一種水稻的育種方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于水稻育種技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種水稻的育種方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)代水稻育種研宄從理論和技術(shù)上已達(dá)到了很高的水平，但仍不能滿足水稻生產(chǎn) 發(fā)展的需求，尤其在抗病性、抗逆性、高光效、品質(zhì)及產(chǎn)量等重要農(nóng)藝性狀的改良上成效不 令人十分滿意。這是因為水稻基因組本身有用的基因資源已利用殆盡。由于農(nóng)作物育種目 標(biāo)的迫切性和現(xiàn)有育種手段和材料的局限性，迫使水稻育種專家去尋找更有效的育種新材 料和新途徑。
[0003] 通過遠(yuǎn)緣雜交方法將外源基因轉(zhuǎn)移到水稻，由于種間雜交的不親和性，雜交后代 瘋狂分離，很難得到穩(wěn)定的后代。
[0004] 花粉管通道法由我國周光宇先生70年代提出，在水稻、棉花、玉米、大豆、瓜類等 大多農(nóng)作物上得到廣泛應(yīng)用。但主要采用整體DNA導(dǎo)入。
[0005] 野生菰是水稻的近緣屬植物。菰中蘊含豐富的有利基因，具有明顯的比較優(yōu)勢：① 株型良好，光合效率較理想；分蘗能力很強(qiáng)，生長速度快，生物產(chǎn)量高。②抗逆性強(qiáng)，野生菰 的耐冷性強(qiáng)，耐旱耐澇，抗病性強(qiáng).③灌漿成熟極快，授粉后15天左右灌漿成熟完畢，隨即 進(jìn)入后熟。④營養(yǎng)價值高。將野生菰的基因?qū)胨局?，選擇具有水稻和菰優(yōu)良性狀和保 健作用的新品種。開展高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗性強(qiáng)的巨穗型水稻新品種的產(chǎn)業(yè)化示范推廣，將有助 于提高水稻單產(chǎn)，提高水稻的營養(yǎng)價值，增加水稻抗性，對于我國水稻綠色產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和 保障國家糧食安全具有重要的戰(zhàn)略意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種水稻的育種方法，本發(fā)明通過限制性內(nèi)切酶酶切野生 菰DNA導(dǎo)入水稻后，后代的變異率比完整DNA導(dǎo)入明顯提高，穩(wěn)定速度快，獲得了優(yōu)良的水 稻新株系和新品種。
[0007] 本發(fā)明提供了一種水稻的育種方法，包括以下步驟：
[0008] a)采用CTAB法提取野生菰DNA;
[0009] b)用限制性內(nèi)切酶酶切步驟a)獲得的野生菰DNA，獲得酶切野生菰DNA;
[0010] c)采用花粉管通道法將步驟b)獲得的酶切野生菰DNA導(dǎo)入水稻，選擇變異材料進(jìn) 行育種。
[0011] 優(yōu)選的，所述限制性內(nèi)切酶為HindIII.和EcoRI。
[0012] 優(yōu)選的，所述步驟a)具體為：
[0013] al)取野生菰幼葉，用液氮研磨，加入2倍CTAB提取緩沖液混勻后，加入1倍CTAB 緩沖液，55-65°C恒浴30min;
[0014] a2)向步驟al)獲得的溶液中加入體積比為24:1的氯仿和異戊醇，混合后離心；
[0015] a3)向步驟a2)獲得的上清液中加入CTAB緩沖液、體積比為24:1的氯仿和異戊 醇，混合后離心；
[0016]a4)向步驟a3)獲得的上清液中加入異丙醇，離心，得到的沉淀用高鹽緩沖液溶解 后離心；
[0017] a5)向步驟a4)獲得的上清液中加入異丙醇，離心，得到的沉淀用雙蒸水溶解，加 入2. 5倍體積95%冷乙醇-40°C冰箱中沉淀2h后離心；
[0018]a6)將步驟a5)獲得的沉淀用冷乙醇洗一次，自然干燥后，用TE緩沖液溶解，加入 RNA酶貯存緩沖液處理后，獲得野生菰DNA。
[0019] 具體而言，所述步驟a)包括以下步驟：
[0020] al)取50克野生菰幼葉，用液氮研磨，加入50ml2倍CTAB提取緩沖液的500ml離 心管中充分混勻后，再加入50ml1倍CTAB緩沖液，在55-65°C恒浴30min
[0021] a2)向步驟al)獲得的溶液中加入150ml氯仿：異戊醇（24:1)，充分搖動5min， 8000r/min，室溫下離心5min。
[0022] a3)向步驟a2)獲得的上清液中加入1/10體積的10%的CTAB緩沖液，加入200ml 氯仿：異戊醇（24:1)，充分搖動5min，4000r/min，室溫下5min離心。
[0023]a4)向步驟a3)獲得的上清液中加入0. 6倍體積的異丙醇，室溫下30min，5000轉(zhuǎn)， 4°C離心5min。得到沉淀用0. 8ml高鹽緩沖液充分溶解，15000r/min離心2min。
[0024]a5)向步驟a4)獲得的上清液中加入0.6倍體積的異丙醇，室溫下30min，5000轉(zhuǎn)， 4°C離心5min。得到的沉淀用4ml雙蒸水溶解，加入2. 5倍體積95%的冷乙醇，-20°C冰箱 中2h以上，15000轉(zhuǎn)離心20min。
[0025]a6)步驟a5)獲得的沉淀用70%的冷乙醇洗一次，自然干燥后，用2000y1 0. 1倍 TE緩沖液溶解，加入200y1RNA酶貯存緩沖液（lmg/ml)，37°C，一小時降解RNA，獲得野生 DNA。
[0026]a7)紫外吸收光譜法檢測DNA的濃度和純度：
[0027]DNA濃度的檢測采用紫外吸收光譜法。DNA溶液260的OD值為1，相當(dāng)于約50yg/ ml雙鏈DNA，40yg/ml單鏈DNA，DNA濃度（yg/y1) = 0D260X核酸稀釋倍數(shù)X50。（A 260/A280彡1. 8,A260/A230彡2. 0表明DNA純度符合質(zhì)量要求。
[0028] 優(yōu)選的，所述2倍CTAB提取緩沖液包括：2 %CTAB、lOOmMpH值為8. 0的Tris、 20mMpH值為8. 0的EDTA、1. 4MNaCl和1%重均分子量為40000的PVP。
[0029] 優(yōu)選的，所述高鹽緩沖液包括：10mMpH值為8. 0的Tris、ImMpH值為8. 0的EDTA 和 1MNaCl。
[0030] 優(yōu)選的，1倍TE緩沖液包括：10mMpH值為8. 0的Tris、ImMpH值為8. 0的EDTA; RNA酶貯存緩沖液包括：lmg/mlRNaseA和 100U/mlRNaseTl。
[0031] 優(yōu)選的，步驟b)包括：
[0032] 用限制性內(nèi)切酶酶切步驟a)獲得的野生菰DNA，酶切后的DNA用冷乙醇_40°C下 過夜，離心，得到的沉淀干燥后用1倍SS緩沖液溶解，獲得酶切野生菰DNA。
[0033] 具體而言，步驟b)包括：
[0034] 用限制性內(nèi)切酶HindIII.+EcoRI酶切DNA，電泳檢測。用瓊脂糖凝膠電泳檢測 其分子量的分布范圍，酶切完整的DNA呈彌散狀。酶切后的DNA用2. 5倍體積95%的冷乙 醇，-40°C冰箱中過夜，15000轉(zhuǎn)離心20min。沉淀干燥后用1SSC溶解，獲得酶切野生菰DNA。 其中，所述酶切野生菰DNA溶液的濃度為100-200yg/ml。
[0035] 優(yōu)選的，所述1倍SSC緩沖液包括：150mMNaCl，15mMC6H9Na309 (檸檬酸三鈉 pH8. 0) 〇
[0036] 優(yōu)選的，所述步驟c)為：
[0037] 在水稻開花1~3h，切柱頭1/3~2/3,然后在切口處滴入步驟b)獲得的酶切野 生菰DNA溶液，浸泡去掉柱頭的子房，將步驟b)獲得的酶切野生菰DNA導(dǎo)入水稻，選擇變異 材料進(jìn)行育種。
[0038] 優(yōu)選的，所述酶切野生菰DNA溶液的濃度為100-200yg/ml。
[0039] 在本發(fā)明中，導(dǎo)入受體，即水稻應(yīng)選擇綜合性狀好，只有少數(shù)或個別性狀需要改良 的品種或品系，例如湘晚秈12號和湘早秈45號等。
[0040] 按照上述方法將酶切野生菰DNA導(dǎo)入水稻后收獲％代種子，其后代變異率較高。
[0041] 將％代種子種植后，按照常規(guī)方法進(jìn)行選育，從而獲得優(yōu)良的水稻新株系和新品 種。本發(fā)明對所述選育方法沒有特殊限制，包括但不限于選擇優(yōu)良單株進(jìn)行系統(tǒng)選育等方 法。實驗結(jié)果表明，本發(fā)明提供的方法可選育出優(yōu)良的品系，表現(xiàn)出莖桿粗壯，穗大粒多 (500-600粒/穗），抗病性強(qiáng)等優(yōu)點，理論產(chǎn)量近1噸。
[0042] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明首先采用CTAB法提取野生菰DNA，然后用限制性內(nèi)切酶 酶切所述野生菰DNA，獲得酶切野生菰DNA;再采用花粉管通道法將所述酶切野生菰DNA導(dǎo) 入水稻，選擇變異材料進(jìn)行育種。本發(fā)明通過限制性內(nèi)切酶酶切野生菰DNA導(dǎo)入水稻后，后 代的變異率比完整DNA導(dǎo)入明顯提高，穩(wěn)定速度快，獲得了優(yōu)良的水稻新株系和新品種。實 驗結(jié)果表明，酶切野生菰DNA導(dǎo)入水稻創(chuàng)新的水稻新品種莖桿粗大，穗大粒多，后期灌漿速 度快，克服了大穗而分蘗力弱、包頸、結(jié)實率低的缺陷；田間觀察未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重病蟲害危害，是 一批極具增產(chǎn)潛力的資源材料。
【具體實施方式】
[0043] 下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附表，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；?本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他 實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0044] 實施例1野生菰DNA提取
[0045] 1.取50克野生菰幼葉，用液氮研磨，加入50ml2倍CTAB提取緩沖液，在500ml離