一種聚3-羥基丙酸共聚物及其生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種聚3-羥基丙酸共聚物及其生產(chǎn)方法，屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明通過基因整合技術(shù)在宿主菌基因組上整合甘油脫水酶基因和甘油脫水酶再激活酶基因，并導(dǎo)入聚羥基脂肪酸合成酶基因、丙醛脫氫酶基因、β-酮脂酰輔酶A硫解酶基因、乙酰乙酰輔酶A還原酶基因和丙酰輔酶A合成酶基因，重組后的基因工程菌具有生物合成聚3-羥基丙酸-co-3-羥基戊酸的能力。本發(fā)明首次通過生物合成的方式獲得了聚3-羥基丙酸-co-3-羥基戊酸。與聚3-羥基丙酸相比，所得的聚3-羥基丙酸-co-3-羥基戊酸具有更高的熔點和更低的結(jié)晶性，具有較佳的可降解性，可作為包裝材料、醫(yī)用植入材料、藥物緩釋材料和電化學(xué)材料。
【專利說明】一種聚3-羥基丙酸共聚物及其生產(chǎn)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種聚3-羥基丙酸共聚物及其生產(chǎn)方法，屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 化石能源危機日益嚴重，生物燃料的制造成為研究焦點。生物柴油是生物液體燃 料中最重要的一種。伴隨著生物柴油的大量生產(chǎn)，其副產(chǎn)物甘油的大量積累。據(jù)初步估算， 每生產(chǎn)10噸生物柴油會制造1噸的粗甘油。生物柴油的進一步增長，造成甘油價格的不斷 降低。充分利用價格低廉的甘油生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品，可以帶來巨大經(jīng)濟效益和環(huán)境效益，受 到越來越多的重視。
[0003] 聚羥基脂肪酸酯是一種通過微生物發(fā)酵獲得的生物塑料，可以利用葡萄糖、甘油 等廉價碳源合成（Drumright RE, Gruber PR, Henton DE. Polylactic acid technology. Adv Mater, 2000 ; 12:1841 - 6.)。其物理性能與傳統(tǒng)塑料相似甚至優(yōu)于傳統(tǒng)塑料，具有生物降解 性，不會造成污染，可用于制造醫(yī)療器械、包裝材料、農(nóng)田地膜等。
[0004] 聚3-羥基丙酸（P3HP)是一種擁有廣闊發(fā)展前景的新型可降解塑料，具有 優(yōu)異的生物材料性質(zhì)和機械性能，比如具有高機械強度和拉伸強度、高斷裂伸長量、 生物降解性、生物相容性、無毒及熱塑性等（Wang Q, Liu C, Xian M, Zhang YG, Zhao G. Biosynthetic pathway for poly(3-hydroxypropionate)in recombinant Escherichia coli. J Microbiol, 2012, 50(4) :693-697. ；ffang Q, Yang P, Liu C, Xue Y, Xian M, Zhao G.Biosynthesis of poly (3-hydroxypropionate)from glycerol by recombinant Escherichia coli. BioresourceTechnol, 2013, 131:548-51. ；ffang Q, Yang P, Xian M, Yang Y, Liu C, Xue Y, Zhao G. Biosynthesis of poly(3-hydroxypropionate-c〇-3-hydroxybutyra te)with fully controllable structures from glycerol. BioresourTechnol, 2013, 142:74 1-4.)。聚3-羥基丙酸在性質(zhì)上還存在一定缺陷，如熔點較低、結(jié)晶導(dǎo)致不透明等在一定程 度上限制了其應(yīng)用（Andree β en B, Steinbuchel A. Biosynthesis and biodegradation of3 -hydroxypropionate-containing polyesters. Appl Environ Microbiol, 2010, 76 (15) : 491 9-25.) 〇


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新型聚3-羥基丙酸共聚物，其結(jié)構(gòu)式為：
[0006]

【權(quán)利要求】
1. 一種聚3-羥基丙酸共聚物，其特征在于，結(jié)構(gòu)式如下所示：
2. -種產(chǎn)權(quán)利要求1所述共聚物的基因工程菌，其特征在于，在宿主菌基因組上整合 甘油脫水酶基因和甘油脫水酶再激活酶基因，并導(dǎo)入聚羥基脂肪酸合成酶基因、丙醛脫氫 酶基因 、β -酮脂酰輔酶A硫解酶基因、乙酰乙酰輔酶A還原酶基因和丙酰輔酶A合成酶基 因，重組后的基因工程菌具有生物合成聚3-羥基丙酸-co-3-羥基戊酸的能力。
3. 權(quán)利要求2所述基因工程菌，其特征在于，所述宿主菌為大腸桿菌。
4. 權(quán)利要求2所述基因工程菌，其特征在于，所述甘油脫水酶基因來源于Klebsiella pneumoniae的dhaB基因；甘油脫水酶再激活酶基因為來源于Klebsiella pneumoniae的 gdrAB基因；聚輕基脂肪酸合成酶基因來源于Ralstonia eutrophaH16的phaCl基因；丙醒 脫氫酶基因來源于Salmonella typhimurium的pduP基因；β -酮脂酰輔酶A硫解酶基因來 源于Ralstonia eutrophaH16的bktB基因；乙酰乙酰輔酶A還原酶基因來源于Ralstonia eutrophaH16的phaBl基因；丙醜輔酶A合成酶基因來源于Chloroflexiaurantiacus的 pcs'基因。
5. -種產(chǎn)權(quán)利要求1所述共聚物基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟如下： 1) 宿主菌基因的整合：將甘油脫水酶基因 dhaB和甘油脫水酶再激活酶基因 gdrAB整 合到宿主菌基因組上，獲得基因整合宿主菌； 2) 重組質(zhì)粒的構(gòu)建：分別構(gòu)建含有丙醛脫氫酶基因 pduP、聚羥基脂肪酸合成酶基因 phaCl重組質(zhì)粒和含有β -酮脂酰輔酶A硫解酶基因 bktB、乙酰乙酰輔酶A還原酶基因 phaBl、丙酰輔酶A合成酶基因 pcs'的重組質(zhì)粒； 3) 基因工程菌的構(gòu)建：將步驟2)所得的兩個重組質(zhì)粒導(dǎo)入步驟1)所得的基因整合宿 主菌，獲得基因工程菌。
6. 權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，步驟1)所述宿主菌基因的整合，是通過搭橋 PCR得到目的片段gdrAB-dhaB片段，以自殺質(zhì)粒pRE112為媒介與大腸桿菌進行同源重 組將gdrAB-dhaB整合到大腸桿菌基因組中得到基因整合宿主菌；步驟2)所述重組質(zhì)粒 的構(gòu)建，是通過克隆丙醛脫氫酶基因 pduP和聚羥基脂肪酸合成酶基因 phaCl，通過搭橋 PCR得到目的基因片段phaCl-pduP，再將目的基因片段和質(zhì)粒pET21a進行雙酶切并酶連 后得到重組質(zhì)粒pET21a-phaCl-pduP ;通過克隆β -酮脂酰輔酶A硫解酶基因 bktB，同時 克隆乙酰乙酰輔酶A還原酶基因 phaBl和丙酰輔酶A合成酶基因 pcs'，通過搭橋PCR得 到目的基因片段bktB-phaBl-pcs'，將目的基因片段和質(zhì)粒pBAD18進行雙酶切并酶連后 得到重組質(zhì)粒pBAD18-bktB-phaBl-pcs' ；步驟3)所述基因工程菌的構(gòu)建，是將重組質(zhì)粒 pET21a-phaCl-pduP和重組質(zhì)粒pBAD18-bktB-phaBl-pcs'導(dǎo)入到基因整合宿主菌中，獲得 重組大腸桿菌。
7. 權(quán)利要求5或6所述方法，其特征在于，所述甘油脫水酶基因來源于Klebsiella pneumoniae的dhaB基因；甘油脫水酶再激活酶基因為來源于Klebsiella pneumoniae的 gdrAB基因；聚輕基脂肪酸合成酶基因來源于Ralstonia eutrophaH16的phaCl基因；丙醒 脫氫酶基因來源于Salmonella typhimurium的pduP基因；β -酮脂酰輔酶A硫解酶基因來 源于Ralstonia eutrophaH16的bktB基因；乙酰乙酰輔酶A還原酶基因來源于Ralstonia eutrophaH16的phaBl基因；丙醜輔酶A合成酶基因來源于Chloroflexiaurantiacus的 pcs'基因。
8. -種發(fā)酵生產(chǎn)聚3-羥基丙酸-co-3-羥基戊酸的方法，其特征在于，步驟如下： 1) 宿主菌基因的整合：將甘油脫水酶基因 dhaB和甘油脫水酶再激活酶基因 gdrAB整 合到宿主菌基因組上，獲得基因整合宿主菌； 2) 重組質(zhì)粒的構(gòu)建：分別構(gòu)建含有丙醛脫氫酶基因 pduP、聚羥基脂肪酸合成酶基因 phaCl和β -酮脂酰輔酶A硫解酶基因 bktB、乙酰乙酰輔酶A還原酶基因 phaBl、丙酰輔酶 A合成酶基因 pcs'的重組質(zhì)粒； 3) 基因工程菌的構(gòu)建：將步驟2)所得的兩個重組質(zhì)粒導(dǎo)入步驟1)所得的基因整合宿 主菌，獲得基因工程菌； 4) 利用步驟3)得到的基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)聚3-羥基丙酸-co-3-羥基戊酸。
9. 權(quán)利要求8所述方法，其特征在于，所述宿主菌為大腸桿菌；所述甘油脫水酶基因來 源于Klebsiella pneumoniae的dhaB基因；甘油脫水酶再激活酶基因為來源于Klebsiella pneumoniae的gdrAB基因；聚輕基脂肪酸合成酶基因來源于Ralstonia eutrophaH16的 phaCl基因；丙醒脫氫酶基因來源于Salmonella typhimurium的pduP基因 ；β -酮脂 酰輔酶Α硫解酶基因來源于Ralstonia eutrophaH16的bktB基因；乙酰乙酰輔酶Α還 原酶基因來源于Ralstonia eutrophaH16的phaBl基因；丙酰輔酶A合成酶基因來源于 Chloroflexiaurantiacus 的 pcsJ 基因。
10. 權(quán)利要求1所述共聚物，其特征在于，用于包裝材料、醫(yī)用植入材料、藥物緩釋材料 和電化學(xué)材料中。
【文檔編號】C12P7/62GK104046659SQ201410272402
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月18日
【發(fā)明者】咸漠, 趙廣, 馮新軍 申請人:中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所