一種基于乳酸脫氫酶測定的卷煙煙氣細胞毒性評價方法
【專利摘要】一種基于乳酸脫氫酶測定的卷煙煙氣細胞毒性評價方法，包括以下步驟：1）配制實驗試劑；2）細胞接種；3）卷煙煙氣染毒；4）LDH測定；5）結(jié)果與分析。本發(fā)明通過煙氣粒相物萃取液和煙氣氣相物吸收液的制備，可分別考察煙氣粒相物、氣相物的細胞毒性，適于多種貼壁培養(yǎng)細胞，可用于考察卷煙煙氣對不同細胞系的細胞毒性。通過細胞裂解液的選擇、LDH基質(zhì)液反應(yīng)時間的優(yōu)化提高檢測靈敏度。并通過卷煙煙氣染毒濃度的優(yōu)化，確定了最佳染毒濃度，以獲得最佳劑量效應(yīng)曲線。通過LDH的測定，可反映卷煙煙氣粒相物和氣相物對細胞膜的損傷程度，揭示卷煙煙氣的細胞毒性機理。此外，本測定方法還具有操作快速簡便、靈敏性高、結(jié)果穩(wěn)定的優(yōu)點。
【專利說明】一種基于乳酸脫氫酶測定的卷煙煙氣細胞毒性評價方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及卷煙煙氣體外毒理學(xué)評價研究領(lǐng)域，具體說是一種基于乳酸脫氫酶(LDH)測定卷煙煙氣粒相物或氣相物細胞毒性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]開展體外毒理學(xué)實驗是評價吸煙對健康危害的重要方法。其中，細胞毒性在包括癌癥、炎癥等許多病理過程中起到重要作用，細胞毒性試驗是了解化合物與細胞和組織之間作用機理的重要途徑。如何科學(xué)準(zhǔn)確地評價卷煙產(chǎn)品以及煙草添加劑的危害性，目前國際上還沒有統(tǒng)一的方法和程序。檢測細胞毒性可通過多種生物學(xué)終點進行，例如通過測定酸性磷酸酶或其他蛋白活性來計算細胞數(shù)量、測定細胞代謝活性以及檢測細胞膜的完整性等生物學(xué)終點進行評價。根據(jù)不同檢測原理開展細胞毒性評價，可從不同角度揭示卷煙煙氣細胞毒性的作用機理。
[0003]細胞凋亡或化合物染毒而造成的細胞膜結(jié)構(gòu)的破壞會導(dǎo)致細胞漿內(nèi)的酶釋放到培養(yǎng)液里，其中包括酶活性較為穩(wěn)定的乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)。通過檢測釋放的乳酸脫氫酶的活性，可表征細胞膜的完整性，實現(xiàn)對化合物細胞毒性的定量分析。
[0004]目前，進行卷煙煙氣細胞毒性評價時采用的方法大多基于細胞存活率測定的原理，考察卷煙煙氣染毒對細胞膜完整性的影響還研究較少，亟需建立基于LDH測定的卷煙煙氣細胞毒性評價方法，定量準(zhǔn)確評價卷煙煙氣粒相物和氣相物的細胞毒性。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是建立的一種基于LDH測定的卷煙煙氣細胞毒性評價方法，為卷煙產(chǎn)品的細胞毒性評價提供方法學(xué)支持。LDH法的測定原理是基于在乳酸脫氫酶的作用下，氧化型輔酶I (NAD+)被反應(yīng)生成的還原型輔酶I (NADH)，再與氧化型2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-苯四唑(INT)在硫辛酰胺脫氫酶(diaphorase)的催化下反應(yīng)生成強生色物甲臜(formazan)，在490nm波長下產(chǎn)生吸收峰，從而確定釋放的乳酸脫氫酶的活性，作為細胞膜完整性的標(biāo)志，實現(xiàn)對細胞毒性的定量分析。
[0006]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:
一種基于乳酸脫氫酶測定的卷煙煙氣細胞毒性評價方法，包括以下步驟:
I)配制實驗試劑:有以下幾種:
1、LDH基質(zhì)液的配制:用0.2 mol/L的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液(pH8.2)配制LDH基質(zhì)液，其中各成分及其終濃度分別為:乳酸鋰5 X IO-2 mol/L、硝基氯化四氮唑(INT) 6.6X10-4 mol/L、吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS) 2.8X IO^4 mol/L、氧化型輔酶I (NAD) 1.3X10_3 mol/L，LDH基質(zhì)液應(yīng)在臨用前配制。
[0007]2.細胞裂解液:20% 的曲拉通 100 (Triton-100)。
[0008]3.終止液:4M的鹽酸(HCl)溶液。[0009]4.細胞培養(yǎng)基:溶劑為RPM1-1640培養(yǎng)基，其中胎牛血清的體積百分比為10%，L-谷氨酰胺的濃度為2 mM，青霉素的濃度為100 IU/ml，鏈霉素的濃度為lOOyg/ml。
[0010]5.卷煙煙氣染毒溶液:煙氣染毒溶液包括煙氣粒相物萃取液和煙氣氣相物吸收液。其具體制備方法如下:卷煙樣品于溫度(22±1) °C和相對濕度60%±3%條件下平衡48h;然后使用轉(zhuǎn)盤式吸煙機抽吸卷煙，煙氣總粒相物用劍橋濾片收集，根據(jù)煙氣總粒相物質(zhì)量加入相應(yīng)體積的DMSO溶劑，得到最終濃度為10 mg/ml的煙氣粒相物萃取液，使用前在一70 V以下儲存；在收集煙氣總粒相物的同時將氣相物通入裝有PBS溶液的吸收瓶(冰浴)中，粒相物收集完畢后，將PBS吸收液定容至與煙氣粒相物萃取液中DMSO體積相同，通過
0.2 μ m的濾膜除菌后，得到最終濃度與煙氣粒相物萃取液相當(dāng)?shù)臒煔鈿庀辔镂找海冶仨氃谥苽浜蟀胄r內(nèi)使用。
[0011]2)細胞接種:本方法所用細胞系為中國倉鼠卵巢細胞CHO細胞。由于不同的細胞系中LDH酶的含量不同，因此在考察卷煙煙氣對CHO細胞系的細胞毒性時，需開展預(yù)實驗，對細胞接種密度進行優(yōu)化。向96孔板的每孔中加入100 μ L細胞懸液，按照優(yōu)化好的細胞接種密度進行細胞接種，96孔板的最外周36個孔中每孔加入100 μ I生長培養(yǎng)液作為空白對照，其余每孔加入100 μ I細胞懸液，于37 °C、5% C02條件下培養(yǎng)24 h。
[0012]3)卷煙煙氣染毒:使用細胞培養(yǎng)基將卷煙煙氣染毒溶液調(diào)整到不同濃度，設(shè)置7個非零濃度，細胞接種24h后，吸去培養(yǎng)液，96孔板(除最外周36孔)每列6孔為一組分別設(shè)置為正常對照組、7個不同劑量的煙氣染毒組和LDH最大釋放組(細胞能釋放出來的LDH最大量)，正常對照組和LDH最大釋放組均每孔加入100 μ I的細胞培養(yǎng)基，煙氣染毒組每孔加入100 μ I不同濃度的煙 氣染毒溶液，96孔板的最外周36個孔中選擇其中6個孔作為培養(yǎng)基背景對照，再選擇6個孔加入最高染毒溶液作為染毒溶液背景對照，于37 °C、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。
[0013]4)LDH測定:染毒結(jié)束前15分鐘，在LDH最大釋放量孔中加入5 μ I裂解液。染毒結(jié)束后使用250g離心力對細胞培養(yǎng)板離心5分鐘，每孔移取50 μ I上清至透明96孔板，加入100 μ ILDH基質(zhì)液，反應(yīng)一段時間后，加入50 μ I終止液，使用酶標(biāo)儀檢測每孔在490 nm波長處的吸光值。
[0014]5)結(jié)果與分析
原始吸光值A(chǔ):A = A490 nm A (染毒孔吸光度值)=6個平行孔的吸光度平均值 A (染毒溶液背景)=6個平行孔的吸光度平均值 A (培養(yǎng)基背景)=6個平行孔的吸光度平均值 A(空白對照組)=6個平行孔的吸光度平均值 A (最大釋放組)=6個平行孔的吸光度平均值
【權(quán)利要求】
1.一種基于乳酸脫氫酶測定的卷煙煙氣細胞毒性評價方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)配制實驗試劑: (1)LDH基質(zhì)液的配制:用0.2mol/L的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液(PH8.2)配制LDH基質(zhì)液，其中各成分及其終濃度分別為:乳酸鋰5 X IO-2 mol/L、硝基氯化四氮唑(INT) 6.6X10—4 mol/L、吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS) 2.8X10—4 mol/L、氧化型輔酶I (NAD) 1.3X 10_3 mol/L, LDH基質(zhì)液應(yīng)在臨用前配制； (2)細胞裂解液:20%的曲拉通100(Triton-100)； (3)終止液:4M的鹽酸(HCl)溶液； (4)細胞培養(yǎng)基:溶劑為RPM1-1640培養(yǎng)基，其中胎牛血清的體積百分比為10%，L-谷氨酰胺的濃度為2 mM,青霉素的濃度為100 IU/ml，鏈霉素的濃度為100 μ g/ml ； (5)卷煙煙氣染毒溶液； 2)細胞接種:所用細胞系為中國倉鼠卵巢細胞CHO細胞；向96孔板的每孔中加入100μ L細胞懸液，按照優(yōu)化好的細胞接種密度進行細胞接種，96孔板的最外周36個孔中每孔加入100 μ I生長培養(yǎng)液作為空白對照，其余每孔加入100 μ I細胞懸液，于37 °C、5%C02條件下培養(yǎng)24 h ； 3)卷煙煙氣染毒:使 用細胞培養(yǎng)基將卷煙煙氣染毒溶液調(diào)整到不同濃度，設(shè)置7個非零濃度，細胞接種24h后，吸去培養(yǎng)液，96孔板(除最外周36孔)每列6孔為一組分別設(shè)置為正常對照組、7個不同劑量的煙氣染毒組和LDH最大釋放組，正常對照組和LDH最大釋放組均每孔加入100 μ I的細胞培養(yǎng)基，煙氣染毒組每孔加入100 μ I不同濃度的煙氣染毒溶液，96孔板的最外周36個孔中選擇其中6個孔作為培養(yǎng)基背景對照，再選擇6個孔加入最高染毒溶液作為染毒溶液背景對照，于37 °C、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h； 4)LDH測定:染毒結(jié)束前15分鐘，在LDH最大釋放量孔中加入5 μ I裂解液，染毒結(jié)束后使用250g離心力對細胞培養(yǎng)板離心5分鐘，每孔移取50 μ I上清至透明96孔板，加入100 μ ILDH基質(zhì)液，反應(yīng)一段時間后，加入50 μ I終止液，使用酶標(biāo)儀檢測每孔在490 nm波長處的吸光值； 5)結(jié)果與分析 原始吸光值A(chǔ):A = A490 nm A (染毒孔吸光度值)=6個平行孔的吸光度平均值 A (染毒溶液背景)=6個平行孔的吸光度平均值 A (培養(yǎng)基背景)=6個平行孔的吸光度平均值 A(空白對照組)=6個平行孔的吸光度平均值 A (最大釋放組)=6個平行孔的吸光度平均值:a光度儀-λ mmmmm'HA 空白對.1k1-a鑛.養(yǎng)基w景+.;麵聽難x 勝:。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于乳酸脫氫酶測定的卷煙煙氣細胞毒性評價方法，其特征在于:在開展細胞毒性評價前，需對染毒所用細胞株的細胞接種密度進行優(yōu)化，選擇LDH最大釋放量與空白對照組吸光度值相差最大，且細胞處于指數(shù)增長期的細胞個數(shù)作為最優(yōu)細胞接種密度，本發(fā)明中CHO細胞的最佳接種密度為10000個/孔。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于乳酸脫氫酶測定的卷煙煙氣細胞毒性評價方法，其特征在于:細胞裂解液使用時其終濃度為1%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于乳酸脫氫酶測定的卷煙煙氣細胞毒性評價方法，其特征在于:LDH基質(zhì)液的反應(yīng)時間為15min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于乳酸脫氫酶測定的卷煙煙氣細胞毒性評價方法，其特征在于:煙氣染毒溶液包括煙氣粒相物萃取液和煙氣氣相物吸收液，煙氣粒相物萃取液、煙氣氣相物吸收液細胞毒性濃度的染毒區(qū)間分別包括50 μ g/ml-250 μ g/ml和100 μ g/ml-400μ g/ml范 圍。
【文檔編號】C12Q1/02GK103820524SQ201410094849
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月16日
【發(fā)明者】陳歡, 楊進, 劉洋, 劉彤, 韓書磊, 吳帥賓, 付立偉, 侯宏衛(wèi), 胡清源 申請人:國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心