酶催化高濃度3-羥基丙腈水解制備3-羥基丙酸的新方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物催化制備生物可降解材料單體和綠色化學(xué)領(lǐng)域，涉及利用腈水解 酶基因工程菌、培養(yǎng)物、或者加工制品催化高濃度3-羥基丙腈水解制備3-羥基丙酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 3-羥基丙酸(3-HP)是近年來興起的一種重要化學(xué)中間體，它具有羥基和羧基兩種 官能團(tuán)，是很多光學(xué)活性物質(zhì)的前體，2004年美國能源部將3-HP列為當(dāng)今世界12種最具開 發(fā)潛力的化工產(chǎn)品之一。3-HP可應(yīng)用于生產(chǎn)1，3_丙二醇、丙二酸、丙烯酸及特種聚酯材料 等;它本身是一種無耐藥性的植物性細(xì)胞毒素，具有選擇性的殺線蟲能力。由于其良好的玻 璃化轉(zhuǎn)化溫度及較高的熔點(diǎn)（大于170°C)，聚3-羥基丙酸極有可能替代部分傳統(tǒng)的聚合物 材料。此外，聚3-羥基丙酸具有很高的生物相容性及生物降解性，使其在外科手術(shù)及藥物緩 釋材料領(lǐng)域具備更大的應(yīng)用潛力。
[0003] 目前文獻(xiàn)報(bào)道的合成3-HP的方法主要有化學(xué)法與生物法兩種?；瘜W(xué)法主要包括3-羥基丙腈強(qiáng)堿水解法、丙烯酸水合法、1，3_丙二醛或3-羥基丙醛氧化法，由于存在產(chǎn)品不易 分離純化，生產(chǎn)成本較高，環(huán)境污染嚴(yán)重等不利因素，限制了其大規(guī)模的應(yīng)用。生物法和化 學(xué)法相比，由于具有成本低、操作簡(jiǎn)單、條件溫和、副產(chǎn)物少、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，備受人們的 青睞。生物法根據(jù)底物的不同主要分為兩種類型:一種是以Cargill公司為代表的以葡萄糖 為底物的生物轉(zhuǎn)化路線，該路線生成3-HP的產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到25 g/L(W0200242418 A2，2004 年）；另一種是由Suthers等(US6852517 B1，2001年)所開發(fā)的以甘油為底物的轉(zhuǎn)化路線， 該路線的最高產(chǎn)物濃度為71.9 g/L，時(shí)空產(chǎn)量為1.8 g L-l h-1 (Biotechnology and Bioengineering 2015，112，356-364)。雖然生物法具有很多優(yōu)勢(shì)，是未來的發(fā)展方向，但 是目前仍然存在著底物濃度與時(shí)空產(chǎn)量低等問題難以解決。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明中提供了一種產(chǎn)腈水解酶的基因工程菌，以及利用該酶或菌體制備3-羥基 丙酸的新方法(如化學(xué)方程式1)。
[0005] 化學(xué)方程式1合成路線 本發(fā)明中所述的產(chǎn)腈水解酶的基因工程菌，具體的構(gòu)建方法是：對(duì)來源于土壤的 NIT190(AAR97489 (Alal90His))基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后全合成相對(duì)應(yīng)序列，并在基因兩端 加上Nde I和BamH I酶切位點(diǎn)，并將合成的基因構(gòu)建到相應(yīng)表達(dá)載體中，然后表達(dá)載體轉(zhuǎn) 化入受體菌，即分別得到所述的產(chǎn)腈水解酶的基因工程菌NIT190;并對(duì)基因工程菌進(jìn)行發(fā) 酵培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)了腈水解酶的高效異源表達(dá)。
[0006] 本發(fā)明中所述產(chǎn)腈水解酶的基因工程菌所用到的載體系列包括:pET系列質(zhì)粒、 pTXBl系列、pGEX系列、pETduet系列、pTYB系列。
[0007] 本發(fā)明中所述的產(chǎn)腈水解酶的基因工程菌，其特征在于所述的能高效表達(dá)外源基 因的宿主菌為下列之一:BL21系列、Rosetta系列、Origami系列、Tuner系列。
[0008] 在本發(fā)明中，由質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主得到的轉(zhuǎn)化體可以基于已知信息生長(zhǎng)并產(chǎn)生本發(fā)明 所述的腈水解酶。任何一種人工的或天然的含有合適碳源、氮源、無機(jī)和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的介 質(zhì)，只要能滿足宿主菌體的生長(zhǎng)并且能夠表達(dá)出目的蛋白均可使用。培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件 沒有明確的限制，可以根據(jù)培養(yǎng)方法和類型等的不同而進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇，只要能滿足宿主 生長(zhǎng)并能產(chǎn)生相應(yīng)活性的腈水解酶即可。
[0009] 用于制備3-羥基丙酸的腈水解酶可以是上述腈水解酶基因工程重組菌的培養(yǎng)物， 也可以是通過將培養(yǎng)基離心后得到的菌體細(xì)胞或其加工制品。其中加工制品指的是菌體得 到的提取物、破碎液、或者對(duì)提取物腈水解酶進(jìn)行的分離和/或純化得到的分離產(chǎn)品，或者 通過固定化提取物或者加工制品的固定化制品。
[0010] 本發(fā)明還涉及全細(xì)胞或固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成3-羥基丙酸的方法，所述方法為： 將所述產(chǎn)腈水解酶的基因工程菌經(jīng)種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，按一定比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基， 培養(yǎng)一定時(shí)間后，加入誘導(dǎo)劑IPTG或乳糖或二者混合物誘導(dǎo)培養(yǎng)一定時(shí)間，離心收集菌體， 加入pH值為6.0~10.0的緩沖液，底物71~355 g/L，20~60 °C，200 rpm下轉(zhuǎn)化2~24小 時(shí)，反應(yīng)完全后經(jīng)離心、酸化、萃取、脫溶后得到3-羥基丙酸。
[0011] 也可以通過常規(guī)固定化細(xì)胞的方法將收集的菌體細(xì)胞固定化。然后將3-羥基丙酸 的緩沖液溶液，在適當(dāng)溫度下反應(yīng)，然后將上清液酸化、萃取、脫溶后得到3-羥基丙酸。
[0012] 反應(yīng)中適用的介質(zhì)可以是水或含有不同緩沖液的水介質(zhì)，其所用的緩沖液可以是 水中加入一種或幾種適當(dāng)磷酸鹽、Tris鹽酸鹽等。
[0013] 本發(fā)明所述的pH值優(yōu)選能夠保持在腈水解酶可以表達(dá)其活性的pH范圍內(nèi)，優(yōu)選pH 值為6.0~10.0。反應(yīng)溫度優(yōu)選保持在腈水解酶可以表達(dá)其活性的溫度范圍內(nèi)，優(yōu)選25~37 〇C。
[0014] 本發(fā)明所述的底物濃度沒有限制，通常底物為71~497 g/L，考慮到反應(yīng)效果，底 物濃度選大于等于213 g/L。同時(shí)為了提高生產(chǎn)效率，可以在反應(yīng)時(shí)批次添加底物。反應(yīng)產(chǎn) 物也可以在反應(yīng)結(jié)束后分離或通過原位分離的方法不斷的將產(chǎn)物移走。
[0015] 本發(fā)明所述的催化劑是靜息細(xì)胞時(shí)，其用量為1~1〇〇 g/L;當(dāng)使用的催化劑是固 定化細(xì)胞時(shí)，其用量為5~500 g/L;當(dāng)催化劑是細(xì)胞提取物時(shí)，其用量為5~100 mg/L。
【附圖說明】
[0016] 圖1產(chǎn)物3-羥基丙酸的高效液相色譜圖 圖2產(chǎn)物3-羥基丙酸的1HNMR圖 圖3產(chǎn)物3-羥基丙酸的13CNMR圖 圖4靜息細(xì)胞及其固定化后的批次反應(yīng)圖：靜息細(xì)胞（)，海藻酸鈣固定化細(xì)胞 (·)，GA/PEI交聯(lián)細(xì)胞株在Tris-HCl (100 mmol L-l，pH 8.0)中反應(yīng)（ΑΧΑ/ΡΕΙ交聯(lián) 細(xì)胞株在純水中反應(yīng)（▼)
【具體實(shí)施方式】
[0017]以下通過具體的實(shí)施例來進(jìn)一步說明，其目的在于更好的理解
【發(fā)明內(nèi)容】
，但是這 些實(shí)施例不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。
[0018] 實(shí)施例1:高表達(dá)基因工程菌的獲得 全基因合成由上海旭冠公司完成。
[0019] 根據(jù)腈水解酶NIT190(AAR97489 (Alal90His))，并對(duì)其進(jìn)行密碼子優(yōu)化，以期使 該基因能夠在大腸桿菌表達(dá)宿主中進(jìn)行表達(dá)，序列見附表。并在基因兩端加上Nde I和 BamH頂每切位點(diǎn)，構(gòu)建到pET-32a( + )載體中，得到基因工程菌NIT190。
[0020] 將制備得到的重組載體用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21、Rosetta或Origami以構(gòu) 建重組腈水解酶以可溶形式存在于菌體內(nèi)的基因工程菌，篩選出組建成功的基因工程菌， 其中以大腸桿菌BL21為宿主菌的重組菌目的蛋白表達(dá)相對(duì)較好。以目的蛋白表達(dá)量不低于 20%的工程菌，作為生產(chǎn)用工程菌菌種，并以甘油菌或牛奶凍干菌種形式保存。
[0021] 實(shí)施實(shí)例2基因工程菌的培養(yǎng)和靜息細(xì)胞的制備 挑取平板上單菌落接種至4 ml含相應(yīng)抗生素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6-8 h左右作為種 子液，按照1%的接種量接種至含800 ml的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37°C，200 rpm的搖床上培養(yǎng)至 0D_=0.8~1.2左右，加入終濃度為0.1 mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)14 h以上，以8000 rpm離心培 養(yǎng)液收集菌體。
[0022]實(shí)施實(shí)例3利用靜息細(xì)胞NIT190催化3-羥基丙腈單次水解 取0.2 g NIT190的