一種重組大腸桿菌及合成3-羥基丙酸中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種3-羥基丙酸的制備方法，特別涉及一種生產(chǎn)3-羥基丙酸的重組大 腸桿菌及其制備方法和應(yīng)用。 (二)
【背景技術(shù)】
[0002] 縱觀世界經(jīng)濟(jì)發(fā)展，以石油為基礎(chǔ)的化石能源起到了功不可沒的作用，但隨著化 石能源日益枯竭、全球油價(jià)不斷飆升、環(huán)境污染日趨嚴(yán)重等問題的出現(xiàn)，許多國家都更加重 視對(duì)可再生能源、環(huán)保能源以及新型能源的開發(fā)與研究；同時(shí)隨著人類科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn) 步，通過不斷開發(fā)新型化學(xué)、生物方法，將使以生物資源為基礎(chǔ)的生物加工過程替代傳統(tǒng)化 學(xué)工業(yè)成為可能。因此，從化石經(jīng)濟(jì)向生物經(jīng)濟(jì)過渡，由生物基原料代替石油基原料生產(chǎn)化 工原料，是社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的必然趨勢。
[0003] 近年來，生物柴油作為一種極具發(fā)展前景的生物資源得到了快速的發(fā)展，而在此 過程中，每生產(chǎn)10噸生物柴油就會(huì)產(chǎn)生1噸甘油，這不可避免地造成了市場上廉價(jià)甘油的過 剩，因此，加快甘油下游產(chǎn)品開發(fā)的基礎(chǔ)研究迫在眉睫。為了解決這一問題，業(yè)界興起了以 甘油為原料生產(chǎn)其他化學(xué)品的熱潮，當(dāng)前利用甘油的有效途徑包括:生產(chǎn)乙醇，制備1，3_丙 二醇，合成環(huán)氧氯丙烷，生產(chǎn)乙二醇，生產(chǎn)乳酸，合成二羥基丙酮等。研發(fā)甘油的革新用途， 建立其下游化學(xué)品開發(fā)利用的有效途徑，降低生物柴油生產(chǎn)成本，提高資源利用率成為這 一新興能源產(chǎn)業(yè)面臨的巨大挑戰(zhàn)，也是科學(xué)家們不斷探索的新問題。
[0004] 3-羥基丙酸（3-HP)是一種三碳無手性有機(jī)酸，與乳酸是同分異構(gòu)體，可與水、醇、 醚等多種有機(jī)溶劑互溶。其性質(zhì)較為活潑，工業(yè)上可以用來合成很多重要的化工產(chǎn)品，如脫 水生成丙烯酸，氧化生成丙二酸，與醇發(fā)生酯化作用生成酯，還可通過還原作用生成1，3-丙 二醇等。另外，還可用于生產(chǎn)涂料、膠黏劑、水處理化學(xué)品和個(gè)人護(hù)理用品等。鑒于3-HP在商 業(yè)上的重大開發(fā)價(jià)值，2004年，美國能源部也將3-HP列為當(dāng)前世界上12中最具開發(fā)潛力的 化工產(chǎn)品之一。因此，以甘油為原料生物合成3-羥基丙酸的研究有望成為甘油下游產(chǎn)品開 發(fā)的另一個(gè)具有重要價(jià)值的新途徑。
[0005] 3-HP的合成方法大致可分為化學(xué)合成法和生物合成法兩大類。目前，3-HP的制備 主要依靠化學(xué)法，即將鄰鹵代醇與氰化鉀作用生成的3-羥基丙腈進(jìn)行水解或通過Reformat sky反應(yīng)來制備3-HP。此外，將丙烯酸催化水解也可得到3-HP，這是市場上3-HP的主要來源。 然而由于丙烯酸和丙烯腈易燃，且工藝需高溫操作，故化學(xué)合成法的安全性較低、對(duì)設(shè)備的 要求也較高。同時(shí)，由于丙烯酸的原料來源限制，該方法生產(chǎn)的3-HP已經(jīng)遠(yuǎn)不能滿足市場的 需求，這在很大程度上限制了 3-HP化學(xué)合成技術(shù)的發(fā)展，并且導(dǎo)致了 3-HP的價(jià)格高居不下， 目前3-HP的國內(nèi)市場售價(jià)高達(dá)8.5萬元/噸，這也進(jìn)一步阻礙了其下游產(chǎn)品的開發(fā)利用。與 之相反，以甘油為原料采用生物合成法生產(chǎn)3-HP不但可以有效利用生物柴油生產(chǎn)過程中產(chǎn) 生的大量副產(chǎn)物，延伸生物柴油產(chǎn)業(yè)鏈，還能有效降低3-HP的生產(chǎn)成本，加快其工業(yè)化應(yīng)用 的進(jìn)程。
[0006] 生物合成法合成3-HP包括兩種方法：（1)采用野生菌株；（2)構(gòu)建基因工程菌株。早 在1962年就有通過微生物直接發(fā)酵合成3-HP的報(bào)道，然而接下來卻長期處于實(shí)驗(yàn)室研究當(dāng) 中，并沒有大規(guī)模生產(chǎn)。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，構(gòu)建基因工程菌株生產(chǎn)3-HP，提高3-HP 的產(chǎn)量，已經(jīng)成為現(xiàn)在研究的熱點(diǎn)。目前，按照利用底物不同的所構(gòu)建的基因工程菌有兩 種：
[0007] A.以葡萄糖為底物
[0008] 美國Cargill公司與陶氏公司開展了 "以谷物類碳水化合物生產(chǎn)3-HP的發(fā)酵新工 藝"這一合作項(xiàng)目。該公司利用玉米制得葡萄糖，然后通過構(gòu)建基因工程菌來發(fā)酵制得3-HP，其路徑主要包括:從橙色綠曲撓菌中克隆乳酰輔酶A脫水酶活性的多肽編碼基因，從人 類細(xì)胞中克隆有羥基丙酰輔酶A脫水酶活性的酶編碼基因，前者將乳酰輔酶A脫水生成丙烯 酰輔酶A，后者可催化丙烯酰輔酶A水合生成羥基丙酰輔酶A。羥基丙酰輔酶A在一定條件下 脫去輔酶A生成羥基丙酸。
[0009] B.以甘油為底物
[0010] 重組菌株催化甘油合成3-HP需要甘油脫水酶和醛脫氫酶的共同作用。第一步是甘 油脫水酶在輔酶維生素 B12的作用下，將甘油脫水轉(zhuǎn)化成3-羥基丙醛(3-HPA);第二步是3-HPA在醛脫氫酶的氧化作用下生成3-HP，在此過程中生成還原當(dāng)量NADH，產(chǎn)生的3-HP是細(xì)胞 代謝的終產(chǎn)物，可在發(fā)酵液中高度聚集，其主要代謝反應(yīng)路徑如圖1所示。其中編碼甘油脫 水酶的基因?yàn)閐haB基因，主要存在于克雷伯氏桿菌(Klebsiella pneumoniae)、乳酸桿菌 (Lactobacillus reuteri)、弗氏朽1 檬菌（Citrobacter freundii)、巴氏梭狀芽抱桿菌 (Clostridium pasteuianu)中，而醛脫氫酶則負(fù)責(zé)將3-HPA轉(zhuǎn)化成3-HP，編碼醛脫氫酶的基 因有四種，分別為:aldh4、ald2、aldA和aldB，前兩種來源于酵母菌，后兩種則來源于大腸桿 菌。
[0011] 迄今為止，構(gòu)建基因工程菌制備3-HP的研究取得了一定的進(jìn)展，但是還存在諸多 問題：（1)以大腸桿菌為宿主，3-HP產(chǎn)量相對(duì)較高，但由于其自身不具有甘油脫水酶活性，構(gòu) 建過程復(fù)雜，并且大腸桿菌自身不能生成甘油脫水酶的輔酶維生素 B12，需要在發(fā)酵體系中 額外加入，因其價(jià)格昂貴，從而使發(fā)酵成本大增；（2)代謝過程中會(huì)產(chǎn)生各種副產(chǎn)物，分離純 化困難；（3)重組菌中甘油脫水酶和醛脫氫酶的活性不平衡，且輔酶NAD+再生困難也是制約 3-HP產(chǎn)量的重要原因。 (三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明目的是針對(duì)現(xiàn)有問題，提供了一株敲除菌，用于降低副產(chǎn)物1，3_丙二醇（1， 3-PD0)的產(chǎn)量，同時(shí)再生醛脫氫酶的輔因子NAD+的菌株。
[0013] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0014] 本發(fā)明提供一種重組大腸桿菌，所述重組大腸桿菌是將甘油脫水酶基因 dhaB123、 甘油脫水酶再激活因子基因 gdrA(甘油脫水酶基因 dhaB123和甘油脫水酶再激活因子基因 gdrA的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示）、α-酮戊二酸半醛脫氫酶突變體編碼基因 TUkgsadh (核苷酸序列為SEQ ID N0.3所示）和甘油三磷酸脫氫酶編碼基因 gpdl(核苷酸序列為SEQ ID NO.4所示）導(dǎo)入宿主菌中構(gòu)建而成;所述宿主菌為敲除乙醛還原酶/醇脫氫酶基因 yqhD (Gene ID:947493)的大腸桿菌，所述α-酮戊二酸半醛脫氫酶突變體是將α-酮戊二酸半醛脫 氫酶KGSADH(核苷酸序列為SEQ ID Ν0.2所示）的120位谷氨酸突變?yōu)樘於彼幔?19位脯氨 酸突變?yōu)楸彼岖@得的。
[0015] 進(jìn)一步，所述甘油脫水酶基因 dhaB123和甘油脫水酶再激活因子基因 gdrA通過重 組載體pACYCDuet-tac-dhaBl 23-gdrA導(dǎo)入宿主菌中。
[0016] 進(jìn)一步，所述α-酮戊二酸半醛脫氫酶突變體基因 TUkgsadh通過重組載體 pCDFDuet-tac-gpdl-TUkgsadh 導(dǎo)入宿主菌中。
[0017] 進(jìn)一步，所述甘油三磷酸脫氫酶編碼基因 gpdl通過重組載體pCDFDuet-tac-gpdl-TUkgsadh導(dǎo)入宿主菌中。
[0018] 進(jìn)一步，所述大腸桿菌為E.coli W3110。
[0019] 本發(fā)明還提供一種所述重組大腸桿菌在合成3-羥基丙酸中的應(yīng)用，具體所述的應(yīng) 用：將重組大腸桿菌接種至含50mg/L氯霉素和50mg/L硫酸鏈霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中（以甘油 為底物），在37°C、150rpm條件下振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.4~0.8時(shí)，向發(fā)酵液中加入終濃度 0.01~0.5mM的IPTG，同時(shí)加入終濃度5g/L的VB 12(維生素 B12)，在28°C、150rpm條件下誘導(dǎo) 發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束獲得含3-羥基丙酸的發(fā)酵液，將發(fā)酵液分離純化，獲得3-羥基丙酸;所述發(fā) 酵培養(yǎng)基濃度組成為：甘油 10_30g/L(優(yōu)選30g/L)，NaCl lg/L，MgS〇4 · 7H20 0.25g/L， Na2HP〇4 · 12H20 22.7g/L，KH2P〇43g/L，酵母膏4g/L，（NH4)2S〇43.2g/L，溶劑為去離子水，pH 值為7.0。
[0020] 進(jìn)一步，優(yōu)選所述IPTG終濃度為0 · OlmM。
[0021] 進(jìn)一步，所述重組大腸桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)前先進(jìn)行斜面活化和種子培養(yǎng)，所述斜面 活化為:將重組大腸桿菌接種至含50mg/L氯霉素和50mg/L硫酸鏈霉素的LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng) 基，在37°C培養(yǎng)16h，獲得活化后的重組大腸桿菌;所述種子培養(yǎng)為:將活化后的重組大腸桿