分子標(biāo)記法檢測水稻溫敏雄性不育tms9-1基因的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及水稻品種資源特性的檢測技術(shù)，尤其涉及一種分子標(biāo)記法檢測水稻溫敏雄性不育基因的方法及其分子標(biāo)記。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻溫敏雄性不育系為利用兩系法實(shí)現(xiàn)水稻雜種優(yōu)勢利用的重要種質(zhì)資源，其在高溫長日照條件下表現(xiàn)為雄性不育，可用于生產(chǎn)雜交種子；而在低溫短日照條件下又表現(xiàn)為雄性可育，可用于自交繁殖。相對于三系雜交稻而言，兩系雜交水稻以生產(chǎn)程序簡化、雜交配組自由、能夠克服三系不育細(xì)胞質(zhì)負(fù)效應(yīng)和容易實(shí)現(xiàn)秈粳亞種間雜種優(yōu)勢利用等特點(diǎn)而得到廣泛利用。水稻基因調(diào)控溫敏雄性不育系衡農(nóng)S-1的溫敏雄性不育性狀，
基因被鑒定為其候選基因。在衡農(nóng)S-1溫敏雄性不育系中基因內(nèi)部發(fā)生一個從T到C的單堿基突變，利用該堿基突變結(jié)合PCR和限制性內(nèi)切酶的酶切技術(shù)可以發(fā)展出一種新的dCAPS分子標(biāo)記，該標(biāo)記與溫敏雄性不育基因完全連鎖，可用于tms9-藤因的檢測、基因的分子標(biāo)記輔助選擇和轉(zhuǎn)育等用途。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明的第一個目的是提供一種分子標(biāo)記法檢測水稻溫敏雄性不育基因的方法，本發(fā)明的第二個目的是提供上述的方法采用的分子標(biāo)記。本發(fā)明的檢測方法準(zhǔn)確性好、操作簡單、成本低廉、實(shí)用性強(qiáng)。
[0004]為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
分子標(biāo)記法檢測水稻溫敏雄性不育基因的方法，該方法包括以下的步驟:
1)提取待測樣品的DNA，采用分子標(biāo)記QY-1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分子標(biāo)記QY-1的引物對為:QY-1Fdr -GTGGACACGGCGAGGAAGGGCCAC-3' ;QY_1R:5' -CGAGCATGAAGCGGAGGAGGTCCCCG-3' ;PCR擴(kuò)增條件為 95°C預(yù)變性 3min、95°C變性 30 sec、55°C退火 30 sec、72°C延伸 30sec，共35個循環(huán)，最后72°C延伸5 min ；
2)PCR反應(yīng)產(chǎn)物用于Smal酶切反應(yīng)，酶切方法為:PCR反應(yīng)產(chǎn)物10μ 1、Smal限制性內(nèi)切酶 0.5 μ 1，濃度為 I U/μ l、10XFastDigest buffer 2 μ 1，去離子水 7.5 μ 1，酶切反應(yīng)在30°C水浴鍋中溫浴20 min，加入4μ1 6 X loading buffer后于3%瓊脂糖凝膠120U電壓電泳30 min，在Tanon2500凝膠成像儀進(jìn)行拍照；
3)待測DNA樣品經(jīng)過PCR擴(kuò)增和Smal酶切后，電泳方式能檢測出259bp片段的含基因的水稻材料，而片段大小為286bp的則是無基因的水稻材料。
[0005]作為優(yōu)選，所述的待測樣品的DNA的提取方法如下:
1)取2cm長的水稻葉片放入2 ml離心管中，加入液氮后將水稻葉片磨碎，再加入500μ I 2%的CTAB提取液，CTAB: 2 g，放于75°C水浴30 min ；100 ml CTAB提取液包括以下的組分:1 mol/L Tris-Hcl ρΗ8.0 10 ml; 0.5 mol/L EDTA pH8.0 4 ml; Nacl: 8.12 g ；
2)加入等體積氯仿/異戊醇充分振蕩后，氯仿/異戊醇的體積比為24:1，放入離心機(jī)中12，OOO rpm離心10 min，靜止5 min后吸取500 μ I上清液于1.5 ml離心管；
3)加入等體積預(yù)冷的異丙醇后上下混勻，放入離心機(jī)中12,000rpm離心10 min ；
4)棄上清液并加入500μ I 70%的乙醇進(jìn)行洗滌；12，000 rpm離心5min棄上清液后可見DNA的白色沉淀；
5)室溫干燥10-20min后，加入500 μ I去離子水溶解。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述的第二個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
一種與水稻溫敏雄性不育基因完全連鎖的dCAPS分子標(biāo)記QY-1，該分子標(biāo)記的引物對為:QY-1F:5' -GTGGACACGGCGAGGAAGGGCCAC-3' ;QY_1R:5' -CGAGCATGAAGCGGAGGAGGTCCCCG-3r 。
[0007]本發(fā)明由于采用了上述的技術(shù)方案，特異性分子標(biāo)記QY-1是以溫敏雄性不育tms9~m因的候選基因《5#分的單堿基突變?yōu)榛A(chǔ)，經(jīng)過PCR擴(kuò)增并結(jié)合Smal酶切特點(diǎn)的dCAPS分子標(biāo)記，其與基因完全連鎖，特異性高，可用于基因的檢測，tms9-l基因的分子標(biāo)記輔助選擇和轉(zhuǎn)育等，該檢測方法準(zhǔn)確性好、操作簡單、成本低廉、實(shí)用性強(qiáng)。
【附圖說明】
[0008]圖1為QY-1標(biāo)記在？2群體中的雄性不育單株、衡農(nóng)S-1和明恢63中的檢測結(jié)果；圖1中M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，匕為F 2群體中雄性不育單株樣品，P工為衡農(nóng)S-1, P 2為明恢63。
【具體實(shí)施方式】
[0009]種植上述衡農(nóng)S-1與明恢63雜交后的F2群體，在杭州正季于水稻抽穗期選取雄性不育單株的葉片，采用特異性dCAPS分子標(biāo)記QY-1對細(xì)59-2基因進(jìn)行檢測。特異性分子標(biāo)記QY-1F的核苷酸序列為5丨-GTGGACACGGCGAGGAAGGGCCAC-3丨，QY-1R的核苷酸序列為5' -CGAGCATGAAGCGGAGGAGGTCCCCG-3'，PCR 產(chǎn)物大小 286bp，PCR 擴(kuò)增后每個樣品吸取 10μ I的DNA用于Smal酶切反應(yīng)，酶切后經(jīng)3%瓊脂糖凝膠120 U電壓電泳檢測，含有tms9_l基因的DNA片段大小為259bp，而不含基因的DNA片段大小為286bp。
[0010]一、DNA 提取
1.取2 cm長的水稻葉片放入2 ml離心管中，加入液氮后將水稻葉片磨碎，再加入500μ I 2% 的 CTAB 提取液(100 ml CTAB 提取液:1 mol/L Tris-Hcl ρΗ8.0 10 ml; 0.5 mol/L EDTA pH8.0 4 ml; Nacl: 8.12 g; CTAB: 2 g)放于 75°C 水浴 30 min。
[0011]2.加入等體積氯仿/異戊醇(24:1)充分振蕩后，放入離心機(jī)中12,000 rpm離心10 min，靜止5 min后吸取500 μ I上清液于1.5 ml離心管。
[0012]3.加入等體積預(yù)冷的異丙醇后上下混勻，放入離心機(jī)中12，000 rpm離心10 min。
[0013]4.棄上清液并加入500 μ I 70 %的乙醇進(jìn)行洗滌；12，000 rpm離心5min棄上清液后可見DNA的白色沉淀。
[0014]5.室溫干燥10-20 min后，加入500 μ I去離子水溶解。
[0015]6.DNA溶液保存在-20°C冰箱中，每個樣品取2 μ I用于PCR反應(yīng)。
[0016]二、PCR 擴(kuò)增
PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。
[0017]1.PCR反應(yīng)體系 20 μ I反應(yīng)體系(20 μ I):
去離子水(ddH20)12.7 μ I
10XPCR buffer2 μ I
dNTP 混合物(2mM)2 μ I
Primer-F (10 μ Μ)0.5 μ I
Primer-R (10 μ Μ)0.5 μ I
Taq enzyme (2 U/μ I)0.3 μ I
模板 DNA (20 ng)2 μ?
2.PCR反應(yīng)條件:
標(biāo)記QY-1的PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性3 min，95°C變性30 sec，55°C退火30 sec，72°C延伸30 sec，共35個循環(huán)；最后72°C延伸5 min。
[0018]3.酶切反應(yīng)體系(20 μ I):
20 μ I反應(yīng)體系:
PCR反應(yīng)產(chǎn)物10 μ I
Restrict1n enzyme (I U/μ I) 0.5 μ I1XFastDigest buffer2 μ I
去尚子水(ddH20)7.5 μ I
4.酶切反應(yīng)條件:
酶切反應(yīng)在恒溫水浴鍋內(nèi)進(jìn)行，根據(jù)Smal限制性內(nèi)切酶的活性溫度(30°C)，將反應(yīng)體系混合物置于水浴鍋中30°C溫浴20 min，加入4 μ I 6X loading buffer后進(jìn)行電泳檢測，Smal限制性內(nèi)切酶及反應(yīng)緩沖液購自MBI Fermentas公司。
[0019]三、PCR反應(yīng)產(chǎn)物檢測
將酶切產(chǎn)物在加入EB (溴化乙錠)的3%瓊脂糖凝膠上電泳，120 U電壓電泳30 min,在Tanon 2500凝膠成像儀進(jìn)行拍照并保存。
[0020]水稻溫敏雄性不育基因在衡農(nóng)S-1溫敏雄性不育系中其候選基因OsMSl發(fā)生一個從C到T的單堿基突變，而在明恢63等常規(guī)品種中flsU/基因的DNA序列正常，并未發(fā)生相應(yīng)的突變。因此，利用這個單堿基突變設(shè)計(jì)特異的引物，對其突變位點(diǎn)和相鄰的DNA區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由于衡農(nóng)S-1中flsU/基因發(fā)生了一個單堿基突變，因此，用特異引物擴(kuò)增的PCR片段可被Smal酶切，而明恢63等常規(guī)水稻品種中未發(fā)生相應(yīng)的堿基突變，因此，其PCR擴(kuò)增片段不能被Smal酶切，而F2群體中的雄性不育單株含有純合的tms9-.因，其擴(kuò)增片段也能被Smal酶切，條帶大小與衡農(nóng)S-1相同。如圖1所示，在F2群體中，雄性不育單株的條帶與衡農(nóng)S-1的條帶完全一致，大小為259bp ;而明恢63由于基因未發(fā)生單堿基突變，PCR產(chǎn)物不能被Smal酶切，因此，其電泳條帶為286bp。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.分子標(biāo)記法檢測水稻溫敏雄性不育基因的方法，其特征在于該方法包括以下的步驟: 1)提取待測樣品的DNA，采用分子標(biāo)記QY-1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分子標(biāo)記QY-1的引物對為:QY-1Fdr -GTGGACACGGCGAGGAAGGGCCAC-3' ;QY_1R:5' -CGAGCATGAAGCGGAGGAGGTCCCCG-3' ;PCR擴(kuò)增條件為 95°C預(yù)變性 3min、95°C變性 30 sec、60°C退火 30 sec、72°C延伸 30sec，共35個循環(huán)，最后72°C延伸5 min ； 2)PCR反應(yīng)產(chǎn)物用于Smal酶切反應(yīng)，酶切方法為:PCR反應(yīng)產(chǎn)物10μ 1、Smal限制性內(nèi)切酶 0.5 μ 1，濃度為 I U/μ l、10XFastDigest buffer 2 μ 1，去離子水 7.5 μ 1，酶切反應(yīng)在30°C水浴鍋中溫浴20 min，加入4μ1 6 X loading buffer后于3%瓊脂糖凝膠120U電壓電泳30 min，在Tanon2500凝膠成像儀進(jìn)行拍照； 3)待測DNA樣品經(jīng)過PCR擴(kuò)增和Smal酶切后，電泳方式能檢測出259bp片段的含 基因的水稻材料，而片段大小為286bp的則是無基因的水稻材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記法檢測水稻溫敏雄性不育tms9-l基因的方法，其特征在于待測樣品的DNA的提取方法如下: 1)取2cm長的水稻葉片放入2 ml離心管中，加入液氮后將水稻葉片磨碎，再加入500μ I 2%的CTAB提取液，CTAB: 2 g，放于75°C水浴30 min ；100 ml CTAB提取液包括以下的組分:1 mol/L Tris-Hcl ρΗ8.0 10 ml; 0.5 mol/L EDTA pH8.0 4 ml; Nacl: 8.12 g ； 2)加入等體積氯仿/異戊醇充分振蕩后，氯仿/異戊醇的體積比為24:1，放入離心機(jī)中12，000 rpm離心10 min，靜止5 min后吸取500 μ I上清液于1.5 ml離心管； 3)加入等體積預(yù)冷的異丙醇后上下混勻，放入離心機(jī)中12,000rpm離心10 min ； 4)棄上清液并加入500μ I 70%的乙醇進(jìn)行洗滌；12，000 rpm離心5min棄上清液后可見DNA的白色沉淀； 5)室溫干燥10-20min后，加入500 μ I去離子水溶解。
3.一種與水稻溫敏雄性不育基因完全連鎖的dCAPS分子標(biāo)記QY-1，其特征在于，該分子標(biāo)記的引物對為:QY-1F:5' -GTGGACACGGCGAGGAAGGGCCAC-3' ;QY_1R:5' -CGAGCATGAAGCGGAGGAGGTCCCCG-3'。
【專利摘要】本發(fā)明涉及水稻品種資源特性的檢測技術(shù)，尤其涉及一種分子標(biāo)記法檢測水稻溫敏雄性不育tms9-1基因的方法及其分子標(biāo)記。該方法包括：特異性dCAPS分子標(biāo)記QY-1，其上游引物QY-1F的核苷酸序列為5′-GTGGACACGGCGAGGAAGGGCCAC-3′，下游引物QY-1R的核苷酸序列為5′-CGAGCATGAAGCGGAGGAGGTCCCCG-3′；PCR后產(chǎn)物進(jìn)一步內(nèi)切酶Sma1酶切，經(jīng)3%瓊脂糖凝膠120 U電壓電泳30min后僅檢測到大片段，待測DNA樣品經(jīng)過PCR擴(kuò)增和Sma1酶切后，電泳方式能檢測出259bp片段的含tms9-1基因的水稻材料，而片段大小為286bp的則是無tms9-1基因的水稻材料。該方法檢測特異性好、準(zhǔn)確性高、操作簡便、成本低廉、實(shí)用性強(qiáng)。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104818332
【申請?zhí)枴緾N201510227349
【發(fā)明人】祁永斌, 金慶生, 劉慶龍
【申請人】浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【公開日】2015年8月5日
【申請日】2015年5月6日