一種利用重組大腸桿菌無外源l-脯氨酸發(fā)酵生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]—種利用重組大腸桿菌無外源L-脯氨酸發(fā)酵生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸的方法，屬于微生物基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]反式-4-輕脯氨酸(trans-4-hydroxy-L_proline，Hyp)是L-脯氨酸輕基化后的產(chǎn)物，是亞氨基酸的一種。反式-4-羥脯氨酸最早發(fā)現(xiàn)于動物膠原蛋白中，因其有兩個不對稱碳原子而有四種立體異構(gòu)體，是一個重要的手性合成元件，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、食品、美容等行業(yè)。隨著反式-4-羥脯氨酸應(yīng)用領(lǐng)域的不斷擴(kuò)展，其生產(chǎn)方法也在逐漸發(fā)生變化，目前主要的生產(chǎn)方法是水解法和微生物發(fā)酵法。其中，由于水解法過程復(fù)雜、產(chǎn)生大量廢棄物、成本高等原因，逐漸被淘汰，而微生物發(fā)酵法能更好的解決這方面的問題，越來越受人們關(guān)注。
[0003]微生物發(fā)酵法是通過生物細(xì)胞表達(dá)的脯氨酸-4-羥化酶，將游離的脯氨酸轉(zhuǎn)化為反式-4-羥基-L-脯氨酸的生產(chǎn)方法。脯氨酸-4-羥化酶催化脯氨酸轉(zhuǎn)化為羥脯氨酸的過程中，需要以亞鐵離子作為催化輔因子，同時需要酮戊二酸和氧分子的參與。其中，在微生物體內(nèi)，L-脯氨酸的生產(chǎn)過程是，由α-酮戊二酸形成的谷氨酸，經(jīng)谷氨酸激酶(pr0B編碼)催化下由ATP提供磷酸基團(tuán)形成谷氨酰磷酸，又在谷氨酸脫氫酶(proA編碼)作用下將谷氨酸的γ -羧基還原成谷氨酸-T -半醛，然后自發(fā)環(huán)化形成五元環(huán)化合物Λ ’ 二氫吡咯-5-羧酸，再由二氫吡咯還原酶(proC編碼)催化形成脯氨酸。其中脯氨酸能夠反饋抑制谷氨酸激酶，而且proB與proA是作為一個操縱子proBA進(jìn)行表達(dá)的，將proBA突變成proB2A后能夠降低脯氨酸的反饋抑制，大量生產(chǎn)L-脯氨酸。
[0004]將谷氨酸激酶基因(ProB2A)與連有色氨酸串聯(lián)啟動子的反式-4-羥脯氨酸的脯氨酸羥化酶基因(hyp)構(gòu)建成共表達(dá)體系，轉(zhuǎn)入到宿主菌中，獲得含有該共表達(dá)體系的重組菌，能夠在無外源L-脯氨酸的條件下，利用葡萄糖直接連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)反式-4-羥脯氨基酸，降低發(fā)酵生產(chǎn)成本，具有廣闊的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在無外源L-脯氨酸的條件下，在微生物體內(nèi)，提高利用葡萄糖直接連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)反式-4-輕脯氨基酸的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。
[0006]本發(fā)明所述的利用重組菌發(fā)酵生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸的方法，其特征在于，將proBA突變成?抓84后，其編碼的谷氨酸激酶能夠降低L-脯氨酸的反饋抑制，與經(jīng)優(yōu)化后的連有色氨酸串聯(lián)啟動子的反式-4-羥脯氨酸的脯氨酸羥化酶基因(hyp)構(gòu)建成合適的共表達(dá)體系，將該共表達(dá)體系轉(zhuǎn)入到合適的宿主菌中，在無外源L-脯氨酸的條件下，能夠高效的利用葡萄糖直接連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸。
[0007]本發(fā)明中的兩種基因只有脯氨酸羥化酶基因(hyp)含有獨(dú)立的高效啟動子-色氨酸串聯(lián)啟動子(Ptrp2)，該啟動子是從已有的重組載體上酶切獲得。
[0008]本發(fā)明中的proB2A、hyp共表達(dá)體系構(gòu)建方法是，從已有的重組載體上酶切獲得ProB2A，然后將其連接到含有pET28a-Ptrp2-hyp的重組載體上，獲得pET28a-proB2A_Ptrp2-hyp，然后設(shè)計合適的酶切位點8&1^1、恥111，？0?獲得片段?抓84-?壯?2-1^?(8!0，將片段冊通過酶切位點連接到pUC19上，獲得共表達(dá)體系pUC19-proB2A-Ptrp2-hyp。
[0009]本發(fā)明中所用到的載體必須能夠在宿主內(nèi)獨(dú)立復(fù)制，且插入的兩種片段要都能夠隨著載體的復(fù)制而各自復(fù)制。
[0010]本發(fā)明所述重組菌株在發(fā)酵反式-4-羥基-L-脯氨酸中的應(yīng)用，其特征在于，所述的重組菌株在合適的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于合適的發(fā)酵條件下進(jìn)行培養(yǎng)，依發(fā)酵獲得的培養(yǎng)物、細(xì)胞體或它們的處理物作為酶源，依葡萄糖為底物，無需額外添加L-脯氨酸，高效利用葡萄糖直接連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸，與之前的發(fā)酵生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸的方法相比，能夠降低發(fā)酵成本提高經(jīng)濟(jì)效益。其中，所用的發(fā)酵培養(yǎng)不僅要滿足菌體的擴(kuò)大生長的需求，而且要適合脯氨酸-反式-4-羥化酶基因的表達(dá)；用來羥基化L-脯氨酸的酶源不僅包括脯氨酸-反式-4-羥化酶基因直接編碼合成的酶，還包括依該酶為基礎(chǔ)，經(jīng)修飾后的具有該酶類似催化活性的蛋白質(zhì)。
[0011]本發(fā)明所生產(chǎn)的反式-4-羥基-L-脯氨酸，將發(fā)酵液離心后，分布于上清液中，可通過適當(dāng)?shù)暮筇幚硎侄潍@得結(jié)晶狀的產(chǎn)品。
[0012]本發(fā)明發(fā)酵液所生產(chǎn)的反式-4-羥基-L-脯氨酸，可通過氯胺-T法檢測，也可以利用高效液相色譜法精確測定。
【附圖說明】
[0013]圖1是單一表達(dá)載體pET28a_BH的構(gòu)建。
[0014]圖2是單一表達(dá)載體pUC19-BH的構(gòu)建。
[0015]圖3是含單一表達(dá)載體菌株的獲得。
【具體實施方式】
[0016]—般性說明:【具體實施方式】中所用到的酶全部從TaKaRa公司購買，sanprep柱式質(zhì)粒DNA抽提試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒均購自上海生工，具體操作完全按照試劑盒的說明。
[0017]LB培養(yǎng)基:Tryptone 10g/L,Yeast extract 5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0_7.2ο
[0018]發(fā)酵培養(yǎng)基:GlucoselOg/L,Tryptone 8g/L，K2HP043g/L，NaCl 2g/L,MgSO40.2g/L，F(xiàn)eSO4ImM ,CaCl20.015g/L。
[0019]Amp抗性平板:I %Tryptone，0.5%Yeast extract, I %NaCl ,Ampicillin sodiumsalt 100yg/mLo
[0020]Kan抗性平板:I %Tryptone，0.5%Yeast extract, I %NaCl ,Kanamycin sulfate50yg/mLo
[0021]5XKCM緩沖液:0.5M KC1，0.15M CaCl2,0.25M MgCl2。
[0022]反式-4-羥脯氨酸的測定方法:將發(fā)酵液離心后，取上清，稀釋后取2.5mL于1mL試管中，加入ImL氯胺T(氯胺T溶液:將1.41g氯胺T溶于1mL水中，依次加入1mL正丙醇和80mL緩沖溶液，其中緩沖溶液配方為:將50g檸檬酸，26.3g NaOH和146.1g結(jié)晶乙酸鈉溶于水至1L，然后與200mL水以及300mL正丙醇混合)，搖勾后在室溫中放置20min;然后加入ImL顯色劑(顯色劑:稱取1g對二甲氨基苯甲醛，用35mL高氯酸溶解，緩慢加入65mL異丙醇)，搖勻后迅速將試管置于60°C水浴鍋中，20min后取出冷水冷卻，用分光光度計在560nm波長處測定吸光度值。
[0023]實施例1:含有proB2A的重組質(zhì)粒(pET28a-proB2A)的獲得
[0024]將實驗室冷凍保存的含有pET28a-pr0B2A的菌株進(jìn)行活化，于37°C，220rpm培養(yǎng)12-16小時，取培養(yǎng)后的菌液按照sanprep柱式質(zhì)粒DNA抽提試劑盒說明書提取質(zhì)粒。
[0025]實施例2:含有hyp的重組質(zhì)粒(pUC19-Ptrp2_hyp)的獲得
[0026]將實驗室冷凍保存的含有pUC19-Ptrp2-hyp的菌株進(jìn)行活化，于37°C，220rpm培養(yǎng)12-16小時，取培養(yǎng)后的菌液按照sanprep柱式質(zhì)粒DNA抽提試劑盒說明書提取質(zhì)粒。
[0027]實施例3:重組質(zhì)粒 pET28a-proB2A-Ptrp2_hyp 的構(gòu)建
[0028]利用限制性內(nèi)切酶EcoR1、BamHI從重組質(zhì)粒pUC19-Ptrp2-hyp中獲得片段Ptrp2-hyp ，然后用EcoR1、BamHI處理重組質(zhì)粒pET28a_proB2A，將酶處理后的片段Ptrp2_hyp、pET28a-proB2A用T4DNA連接酶在16°C的條件下過夜連接，將1yL的連接液轉(zhuǎn)入JM109感受態(tài)中，挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落培養(yǎng)提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗證，驗證正確的重組質(zhì)粒即為pET28a-proB2A-Ptrp2-hyp(pET28a-BH)。
[0029]實施例4:重組質(zhì)粒pUC19-proB2A-Ptrp2_hyp的構(gòu)建
[0030]由于質(zhì)粒pUC19與pET_28a(+ )的多克隆位點內(nèi)的酶切點不盡相同，因此設(shè)計兩端分別帶有BamH1、KpnI酶切位點的引物，通過PCR來獲得帶有合適酶切位點的proB2A-Ptrp2-hyp(BH)片段。然后用EC0R1、BamHI分別處理pr0B2A-Ptrp2-hyp(BH)片段以及pUC19質(zhì)粒，用T4DNA連接酶在16°C的條件下過夜連接，將1yL的連接液轉(zhuǎn)入JM109感受態(tài)中，挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落培養(yǎng)提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗證，驗證正確的重組質(zhì)粒即為pUC19-proB2A-Ptrp2-hyp(PUC19-BH)。
[0031]實施例5:利用重組菌株JM109/pUC19-BH、JM109/pET28a-BH的發(fā)酵生產(chǎn)反式-4-羥脯氨基酸
[0032]種子液的獲得:將實施例3、4獲得的重組菌株JM109/pUC19-BH、JM109/pET28a-BH分別在Amp與Kan抗性平板上劃線，挑單菌落分別接種到含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，在37°C，220rpm的條件下培養(yǎng)8h。
[0033]發(fā)酵培養(yǎng):按照6%的接種量將獲得的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C，220rpm的條件下培養(yǎng)24h。
[0034]發(fā)酵液中反式-4-羥脯氨基酸的測定:取發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液按照實施例一中反式-4-羥脯氨基酸的測定方法測定發(fā)酵液中反式-4-羥脯氨基酸的產(chǎn)量，測定結(jié)果顯示重組菌株JM109/pET28a-BH的反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量為0.9g/L，重組菌株JM109/pUC19-BH的反式-4-羥脯氨酸產(chǎn)量為1.lg/Lo
【主權(quán)項】
1.一株在無外源L-脯氨酸條件下發(fā)酵生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸的重組菌的構(gòu)建方法，是將 proB2A、Ptrp2_hyp 重組到質(zhì)粒 pUC19、pET28a 上，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pUC19-proB2A-Ptrp2_hyp(PUC19-BH)、pET28a-proB2A-Ptrp2-hyp(pET28a-BH)，然后該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，實現(xiàn)pr0B2A、hyp在大腸桿菌中的共表達(dá)，該重組菌能夠在無外源L-脯氨酸條件下發(fā)酵生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸。2.權(quán)利要求1所述的ProB2A、hyp共表達(dá)體系，僅hyp需要優(yōu)化后的組成型的色氨酸啟動子的啟動，proB2A并不需要啟動子啟動。3.權(quán)利要求1所述的?抓84是由proBA定點突變獲得的，其中proB基因突變了三個堿基，使編碼的氨基酸發(fā)生改變。4.權(quán)利要求1、2、3所述的口1'01324與口1'01^的區(qū)別僅僅在于口1'013發(fā)生突變41'04并未發(fā)生任何改變。5.權(quán)利要求1所述的重組載體所用的宿主菌為JM109或者BL21，同樣發(fā)酵條件下JM109作為宿主菌的產(chǎn)量較高。6.權(quán)利要求1、2所述的hyp是經(jīng)優(yōu)化后能在大腸桿菌中高效表達(dá)的基因。7.反式-4-羥脯氨酸的生產(chǎn)方法，其特征是將權(quán)利要求1所述的重組微生物在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，將得到的培養(yǎng)物、菌體或者它們的處理物作為酶源，依葡萄糖為底物，生成L-脯氨酸，然后在2-酮戊二酸和亞鐵離子的存在下，使L-脯氨酸轉(zhuǎn)化為反式-4-羥基-L-脯氨酸。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用重組大腸桿菌直接從葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸的方法，該方法是先將突變后的γ-谷氨酸激酶基因(proB2A)與連有色氨酸串聯(lián)啟動子的反式-4-羥脯氨酸的脯氨酸羥化酶基因(hyp)重組到合適的載體上，構(gòu)建proB2A與hyp的共表達(dá)體系，然后將此共表達(dá)體系導(dǎo)入到大腸桿菌中，得到的重組菌能夠?qū)崿F(xiàn)在無外源L-脯氨酸的條件下，能夠高效的利用葡萄糖直接發(fā)酵生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸，從而降低了發(fā)酵生產(chǎn)反式-4-羥脯氨酸的成本，提高了經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明還公開了所述大腸桿菌在羥脯氨酸生產(chǎn)中的應(yīng)用。
【IPC分類】C12P13/24, C12N15/70
【公開號】CN105567720
【申請?zhí)枴緾N201610034465
【發(fā)明人】張震宇, 姚動邦, 王曉姣, 黃建華, 魏照輝
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2016年1月19日