV-1601,Netherlands)測(cè)量416nm處的吸光度。根據(jù)下式，將ACE抑制(ACEI)活性的數(shù)量計(jì)算為與不存在抑制劑時(shí)ACE轉(zhuǎn)化速率相比的抑制百分比ACEI(%)=((對(duì)照1-對(duì)照2)-(樣品1-樣品2))/(對(duì)照1-對(duì)照2))"00其中對(duì)照1二不含ACE抑制成分時(shí)的吸光度^最大ACE活性)[AU]。對(duì)照2=不含ACE抑制成分且不含ACE時(shí)的吸光度(背景)[AU]。樣品i=存在ACE禾口ACE抑制成分時(shí)的吸光度[AU]。樣品2=存在ACE抑制成分，但是不存在ACE時(shí)的吸光度[AU]。獲得的化學(xué)合成的MAP和ITP三肽的ICso與在本實(shí)驗(yàn)篩選階段使用的at-line測(cè)量中獲得的ICso值一起顯示于表9中?；虾铣傻腎PP的測(cè)量作為多種測(cè)量的內(nèi)部參考而被包括。表9:通過(guò)at-lineACE測(cè)定法和經(jīng)改進(jìn)的Matsui測(cè)定法測(cè)定的MAP、ITP禾口IPP的ACE抑制值(IC50值)。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>實(shí)施例8新穎的ACE抑制肽MAP和ITP很可能在人胃腸道中幸存被消耗后，飲食蛋白質(zhì)和肽被暴露于胃腸道中多種消化性酶過(guò)程。為了評(píng)價(jià)新鑒定的生物活性肽在人胃腸道中的穩(wěn)定性，將CDBAP制劑(如實(shí)施例7所述制備)進(jìn)行胃腸處理(GIT)，所述胃腸處理典型地模擬在人體中發(fā)現(xiàn)的消化條件。在GIT模型系統(tǒng)中不同的孵育時(shí)間后獲得的樣品使用on-lineHPLC-Bioassay-MS或HRS-MS系統(tǒng)定量任何殘留的MAP和ITP肽。在帶有100ml燒瓶的標(biāo)準(zhǔn)化的混合設(shè)備(如由Vankel，US所提供)中進(jìn)行GIT操作。水浴溫度設(shè)定為37.5t:，選擇攪棒速度使得樣品保持為懸浮液(IOOrpm)。將3.4克CDBAP(蛋白質(zhì)水平約60%)溶解/懸浮于100mlMiffi-Q水中。在胃模擬中，使用5MHC1降低pH。胃模擬結(jié)束和十二指腸階段時(shí)，使用5MNaOH提高pH。將CDBAP懸浮液預(yù)加熱至37.5。C并取出5ml懸浮液以溶解0.31g胃蛋白酶(Flukaorderno.77161)。T二0時(shí)，將5ml現(xiàn)溶解的胃蛋白酶加回懸浮液中。然后使用分離的pH計(jì)根據(jù)以下流程手動(dòng)緩慢調(diào)節(jié)CDBAP的pH:t二20分鐘，pH降低至3.5t二40分鐘，pH至3.0t二50分鐘，pH至2.3t二60分鐘，pH至1.8t二65分鐘，pH提高至2.7t^75分鐘，pH至3.7t二80分鐘，pH至5.3在t=90分鐘時(shí)，在另一5ml的CDBAP懸浮液中小心混合0.139g的8倍USP胰酶(Sigmaorderno.P7545)，立刻加回。根據(jù)以下流程繼續(xù)孵育t-93分鐘，pH調(diào)至5.5t二95分鐘，pH調(diào)至6.3t二100分鐘，pH調(diào)至7.1在t-125分鐘時(shí)停止實(shí)驗(yàn)并檢查pH(仍為pH7)。然后將樣品轉(zhuǎn)移至燒杯中并置于微波爐中直至沸騰。隨后將樣品轉(zhuǎn)移至玻璃管中并在95'C孵育60分鐘以滅活所有的蛋白酶活性。冷卻后將樣品置于Falcon管中，在3000xg離心10分鐘。將上清液冷凍干燥。測(cè)定獲得的粉末的總N濃度并使用酪蛋白的KjeldaW因子(6.38)將其轉(zhuǎn)換為蛋白質(zhì)水平。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，GIT操作后CDBAP制劑的蛋白質(zhì)水平是48.4%。在根據(jù)GIT的蛋白質(zhì)水解處理后幸存的MAP和ITP的水平如實(shí)施例7所述被測(cè)定，獲得的數(shù)據(jù)顯示在表10中。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，MAP和ITP均顯示針對(duì)GIT消化的高度抗性。結(jié)合這些三肽的IC50值(也在實(shí)施例7中測(cè)定)，數(shù)據(jù)提示兩個(gè)新穎的ACE抑制肽作為降血壓肽的巨大潛力。表10:經(jīng)過(guò)模擬的人胃腸道(GIT操作)之前和之后的MAP和ITP<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>權(quán)利要求1.三肽MAP和/或三肽ITP和/或MAP鹽和/或ITP鹽。2.包含MAP禾n/或ITP和/或MAP鹽和/或ITP鹽的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。3.如權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，其具有5。％到50%的DH，優(yōu)選地為10%到40%，更優(yōu)選地為20X到35X的DH。4.包含MAP和或ITP或MAP鹽和/或ITP鹽的肽混合物。5.如權(quán)利要求4所述的肽混合物，其包含至少1mg的MAP/克蛋白質(zhì)，優(yōu)選地至少2mgMAP/克蛋白質(zhì)，更優(yōu)選地至少4mgMAP/克蛋白質(zhì)。6.如權(quán)利要求4或5所述的肽混合物，其中具有小于500Da的MW的肽數(shù)量為肽混合物的至少30wt%(干物質(zhì))，優(yōu)選地為肽混合物的35wtX禾口70wtX(干物質(zhì))之間。7.如權(quán)利要求4到6中任一項(xiàng)所述的肽混合物，或如權(quán)利要求2或3所述的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，其還包含IPP或LPP。8.如權(quán)利要求4到6中任何一項(xiàng)所述的肽混合物，或如權(quán)利要求2或3所述的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，其包含1%到90%的水，優(yōu)選地包含1%到30%的水，更優(yōu)選地包含1%到15。％的水。9.生產(chǎn)三肽MAP和/或ITP和/或其鹽的方法，所述方法包括對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行酶水解，以及，任選地，將MAP和/或ITP轉(zhuǎn)化為其鹽。10.如權(quán)利要求9所述的方法，包括使用蛋白酶水解合適的蛋白質(zhì)，優(yōu)選地使用脯氨酸特異蛋白酶。全文摘要本發(fā)明描述三肽MAP和/或三肽ITP和/或其鹽。文檔編號(hào)A61K38/06GK101171024SQ200680014769公開(kāi)日2008年4月30日申請(qǐng)日期2006年4月27日優(yōu)先權(quán)日2005年4月28日發(fā)明者克里斯帝諾思·雅各布斯·凡普拉德蔭克,安德烈·利納爾杜斯·魯斯·德,魯波·伊第恩斯申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司