利用微生物發(fā)酵甘油生產(chǎn)3-羥基丙酸的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程技術領域，尤其涉及微生物發(fā)酵領域，具體是指一種利用微 生物發(fā)酵甘油生產(chǎn)3-羥基丙酸的方法。
【背景技術】
[0002] 3-羥基丙酸（3-hydroxypropionicacid，簡稱3-HP)是一種重要的平臺化合物， 它可以通過脫水、氧化還原、酯化反應等生成丙烯酸、丙二酸、1，3-丙二醇等多種重要的化 學物質。它也可以作為單體合成環(huán)境友好的高分子材料-聚羥基烷酸。另外，它還可以作 為化工原料用于涂料、粘膠劑、水處理化學品和個人護理用品的生產(chǎn)，2004年美國能源部曾 將其列為最具開發(fā)價值的12種化工產(chǎn)品之一。
[0003] 目前3-羥基丙酸的制備主要為化學法，如丙烯酸水合法，3-羥基丙醛氧化法， 3_羥基丙腈水解法及雷福爾馬斯基（Reformatsky)反應等。但化學法原料多來自石油，且 存在對設備要求高，能耗高，污染大等問題。與之相比，生物法具有操作簡單、條件溫和、綠 色環(huán)保等優(yōu)點，因此倍受關注備受國內外研宄人員的青睞。
[0004] 微生物產(chǎn)3-HP早在上世紀60年代就有報道，但是天然存在的菌株所需底物價格 高且3-HP產(chǎn)率都比較低，因此長期處于實驗室階段。近年來，隨著分子生物學技術的發(fā)展， 大量研宄開始集中于對天然菌株進行途徑改造，利用重組菌以甘油或葡萄糖等廉價碳源為 底物生產(chǎn)3-HP?；蚬こ叹臉嫿ò凑盏孜锏牟煌饕殖善咸烟菫榈孜锖透视偷孜飪?種。葡萄糖為底物的轉化路線以美國嘉吉（Cargill)公司的研宄最為成熟，該公司構建了 多條從葡萄糖到3-HP的路徑，其中最具代表性的過程為：葡萄糖經(jīng)酵解途徑到丙酮酸，丙 酮酸還原生成乳酸，乳酸在丙酰CoA轉移酶的作用下生成乳酰CoA，后者在乳酰CoA脫水酶 作用下生成丙烯酰CoA，進而在3-羥基丙酰脫水酶的作用下，生成3-羥基丙酰CoA，最終生 成3-羥基丙酸。
[0005] 以甘油為底物生成3-HP通常有兩步反應組成：甘油先經(jīng)甘油脫水酶脫水生成 3-羥基丙醛，3-羥基丙醛經(jīng)醛脫氫酶脫氫生成3-HP。與葡萄糖相比，甘油到3-HP生成路徑 短，構建和調控更加簡單有效。而且，近年來生物柴油產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，其生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大 量副產(chǎn)物甘油，如能被合理利用則可以降低生物柴油的生產(chǎn)成本，提高其市場競爭力。因此 以甘油為原料產(chǎn)3-HP契合了生物能源和環(huán)保需求，具有良好的社會效益和經(jīng)濟效益，是當 前生物法產(chǎn)3-HP的研宄熱點。
[0006] 以甘油為底物構建基因工程菌根據(jù)宿主菌不同主要又包括兩大類，一類是在含有 dha操縱子具有甘油脫水酶活性的菌株（如肺炎克雷伯桿菌，Klebsiellapneumoniae)內 引入醛脫氫酶。另一類是在不含甘油脫水酶的菌株（常用的為大腸桿菌，Escherich.coli) 中同時表達甘油脫水酶和醛脫氫酶。如韓國釜山國立大學的Kumar，Ashok等曾分別報道 以K.pneumoniae為出發(fā)菌株，引入醛脫氫酶基因構建3-HP合成途徑。Jung等則在E.coli 中同時表達甘油脫水酶和醛脫氫酶構建了 3-HP的生產(chǎn)途徑，并對宿主進行了多方面改造， 以提高3-HP的產(chǎn)率和轉化率。Rathnasingh等對Raj構建的E.coli進行了進一步改造， 并以半醛脫氫酶KGSADH代替醛脫氫酶ALDH后，以提高重組菌產(chǎn)3-HP濃度。Kim也對Kwak等構建的E.coli工程菌進行了進一步的改造，用更高效的半醛脫氫酶PSALDH代替醛脫氫 酶ALDH，重組菌3-HP濃度達到了 57.3g/L。韓國的Chu從Cupriavidusnecator中篩選到 高活性的脫氫酶GabD4,該酶經(jīng)定向進化后，在E.coli中與甘油脫水酶共表達，最終重組菌 40h產(chǎn)3-羥基丙酸濃度達到了 71. 9g/L。這是目前報道以甘油為底物產(chǎn)3-羥基丙酸的最 高水平。
[0007] 國內華東理工大學、南京工業(yè)大學、江南大學、北京化工大學也有類似的工作報 道，其中北京化工大學田平芳教授研宄團隊運用了全局擾動、反義RNA等多種新型生物學 技術手段對K.pneumoniae進行調控，研宄最為深入，但其3-HP產(chǎn)量目前沒有大的突破。華 東理工大學的黃艷娜等在K.pneumoniae中表達E.coli的醛脫氫酶ALDH，經(jīng)優(yōu)化，微氧條件 下3-HP濃度達到49. 8g/L。這是目前報道重組K.pneumoniae產(chǎn)3-HP的最高水平。
[0008] 迄今為止構建基因工程菌制備3-羥基丙酸的研宄取得了一定的進展，但是還存 在諸多的問題：1)途徑改造本身需要繁瑣的分子生物學操作，后期培養(yǎng)往往還需要額外加 入抗生素和誘導劑等，增加操作難度加大生產(chǎn)成本。2)構建工程菌時宿主菌的選擇問題。以 K.pneumoniae為宿主，3-HP產(chǎn)生過程中產(chǎn)生大量1，3-丙二醇，后者是K.pneumoniae天然 的終端產(chǎn)物，生成途徑很難完全切斷，這就使得3-HP濃度和轉化率都難以提高。以E.coli 為宿主，3-HP產(chǎn)量相對較高，但由于其自身不具有甘油脫水酶酶活，構建過程更加復雜。而 且E.coli自身不能生成甘油脫水酶的輔酶VB12，需要在發(fā)酵體系中額外加入，因其價格昂 貴，從而使得發(fā)酵成本大增。3)重組菌中甘油脫水酶和醛脫氫酶的平衡問題也制約了 3-HP 產(chǎn)量的提高。目前發(fā)現(xiàn)的甘油脫水酶只在厭氧和微好氧條件下才具活性，而在此條件下 NAD(P)H不能及時的生成醛脫氫酶的輔因子NAD(P) +，這不僅使得3-HP產(chǎn)生速率降低，還會 導致強細胞毒性的3-羥基丙醛積累，從而致使細胞死亡發(fā)酵中止。
[0009] 綜上所述，目前本領域需要一種簡單有效的工藝能將相對低廉的碳水化合物轉化 為3-羥基丙酸，并能獲得較高產(chǎn)物濃度和產(chǎn)率，以適應工業(yè)化生產(chǎn)的需求。

【發(fā)明內容】

[0010] 本發(fā)明的目的是克服了上述現(xiàn)有技術的缺點，提供了一種能夠實現(xiàn)的將相對低 廉的甘油利用兩種微生物分段、混菌發(fā)酵轉化為3-羥基丙酸的利用微生物發(fā)酵甘油生產(chǎn) 3-羥基丙酸的方法，所述的方法為利用兩種微生物進行分段、混菌發(fā)酵；
[0011] 上述兩種微生物包括：
[0012] 具有甘油脫水活性，轉化甘油生成3-羥基丙醛或1，3-丙二醇的微生物一；
[0013] 轉化3-羥基丙醛或1，3-丙二醇生成3-羥基丙酸的微生物二；
[0014] 前段發(fā)酵過程條件為含甘油20~120g/L的培養(yǎng)基，接入微生物一的種子培養(yǎng)液， 接種量3~10%，通入空氣或氮氣，30~42°C，發(fā)酵10~45小時，pH為6. 0~8. 0 ;
[0015] 后段發(fā)酵過程條件為在前段培養(yǎng)液中微生物二的種子液或微生物細胞，種子液接 種量為10~20 %，細胞接種量為3~20g/L，通入空氣或氧氣，20~37°C，培養(yǎng)10~40小 時，pH為 5. 0 ~7. 0 ;
[0016] 所述的微生物二將1，3-丙二醇或3-羥基丙醛轉化生成3-羥基丙酸的相關酶為 膜結合蛋白。
[0017]優(yōu)選的，所述的微生物一選自：克雷伯氏肺炎桿菌（Klebsiellapneumoniae)，弗 氏朽1 檬酸桿菌（Citrobacterfreundii), 丁酸梭狀芽抱桿菌（Clostridiabutyricum)，巴 氏固氮梭狀芽孢桿菌（Clostridiapastruianu)，以及它們的基因工程菌。
[0018]優(yōu)選的，所述的微生物二為氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacteroxydans)，以及其 基因工程菌。
[0019] 優(yōu)選的，所述的膜結合蛋白以P比略喹啉醌（PyrroloquinolinequinonePQQ)為輔 因子。
[0020] 優(yōu)選的，所述的微生物一的種子液通過以下方法獲得：
[0021] 將菌種接種于種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度28~37°C，通入空氣或氮氣進行有氧或厭氧 培養(yǎng)10~15小時，即得到微生物一的種子液。
[0022] 優(yōu)選的，所述的微生物二的種子液通過以下方法獲得：
[0023] 將氧化葡萄糖酸菌種接種于種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度25~32°C，培養(yǎng)20~30小時， 即得到微生物二的種子液。
[0024] 優(yōu)選的，所述的微生物二的微生物細胞通過以下方法制備：
[0025]將氧化葡萄糖酸菌種接種于種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度25~32°C，培養(yǎng)20~30小時， 低溫離心，收集菌體沉淀，用磷酸緩沖液洗滌，棄去上清，即得到微生物細胞。
[0026] 本發(fā)明利用兩種微生物分段、混菌發(fā)酵甘油產(chǎn)3-HP，與目前常用基因工程菌轉化 甘油相比具有如下優(yōu)點：
[0027] 1)本發(fā)明所用兩種微生物可以是自然界存在的天然微生物，省卻了繁瑣的基因操 作步驟。
[0028] 2)本發(fā)明利用兩種微生物，分段、混合發(fā)酵，發(fā)酵體系中接入微生物二氧化葡萄糖 酸桿菌，可將體系中3-羥基丙醛和1，3-丙二醇均轉化為3-羥基丙酸，從而提高產(chǎn)物濃度 和甘油到3-HP的轉化率。
[0029] 3)本發(fā)明中氧化1，3-丙二醇及3-羥基丙醛及的脫氫酶為微生物二的細胞膜結 合蛋白，所產(chǎn)生3-HP直接分泌在細胞外，從而避免了物質進出細胞的能耗和速率限制，具 有更高的生產(chǎn)強度；另外也使得細胞對3-HP的耐受性更高，因而可以具有更高的終產(chǎn)物濃 度，本發(fā)明3-HP濃度可達75gI71以上，具有良好的工業(yè)應用前景。
[0030] 4)通常用大腸桿菌或克雷伯桿菌等微生物生產(chǎn)3-羥基丙酸時，微生物利用甘油 產(chǎn)3-HP同時會產(chǎn)生大量乳酸，乳酸是3-羥基丙酸的同分異構體且物化性質與3-羥基丙酸 極為接近從而導致分離純化困難，本發(fā)明接入微生物二氧化葡萄糖