水稻小分子RNA osa-miR530在降低水稻株高方面的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及小分子RNA(microRNA)osa-miR530 在降低水稻株高方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是世界上主要糧食作物之一，水稻產(chǎn)量由多個性狀決定，株高是水稻品 種最重要的農(nóng)藝性狀之一，中國水稻單產(chǎn)在經(jīng)歷矮化育種和雜交稻育種兩次飛躍后， 單產(chǎn)一直停滯不前。為了打破這一局面，以理想株型為模式的超級稻育種提供了重要 途徑，其主要策略就是理想株型和雜種優(yōu)勢相結(jié)合（Chenetal.，ActaAgronomica Sinica，2001，27:665-673)。由此可見，株型改良是水稻育種的一條主線，而株高是株型改 良的關(guān)鍵性狀。水稻株高相關(guān)基因的發(fā)掘利用和遺傳機理研究一直是水稻育種家和分子生 物學(xué)家研究的熱點之一。
[0003] 植物激素在水稻株高發(fā)育中具有重要調(diào)控作用，迄今為止，大多數(shù)已克隆株高 基因與赤霉素（Gibberellin，GA)、油菜素內(nèi)酯（Brassinosteriod，BR)和獨腳金內(nèi)酯 (strigolactone,SL)等激素的代謝或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。此外，其他開花相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、細胞壁 形成基因也會影響植物的株高。
[0004] 擬南芥GAs生物合成途徑上的相關(guān)基因缺失突變均能夠?qū)е轮仓瓿霈F(xiàn)嚴重矮 化或者半矮化表型（Sakamotoetal·，PlantPhysiol, 2004, 134:1642-1653)。在水 稻中發(fā)現(xiàn)的3個GA缺陷型半矮化突變體d35、sdl和dl8分別是由0sK02、0sGA20ox2 和 0sGA3ox2 位點變異引起的（Itohetal.，PlantCell，2002，14:57-70;Sasaki etal. ,Nature, 2002, 416:701-702；Itohetal.,PlantMolBiol,2004,533-547)〇 水稻GA去活性酶EUI的過量表達轉(zhuǎn)基因水稻株高顯著降低（Zhuetal.，Plant Cell, 2006, 18:442-456)，eui是一個水稻高桿突變體（Zhuetal·，Plant Cell, 2006, 18:442-456)。對水稻0sGA2ox6被增強表達后表現(xiàn)顯性矮桿，內(nèi)源活性GA顯 著降低（Huangetal.，JGenetGenomic, 2010,37:23-36)。此外，水稻中發(fā)現(xiàn)的最早 的赤霉素不敏感突變體dl，其植株顯著矮化，對外源施加的GA不敏感（Ueguchi-Tanaka etal.，Nature，2005, 437:693-698)。研究表明油菜素內(nèi)酯也是決定株高的重要 激素。BR缺陷型突變體brdl、d2和dll均表現(xiàn)出矮化表型（Hongetal.，Plant J, 2002, 32:495-508；Hongetal. ,PlantCell, 2003, 15:2900-2910；Tanabeetal.,Plant Cell, 2005, 17:776-790)。水稻DLT基因是水BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)負調(diào)控因子GSK2激酶的直接下 游靶標，dlt突變體表現(xiàn)為矮化少分蘗。此外，獨角金內(nèi)酯和生長素也參與調(diào)解水稻株高和 分蘗。如獨角金內(nèi)酯信號途徑相關(guān)的多蘗矮桿突變體dlO、htdl/sd-t、htd2/d88/dl4、d27 等（張云輝等，中國農(nóng)學(xué)通報，2014, 30:1-7)。生長素響應(yīng)因子OsIAAl過表達轉(zhuǎn)基因植株 表現(xiàn)株高矮化、株型松散等特點（Songetal·，PlantMolBiol, 2009, 70:297-309)〇
[0005] 除了植物激素途徑，一些調(diào)節(jié)水稻株高的基因也已被報道。GHD7基因是一個能同 時控制水稻穗粒數(shù)、株高和抽穗期3個性狀的主效QTL。野生型GHD7等位基因可使抽穗期 大大延遲，株高和每穗粒數(shù)顯著增加（Xueetal·，NatGenet, 2008, 40:761-767)。DTH8和GHD8,能夠同時調(diào)控水稻花期、株高和產(chǎn)量這3種農(nóng)藝性狀。DTH8基因自然突變會導(dǎo)致光 周期敏感性減弱和株高降低（Weietal·，PlantPhysiol, 2010, 153:1747-1758;Yanet al.，MolPlant, 2011，4:319-330)，氨基酸序列分析結(jié)果表明，GHD8與DTH8是同一個基因。 BUI1基因編碼一個植物特異的ClassIIformin蛋白，調(diào)控細胞微絲骨架的裝配和動態(tài)變 化。BUI1的缺失突變使水稻的節(jié)間發(fā)育異常，表現(xiàn)為最上節(jié)間嚴重縮短，呈彎曲生長（Yang etal.，PlantCell, 2011，23:661-680)。
[0006]MicroRNA是一類長度約22個核苷酸的內(nèi)源單鏈RNA，是植物生長發(fā)育過程中的關(guān) 鍵調(diào)節(jié)因子。研究表明，microRNA與植物的生長發(fā)育有著密切的關(guān)系，植物體內(nèi)microRNA 及其靶基因表達的改變可以影響多種遺傳性狀。因此，對水稻microRNA的功能研究能為 水稻農(nóng)藝性狀改良提供新的理論依據(jù)和研究方法。本發(fā)明從水稻日本晴中分離克隆到 一個小分子RNAosa_miR530，Liu等已經(jīng)在水稻中預(yù)測了該microRNA的序列（LiuBet al.，2005,PlantPhysiol, 139:296-305)，但目前還沒有任何相關(guān)功能研究的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明從水稻日本晴中分離克隆到microRNA osa-miR530,該microRNA在水稻 中過量表達后，轉(zhuǎn)基因陽性植株的株高明顯低于非轉(zhuǎn)基因植株。因此，在水稻中過量表達 osa-miR530對于降低株高，提高耐倒伏能力具有重要意義，這為水稻高產(chǎn)分子設(shè)計育種提 供新的資源和研究方法。
[0008] 本發(fā)明申請人以水稻的一個microRNAosa-miR530為研究對象，通過過量表達 小分子RNAosa-miR530,使正常的水稻植株變矮。osa-miR530的成熟序列是20個堿基 (5'-TGCATTTGCACCTGCACCTA-3'；SEQIDN0:1)。本發(fā)明通過PCR方法，擴增出水稻品種 日本晴microRNAosa-miR530的前體序列（SEQIDN0:2)，包含157個堿基，正向連接在植 物表達載體pCAMBIA1390-ubi上，得到植物表達載體pCAMBIA1390-ubi-0sa-miR530 ;再進 行遺傳轉(zhuǎn)化至水稻中，提高〇sa-miR530的表達，得到osa-miR530表達增強的轉(zhuǎn)基因水稻植 株。在轉(zhuǎn)基因的T3代植株中發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)生長階段及成熟期陽性轉(zhuǎn)基因水稻植株的株高明顯 低于非轉(zhuǎn)基因植株：在營養(yǎng)生長階段，轉(zhuǎn)基因水稻的株高約為非轉(zhuǎn)基因水稻的78-83% ;在 成熟期，轉(zhuǎn)基因水稻的株高約為非轉(zhuǎn)基因水稻的80 %。
[0009] 本發(fā)明用于構(gòu)建過量表達osa-miR530的前體植物表達載體、增強osa-miR530表 達的DNA序列如SEQID N0 :2所示。
[0010] 本發(fā)明利用水稻品種日本晴的osa_miR530作為應(yīng)用microRNA，將該microRNA的 前體序列正向轉(zhuǎn)入水稻中，提高osa-miR530的表達水平，轉(zhuǎn)基因水稻植株表現(xiàn)出株高降 低。
[0011] 本發(fā)明的優(yōu)點在于：
[0012] (1)本發(fā)明提供了 一種通過降低株高而提高水稻抗倒伏能力的水稻microRNA osa-miR530的應(yīng)用。申請人在水稻中過量表達osa-miR530后，轉(zhuǎn)基因陽性植株的株高降 低。
[0013] (2)本發(fā)明首次分尚克隆了水稻osa_miR530,并首次在水稻中過量表達了 osa-miR530。為培育高抗倒伏水稻品種提供了新的思路，也有助于進一步研究osa-miR530 和靶基因互作在調(diào)控植物株高過程中的作用機制。
[0014] (3)本發(fā)明中應(yīng)用的microRNA可以為水稻等禾谷類作物以及其它作物抗倒伏研 究提供支持。
【附圖說明】
[0015] 圖1為本發(fā)明的osa-miR530表達載體的構(gòu)建示意圖。將克隆在pMD18-T載體 上的osa-miR530利用BamHI和Spel酶切，替換pCAMBIA1390-ubi植物表達載體上BamHI 和Spel之間的DNA片段，這樣osa-miR530正向插入玉米泛素基因啟動子（Pubi)后，即 pCAMBIA1390-ubi-0sa-miR530 植物表達載體。
[0016] 圖2為檢測T3代轉(zhuǎn)基因水稻陽性植株中osa_miR530轉(zhuǎn)錄本相對表達水平結(jié)果 圖。其中osa-miR530_ox表示轉(zhuǎn)osa-miR530 的植株，#a-l、#a-4、#b-l、#b-2 和 #c-l代表 獨立的陽性轉(zhuǎn)基因株系；WT代表野生型水稻植株。EF-la作為熒光定量PCR分析的內(nèi)參基 因。
[0017] 圖3為轉(zhuǎn)osa_miR530水稻植株和野生型植株在四葉一心期和孕穗期株高比較 圖。A圖是四葉一心期表型圖；B圖是孕穗期株高表型；C圖是孕穗期株高比較圖。其中 osa-miR530-〇x表示轉(zhuǎn)osa-miR530的植株，#a-l、#b-l和#c-l代表獨立的陽性轉(zhuǎn)基因株 系；WT代表野生型水稻植株。**表示根據(jù)TTEST統(tǒng)計學(xué)分析差異極顯著（P〈0. 01)。
[0018] 圖4為轉(zhuǎn)osa_miR530水稻植株和野生型植株在成熟期期株高比較圖。A圖是成 熟期表型圖；B圖是成熟期株高比較圖。其中〇sa-miR530-〇X表示轉(zhuǎn)osa-miR530的植株， #a-l、#b-l和#c-l代表獨立的陽性轉(zhuǎn)基因株系；WT代表野生型水稻植株。林表示根據(jù) TTEST統(tǒng)計學(xué)分析差異極顯著（P〈0. 01)。
[0019] 圖5為轉(zhuǎn)osa-miR530水稻植株和野生型植株在成熟期植株不同節(jié)間長度比較圖。 A圖是成熟期植株不同節(jié)間長度表型圖；B圖是第一節(jié)間至第五節(jié)間的節(jié)間長度比較圖。其 中osa-miR530_ox表示轉(zhuǎn)osa_miR530的植株，#a_l、#b_l和#c_l代表獨立的陽性轉(zhuǎn)基因 株系；WT代表野生型水稻植株。*表示根據(jù)TTEST統(tǒng)計學(xué)分析差異顯著（P〈0. 05) ;**表示 根據(jù)TTEST統(tǒng)計學(xué)分析差異極顯著（P〈0. 01)。
【具體實施方式】
[0020] 以下實施例定義了本發(fā)明，并描述了本發(fā)明在分離克隆〇sa_miR530、構(gòu)建表達載 體以及驗證功能的方法。根據(jù)以下的描述和實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基 本特征，并且在不偏離本