一種3-羥基丙酸高產(chǎn)菌重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化工生產(chǎn)領(lǐng)域，涉及一種高產(chǎn)3-羥基丙酸基因工程菌重組質(zhì)粒 的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 3-羥基丙酸（3-HP)在工業(yè)應(yīng)用上有很高的商業(yè)價(jià)值，但其化學(xué)合成方法較為復(fù) 雜。近年來，隨著合成生物學(xué)成為生物化工的研宄熱點(diǎn)，微生物合成法產(chǎn)3-羥基丙酸亟待 突破。肺炎克雷伯氏桿菌（Klebsiella pneumoniae)具有較強(qiáng)的甘油代謝能力，從生物量 積累的角度來看很適合作表達(dá)宿主。肺炎克雷伯氏桿菌利用甘油生成中間產(chǎn)物3-羥基丙 醛，然后3-羥基丙醛被醛脫氫酶催化生成3-羥基丙酸。
[0003] 在以肺炎克雷伯氏桿菌為宿主菌生產(chǎn)3-羥基丙酸的方法中，工程菌所用的啟動(dòng) 子多為來自于dhaB基因自身的pk啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子具有啟動(dòng)能力弱，從而使蛋白表達(dá)量 小等缺點(diǎn)，影響了 3-羥基丙酸的產(chǎn)量。因此，尋找出一種適合于肺炎克雷伯氏桿菌的強(qiáng)效 啟動(dòng)子和產(chǎn)3-羥基丙酸的醛脫氫酶來構(gòu)建工程菌成為了高產(chǎn)3-羥基丙酸的突破口。
[0004] 經(jīng)過大量篩選，發(fā)現(xiàn)tac啟動(dòng)子啟動(dòng)能力強(qiáng)，且適用于肺炎克雷伯氏桿菌。于是， 創(chuàng)立了一種構(gòu)建3-羥基丙酸高產(chǎn)工程菌的方法，在tac啟動(dòng)子后面連接上醛脫氫酶基因 puuC，測(cè)定了醛脫氫酶puuC的蛋白表達(dá)量和體內(nèi)外酶活性。結(jié)果顯示，醛脫氫酶在tac啟 動(dòng)子的作用下得到了超表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，測(cè)定了 3-羥基丙酸產(chǎn)量，得到了高產(chǎn)3-羥基丙 酸工程菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 鑒于現(xiàn)有產(chǎn)3-羥基丙酸工程菌產(chǎn)量大都較低，本發(fā)明旨在創(chuàng)立一種3-羥基丙酸 高產(chǎn)工程菌的方法，并確定了該工程菌發(fā)酵的最佳培養(yǎng)條件。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如 下：
[0006] 一種生產(chǎn)3-羥基丙酸菌株的重組質(zhì)粒，其特征在于：導(dǎo)入了 tac啟動(dòng)子和PimC醛 脫氣酶基因。
[0007] 進(jìn)一步，所述重組質(zhì)粒被導(dǎo)入于肺炎克雷伯氏菌。
[0008] -種構(gòu)建所述重組質(zhì)粒的方法，包括以下步驟：
[0009] 1)將啟動(dòng)子tac和醛脫氫酶基因 puuC插入載體質(zhì)粒中，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET (ptac-puuC)；
[0010] 2)用所構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到肺炎克雷伯氏菌中。
[0011] 進(jìn)一步，其特征在于所述構(gòu)建重組質(zhì)粒包括：
[0012] 1)含有puuC基因的DNA片段的PCR擴(kuò)增；
[0013] 2)限制性內(nèi)切酶切割載體質(zhì)粒和基因 puuC、ptac ;
[0014] 3)將puuC基因和啟動(dòng)子ptac插入所述載體質(zhì)粒中。
[0015] 一種生產(chǎn)3-羥基丙酸的方法，是對(duì)導(dǎo)入了含有tac啟動(dòng)子和醛脫氫酶基因 puuC 的pET-28a重組質(zhì)粒的肺炎克雷伯氏菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并自發(fā)酵液中獲得3-HP。
[0016] 進(jìn)一步，所述發(fā)酵液為！K2HPO4 · 3H20 4-6g/L、KH2PO4L 5-2. 4g/L、 (NH4) 2S046. 4-9. 6g/L、MgSO4 · 7H20 0· 1-0. 2g/L、酵母粉 3· 2-4. 8g/L、IPTG 濃度為 0. 015-0. 025mM、以及甘油含量維持到30g/L以上。
[0017] 進(jìn)一步，所述發(fā)酵培養(yǎng)為流加培養(yǎng)方式，使pH恒定于6. 5-7. 5之間，通氣量保持在 1. 5vvm，攬拌轉(zhuǎn)速為400rpm〇
[0018] ptac-puuC基因序列具有如NO. 1的基因序列。
[0019] 經(jīng)過大量篩選，發(fā)現(xiàn)了適用于肺炎克雷伯氏桿菌的高效tac啟動(dòng)子以及能轉(zhuǎn)化 3-羥基丙醛為3-羥基丙酸的puuc醛脫氫酶，并以此構(gòu)建重組工程菌。將該酶編碼基因的 序列進(jìn)行分析后，對(duì)該基因進(jìn)行了化學(xué)合成。測(cè)序驗(yàn)證后將該啟動(dòng)子和酶在肺炎克雷伯氏 桿菌中超表達(dá)，獲得了重組肺炎克雷伯氏桿菌pET (ptac-puuc)，測(cè)定其體內(nèi)及體外對(duì)3-輕 基丙醛的催化能力。在體外，該酶對(duì)3-羥基丙醛的酶活達(dá)到26. 31U/mg，是原代肺炎克雷 伯氏桿菌（3. 82U/mg)的6. 9倍。在5L發(fā)酵罐中培養(yǎng)改造后的工程菌，經(jīng)培養(yǎng)基成分、IPTG 濃度條件優(yōu)化后，其48h后3-羥基丙酸產(chǎn)量高達(dá)73g/L。
【附圖說明】
[0020] 圖1重組肺炎克雷伯氏桿菌pET (ptac-puuC)的SDS-PAGE分析圖.
[0021] M-marker ； 1-K. pneumoniae(ptac) ；2~K.pneumoniae(ptac-puuC)
[0022] 圖2不同濃度培養(yǎng)基成分對(duì)3-羥基丙酸和生物量的影響.
[0023] A = K2HPO4 · 3H20 ;B:KH2P04;C: (NH4) 2S04;D = MgSO4 · 7H20 ;E: Yeast extract (酵母 粉）.Biomass:生物量；3-HP :3_ 羥基丙酸；Lactic acid:乳酸；Acetic acid:乙酸
[0024] 圖3不同濃度的IPTG對(duì)重組菌的影響
[0025] Biomass:生物量；3-HP :3_ 羥基丙酸；Lactic acid :乳酸；Acetic acid:乙酸
[0026] 圖4重組菌Κ· pneumoniae (ptac-puuC)的上罐發(fā)酵圖
[0027] 3-HP :3_ 羥基丙酸；Lactic acid :乳酸；Acetic acid :乙酸；
[0028] 1，3-PD: 1，3-丙二醇；1，3_PD:2, 3- 丁二醇；Biomass:生物量
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面的具體方法可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限 制本發(fā)明。
[0030] 本發(fā)明方法的具體步驟包括：
[0031] 1.肺炎克雷伯氏桿菌中tac啟動(dòng)子和醛脫氫酶puuc的克隆
[0032] 菌株及質(zhì)粒：大腸桿菌（E. coli) toplO購自北京博邁德公司，肺炎克雷伯氏桿菌 (Klebsiella pneumoniae)DSM2026從德國DSM購買，表達(dá)載體pET-28a從諾維信公司購買。
[0033] 培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基（g/L)蛋白胨10,酵母粉5, NaCl 10,固體培養(yǎng)基中加入1. 5% (100ml液體培養(yǎng)基中加入I. 5g瓊脂）的瓊脂?？剐耘囵B(yǎng)基需加入50 μ L/mL硫酸卡那霉 素。
[0034] 肺炎克雷伯氏桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L) !K2HPO4 · 3H20,3. 4 ;KH2P04,1. 3 ; (NH4)2SO4, 4 ;MgS04 · 7Η20,0· 5 ;CaC03,0.1 ;酵母粉，3 ;甘油，40 ;微量元素，I. 25mL/L(lL 培養(yǎng)基中加入 I. 25mL微量元素）。
[0035] 微量元素溶液（g/L)FeS04 · 7H20,1 ;ZnCl2,0. 07 ;CuCl2 · 2Η20,0· 02 ;MnCl2 · 4H20， 0· I ;NiCl2 · 6Η20,0· 025 ;H3B03,0 . 06 ;Na2M04 · 2Η20,0· 035 ;CoC12 · 2Η20,0· 2 ;飽和 HC1，4mL。
[0036] 分子克隆及表達(dá)：將篩選得到的基因序列進(jìn)行化學(xué)合成，連接至載體pET_28a中， 得到重組質(zhì)粒pET (ptac-puuC)，轉(zhuǎn)入大腸桿菌toplO中進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。之后將提取的質(zhì)粒 電穿孔轉(zhuǎn)化至肺炎克雷伯氏桿菌并進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果顯示tac啟動(dòng)子和醛脫氫酶基因 puuC連接正確。
[0037] 2.醛脫氫酶的表達(dá)
[0038] 在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組菌，在第12h取出發(fā)酵液，12000rpm離心10min，去上 清。將收集到的菌體用 50mM 的 PBS 緩沖液（ΚΗ2Ρ04,0· 27g/L ;Na2HP04,1. 42g/L ;NaCl，8g/L ; KC1，0. 2g/L)重懸。隨后將菌體置于冰上，超聲破碎細(xì)胞，功率為100W，工作3s，停止2s，共 50次。破碎后將適量破碎液加入到酶活反應(yīng)體系（50mM PBS緩沖液，0.2mM 3-羥基丙醛， 0. 4mM氨基安替比林，7mM苯酷，7U過氧化氫酶）中，37°C進(jìn)行反應(yīng)5min后在500nm下測(cè)定 吸光度。一個(gè)活力單位定義為在該條件下，Imin催化生成1 μ mol過氧化氫所需要的酶量。
[0039] 測(cè)定puuC醛脫氫酶的SDS-PAGE蛋白電泳。
[0040] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，醛氧化酶在體外對(duì)3-羥基丙醛的活性達(dá)到了 26. 31U/mg，為對(duì)照 組的5. 9倍。
[0041] 3.最佳培養(yǎng)條件的確定
[0042] 根據(jù)搖瓶發(fā)酵確定重組菌產(chǎn)3-羥基丙酸的最佳培養(yǎng)條件。
[0043] 在250ml搖瓶中裝入IOOrnl發(fā)酵培養(yǎng)基，置于搖床中，37°C且150rpm條件下進(jìn)行 搖瓶發(fā)酵。每隔3h取出一次發(fā)酵液進(jìn)行3-羥基丙酸產(chǎn)量的測(cè)定。分析方法如下：發(fā)酵液 中的產(chǎn)物質(zhì)量濃度采用島津高效液相色譜SPD-20A測(cè)定，色譜柱為C18柱，柱溫30°C，流動(dòng) 相為0.05%磷酸，工作流速為0.8111171^11，檢測(cè)器采用紫外檢測(cè)器。取11^發(fā)酵液12000印111 離心10min，取上清液用于高效液相色譜檢測(cè)，樣品分析前經(jīng)0. 22 μ m微濾膜過濾。甘油的 測(cè)定方法使用的是高碘酸鈉氧化法。
[0044] 培養(yǎng)基成分的確定：
[0045] 根據(jù)搖瓶發(fā)酵條件圖2示，得到最佳培養(yǎng)基成分配制范圍：
[0046] 表1最佳培養(yǎng)基成分
[0047]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種生產(chǎn)3-羥基丙酸菌株的重組質(zhì)粒，其特征在于：導(dǎo)入了 tac啟動(dòng)子和puuC醛 脫氣酶基因。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，其特征在于：所述重組質(zhì)粒被導(dǎo)入于肺炎克雷伯 氏菌。
3. -種構(gòu)建權(quán)利要求2所述重組質(zhì)粒的方法，包括以下步驟： 1) 將啟動(dòng)子tac和醛脫氫酶基因puuC插入載體質(zhì)粒中，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET (ptac-puuC)； 2) 用所構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到肺炎克雷伯氏菌中。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于所述構(gòu)建重組質(zhì)粒包括： 1) 含有puuC基因的DNA片段的PCR擴(kuò)增； 2) 限制性內(nèi)切酶切割載體質(zhì)粒和基因puuC、ptac ; 3) 將puuC基因和啟動(dòng)子ptac插入所述載體質(zhì)粒中。
5. -種生產(chǎn)3-羥基丙酸的方法，是對(duì)導(dǎo)入了含有tac啟動(dòng)子和醛脫氫酶基因puuC的 pET-28a重組質(zhì)粒的肺炎克雷伯氏菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并自發(fā)酵液中獲得3-HP。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：所述發(fā)酵液為：K 2HP04 ? 3H20 4-6g/L、 KH2PO4 I. 5-2. 4g/L、（NH4)2SO4 6. 4-9. 6g/L、MgSO4 ? 7H20 0? 1-0. 2g/L、酵母粉 3. 2-4. 8g/L、 IPTG濃度為0. 015-0. 025mM、以及甘油含量維持到30g/L以上。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述方法，其特征在于：所述發(fā)酵培養(yǎng)為流加培養(yǎng)方式，使pH恒 定于6. 5-7. 5之間，通氣量保持在I. 5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，具有如NO. 1的ptac-puuC基因序列。
【專利摘要】一種3-羥基丙酸高產(chǎn)菌重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法屬于生物化工生產(chǎn)領(lǐng)域。鑒于現(xiàn)有產(chǎn)3-羥基丙酸工程菌產(chǎn)量大都較低，發(fā)現(xiàn)了適用于肺炎克雷伯氏桿菌的高效tac啟動(dòng)子以及能轉(zhuǎn)化3-羥基丙醛為3-羥基丙酸的puuc醛脫氫酶，并以此構(gòu)建重組工程菌。將該酶編碼基因的序列進(jìn)行分析后，對(duì)該基因進(jìn)行了化學(xué)合成。測(cè)序驗(yàn)證后將該啟動(dòng)子和酶在肺炎克雷伯氏桿菌中超表達(dá)，獲得了重組肺炎克雷伯氏桿菌pET(ptac-puuc)，測(cè)定其體內(nèi)及體外對(duì)3-羥基丙醛的催化能力。在體外，該酶對(duì)3-羥基丙醛的酶活達(dá)到26.31U/mg，是原代肺炎克雷伯氏桿菌(3.82U/mg)的6.9倍。在5L發(fā)酵罐中培養(yǎng)改造后的工程菌，經(jīng)培養(yǎng)基成分、IPTG濃度條件優(yōu)化后，其48h后3-羥基丙酸產(chǎn)量高達(dá)73g/L。
【IPC分類】C12N1-21, C12R1-22, C12N15-74, C12P7-42
【公開號(hào)】CN104805112
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510188882
【發(fā)明人】田平芳, 陳柳霓, 李映
【申請(qǐng)人】北京化工大學(xué)
【公開日】2015年7月29日
【申請(qǐng)日】2015年4月20日