專利名稱:卷煙全煙氣染毒的細胞毒性測試方法
技術領域：
本發(fā)明涉及卷煙煙氣體外毒理學評價研究領域，具體說是一種卷煙全煙氣染毒的細胞毒性測試方法。
背景技術：
卷煙煙氣的體外毒理學研究已經(jīng)成為評價吸煙對健康危害的重要手段之一。卷煙煙氣是一種由幾千種化學物質組成的復雜的氣溶膠，煙氣成分分布于煙氣氣溶膠的粒相和氣相之中。煙氣粒相中的主要有害成分有煙堿、芳香胺類、酚類、煙草特有亞硝胺、多環(huán)芳烴類化合物等；co、氮氧化物及揮發(fā)性有機化合物等有害成分分布于氣相中；醛、酮類羰基化合物，氫氰酸、氨等有害成分于氣、粒相中均有分布。同時，隨著煙氣的陳化時間，煙氣成分在氣相和粒相之間的分配會有所改變。以往研究中，有關卷煙煙氣的體外毒理學研究大多集中于煙氣總粒相物的細胞毒性和基因毒性方面，僅研究其中煙氣總粒相物的毒性影·響不能夠全面真實地反映煙氣混合物體系的生物學效應。近年來，對于卷煙煙氣中氣相組分的收集和體外毒性的測試方法也發(fā)展建立起來。加拿大衛(wèi)生部推薦了進行卷煙煙氣總粒相物和氣相組分的體外毒性測試方法(Health Canada Official Method T-501 ;T_502 ；Τ-503 )，但是這些方法均是對卷煙煙氣中部分組分的毒性效應進行評價。
目前，有關卷煙煙氣體外染毒方法國內(nèi)已有專利公開。專利(公開號CN101671733)是一種改進的卷煙煙氣體外染毒方法，該方法通過將煙氣粒相部分提取液和氣相部分提取液混合后，進行細胞染毒。該方法中，細胞沒有處于真實的煙氣環(huán)境下直接、實時地感受新鮮的卷煙主流煙氣，測試結果不能直接反映卷煙煙氣實際暴露下的毒性效應。專利(公開號CN101393190)是一種卷煙主流煙氣細胞毒性測定方法，該方法是將煙氣導入細胞培養(yǎng)瓶中進行染毒，細胞與溶于培養(yǎng)液中的煙氣成分間接接觸，而對于不溶于培養(yǎng)液的煙氣成分無法與細胞接觸，使得測試結果不能全面地反映卷煙煙氣的細胞毒性。以上兩種方法的不足之處在于，無法使培養(yǎng)的細胞與卷煙煙氣進行直接且全面、充分地接觸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是針對上述現(xiàn)有技術中所存在的不足之處，并基于中性紅細胞毒性試驗的原理，而建立的一種卷煙全煙氣染毒的細胞毒性測試方法。本方法在進行卷煙全煙氣暴露時，使用插入式細胞培養(yǎng)皿，從而使培養(yǎng)的細胞處于煙氣和培養(yǎng)液的氣-液交界面，以到達細胞與卷煙煙氣直接、充分接觸的目的，可以全面地反映細胞對卷煙煙氣的感受，該方法靈敏度高，結果可以較為真實地反映卷煙煙氣的細胞毒性。
本發(fā)明的目的可通過下述技術措施來實現(xiàn)
本發(fā)明的方法包括以下步驟
a、配制實驗試劑
⑴生長培養(yǎng)液RPMI-1640 + 10%胎牛血清+ 2 mM L-谷氨酰胺+ 100 IU青霉素+ 100 μ g/ml鏈霉素；[0009](2)0.01 M 磷酸緩沖鹽溶液(PBS) :0. 2 g KCl, O. 2 g KH2PO4,8 g NaCl, 2. 9 gNa2HPO4 · 12H20，加雙蒸水至I L，pH 7. 2 7. 4，高壓滅菌；
⑶暴露培養(yǎng)液RPMI-1640 + 5%胎牛血清+ 2 mM L-谷氨酰胺+ 100 IU青霉素+ 100 μ g/ml 鏈霉素；
⑷中性紅儲存液0. 2 g中性紅，加雙蒸水至100 ml，過濾除菌；
(5)中性紅工作液用RPMI-1640稀釋至50 μ g/ml ；
(6)中性紅提取液50%乙醇，1%冰醋酸，49%雙蒸水，現(xiàn)用現(xiàn)配；
b、細胞接種培養(yǎng)
擴增培養(yǎng)的處于指數(shù)生長期的中國倉鼠卵巢細胞系CHO細胞經(jīng)胰酶消化，制備細胞懸液，接種于12 mm插入式細胞培養(yǎng)皿中——Transwell小室，細胞密度為3. 5X IO4個/ Transwell小室，于37°C >5% CO2條件下培養(yǎng)24 h ；
C、卷煙全煙氣染毒
細胞培養(yǎng)24 h后，將Transwell小室轉移至煙氣暴露裝置中，吸煙機抽吸卷煙產(chǎn)生的主流煙氣，與不同流速的潔凈空氣混合后排入到煙氣暴露裝置中，Transwell小室微孔膜上層為煙氣環(huán)境，下層為暴露培養(yǎng)液，生長在微孔膜上的細胞處于氣-液交界面處，于不同稀釋比例的卷煙主流煙氣中暴露培養(yǎng)；設置4個不同稀釋比例的卷煙煙氣劑量，每個卷煙煙氣劑量組抽吸4支卷煙，對照組細胞暴露于潔凈空氣中；
煙氣劑量以卷煙煙氣稀釋因子表示，即DF = (TS+Air) /TS
注DF(DilutionFactor),稀釋因子；TS(Tobacco Smoke),卷煙煙氣(流速);Air,潔凈空氣(流速)
d、中性紅細胞毒性試驗，
中性紅細胞毒性試驗
全煙氣暴露結束后，將Transwell小室轉入12孔板中，細胞于37°C、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入2 ml預熱的PBS洗一次，加入2 ml中性紅染液，于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)3 h，吸去中性紅染液，每孔加入2 ml PBS洗一次，加入I ml中性紅提取液，室溫下快速振蕩2(T30 min,將中性紅提取液轉入96孔板中(150 μ I/孔)，使用酶標儀檢測96孔板上中性紅提取液在540 nm波長處的吸光值(A(raw))。計算相對吸光值，
相對吸光值代表細胞存活率；
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e、結果與分析
分析單支卷煙的總粒相物(TPM)的釋放量，可以將以稀釋因子表示的煙氣劑量轉換為細胞所感受的TPM總量；繪制卷煙全煙氣暴露下細胞毒性的劑量-效應關系曲線。
本發(fā)明的有益效果如下[0027]本發(fā)明為了使卷煙主流煙氣中的粒相部分與氣相部分與培養(yǎng)的細胞直接且充分接觸，使用了插入式細胞培養(yǎng)皿，當進行卷煙全煙氣暴露時，貼壁生長在微孔膜上的細胞處于卷煙煙氣與暴露培養(yǎng)液的氣-液交界面處，從而解決了以往實驗中細胞不能全面感受卷煙全煙氣的不足之處；同時，本發(fā)明減少了甲醛固定液的固定步驟，使得實驗過程更加簡便。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術具有操作簡便、靈敏性更高、結果更全面可靠的優(yōu)點。


圖I為實施例I的卷煙的全煙氣細胞毒性曲線圖。
圖2為實施例2的卷煙的全煙氣細胞毒性曲線圖。
圖3為實施例3的卷煙的全煙氣細胞毒性曲線圖。
具體實施方式
本發(fā)明以下將結合實施例作進一步描述
本發(fā)明的方法包括以下步驟
a、配制實驗試劑
⑴生長培養(yǎng)液RPMI-1640 + 10%胎牛血清+ 2 mM L-谷氨酰胺+ 100 IU青霉素+ 100 μ g/ml鏈霉素；
(2)0.01 M 磷酸緩沖鹽溶液(PBS) :0. 2 g KCl, O. 2 g KH2PO4,8 g NaCl, 2. 9 gNa2HPO4 · 12H20，加雙蒸水至I L，pH 7. 2 7. 4，高壓滅菌；
⑶暴露培養(yǎng)液RPMI-1640 + 5%胎牛血清+ 2 mM L-谷氨酰胺+ 100 IU青霉素+ 100 μ g/ml 鏈霉素；
⑷中性紅儲存液0. 2 g中性紅，加雙蒸水至100 ml，過濾除菌；
(5)中性紅工作液用RPMI-1640稀釋至50 μ g/ml ；
(6)中性紅提取液50%乙醇，1%冰醋酸，49%雙蒸水，現(xiàn)用現(xiàn)配；
b、細胞接種培養(yǎng)
擴增培養(yǎng)的處于指數(shù)生長期的中國倉鼠卵巢細胞系CHO細胞經(jīng)胰酶消化，制備細胞懸液，接種于12 mm插入式細胞培養(yǎng)皿中——Transwell小室，細胞密度為3. 5X IO4個/Transwell小室，于37°C >5% CO2條件下培養(yǎng)24 h ；
C、卷煙全煙氣染毒
細胞培養(yǎng)24 h后，將Transwell小室轉移至煙氣暴露裝置中，吸煙機抽吸卷煙產(chǎn)生的主流煙氣，與不同流速的潔凈空氣混合后排入到煙氣暴露裝置中，Transwell小室微孔膜上層為煙氣環(huán)境，下層為暴露培養(yǎng)液，生長在微孔膜上的細胞處于氣-液交界面處，于不同稀釋比例的卷煙主流煙氣中暴露培養(yǎng)；設置4個不同稀釋比例的卷煙煙氣劑量，每個卷煙煙氣劑量組抽吸4支卷煙，對照組細胞暴露于潔凈空氣中；
煙氣劑量以卷煙煙氣稀釋因子表示，即DF = (TS+Air) /TS
注DF(DilutionFactor),稀釋因子；TS(Tobacco Smoke),卷煙煙氣(流速);Air,潔凈空氣(流速)
d、中性紅細胞毒性試驗，
中性紅細胞毒性試驗[0048]全煙氣暴露結束后，將Transwell小室轉入12孔板中，細胞于37°C、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入2 ml預熱的PBS洗一次，加入2 ml中性紅染液，于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)3 h，吸去中性紅染液，每孔加入2 ml PBS洗一次，加入I ml中性紅提取液，室溫下快速振蕩2(T30 min,將中性紅提取液轉入96孔板中(150 μ I/孔)，使用酶標儀檢測96孔板上中性紅提取液在540 nm波長處的吸光值(A(raw))。計算相對吸光值，
相對吸光值代表細胞存活率；

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e、結果與分析
分析單支卷煙的總粒相物(TPM)的釋放量，可以將以稀釋因子表示的煙氣劑量轉換為細胞所感受的TPM總量；繪制卷煙全煙氣暴露下細胞毒性的劑量-效應關系曲線。
具體實施例如下
實施例I某一國產(chǎn)卷煙的全煙氣染毒細胞毒性試驗。
首先按照上述步驟a配制實驗試劑，之后按照上述步驟b進行細胞接種培養(yǎng)，將培養(yǎng)的CHO細胞接種于12mm插入式細胞培養(yǎng)皿中(Transwell小室)，細胞密度為3. 5 X IO4個/ Transwell小室，于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h ;再按照上述步驟c進行卷煙全煙氣染毒，即將Transwell小室轉入煙氣暴露裝置中，卷煙樣品在深度抽吸條件下抽吸，產(chǎn)生的卷煙主流煙氣經(jīng)潔凈空氣稀釋后導入煙氣暴露裝置，設置4個不同稀釋比例的卷煙煙氣劑量(卷煙煙氣每口抽吸容量55 ml，每口排出時間2.8 s ;潔凈空氣流速分別設置為6 L/min、3.5 L/min、I. 25 L/min,O L/min)，每個卷煙煙氣劑量組抽吸4支卷煙，對照組細胞暴露于潔凈空氣中；暴露結束后，按照上述步驟d將Transwell小室轉入12孔板中，細胞于37°C、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入2 ml預熱的PBS洗一次，加入2 ml中性紅染液，于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)3 h，吸去中性紅染液，每孔加入2 ml PBS洗一次，加入I ml中性紅提取液，室溫下快速振蕩2(T30 min,將中性紅提取液轉入96孔板中(150μ I/孔)，使用酶標儀檢測96孔板上中性紅提取液在540 nm波長處的吸光值，計算細胞存活率。單支卷煙的TPM釋放量為48. 19 mg/支。
卷煙全煙氣的細胞毒性
權利要求
1.一種卷煙全煙氣染毒的細胞毒性測試方法，其特征在于所述方法包括以下步驟 a、配制實驗試劑 ⑴生長培養(yǎng)液RPMI-1640 + 10%胎牛血清+ 2 mM L-谷氨酰胺+ 100 IU青霉素+.100 u g/ml鏈霉素； (2)0.01 M 磷酸緩沖鹽溶液(PBS) :0. 2 g KCl, 0. 2 g KH2PO4,8 g NaCl, 2. 9 gNa2HPO4 12H20，加雙蒸水至I L，pH 7. 2 7. 4，高壓滅菌； ⑶暴露培養(yǎng)液RPMI-1640 + 5%胎牛血清+ 2 mM L-谷氨酰胺+ 100 IU青霉素+.100 u g/ml鏈霉素； ⑷中性紅儲存液0. 2 g中性紅，加雙蒸水至100 ml，過濾除菌； (5)中性紅工作液用RPMI-1640稀釋至50u g/ml ； (6)中性紅提取液50%こ醇，1%冰醋酸，49%雙蒸水，現(xiàn)用現(xiàn)配； b、細胞接種培養(yǎng) 擴增培養(yǎng)的處于指數(shù)生長期的中國倉鼠卵巢細胞系CHO細胞經(jīng)胰酶消化，制備細胞懸液，接種于12 mm插入式細胞培養(yǎng)皿中——Transwell小室，細胞密度為3. 5 X IO4個/Transwell小室，于37°C >5% CO2條件下培養(yǎng)24 h ； C、卷煙全煙氣染毒 細胞培養(yǎng)24 h后，將Transwell小室轉移至煙氣暴露裝置中，吸煙機抽吸卷煙產(chǎn)生的主流煙氣，與不同流速的潔凈空氣混合后排入到煙氣暴露裝置中，Transwell小室微孔膜上層為煙氣環(huán)境，下層為暴露培養(yǎng)液，生長在微孔膜上的細胞處于氣-液交界面處，于不同稀釋比例的卷煙主流煙氣中暴露培養(yǎng)；設置4個不同稀釋比例的卷煙煙氣劑量，每個卷煙煙氣劑量組抽吸4支卷煙，對照組細胞暴露于潔凈空氣中； d、中性紅細胞毒性試驗， 中性紅細胞毒性試驗 全煙氣暴露結束后，將TranswelI小室轉入12孔板中，細胞于37°C、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入2 ml預熱的PBS洗一次，加入2 ml中性紅染液，于37°C、.5% CO2條件下培養(yǎng)3 h，吸去中性紅染液，每孔加入2 ml PBS洗一次，加入I ml中性紅提取液，室溫下快速振蕩2(T30 min,將中性紅提取液轉入96孔板中，使用酶標儀檢測96孔板上中性紅提取液在540 nm波長處的吸光值；計算相對吸光值，相對吸光值代表細胞存活率； e、結果與分析 分析單支卷煙的總粒相物(TPM)的釋放量，可以將以稀釋因子表示的煙氣劑量轉換為細胞所感受的TPM總量；繪制卷煙全煙氣暴露下細胞毒性的劑量-效應關系曲線。
專利摘要
一種卷煙全煙氣染毒的細胞毒性測試方法，所述方法在進行卷煙全煙氣暴露時，使用插入式細胞培養(yǎng)皿，從而使培養(yǎng)的細胞處于煙氣和培養(yǎng)液的氣-液交界面，以到達細胞與卷煙煙氣直接、充分接觸的目的，可以全面地反映細胞對卷煙煙氣的感受，該方法靈敏度高，結果可以較為真實地反映卷煙煙氣的細胞毒性。本發(fā)明為了使卷煙主流煙氣中的粒相部分與氣相部分與培養(yǎng)的細胞直接且充分接觸，使用了插入式細胞培養(yǎng)皿，當進行卷煙全煙氣暴露時，貼壁生長在微孔膜上的細胞處于卷煙煙氣與暴露培養(yǎng)液的氣-液交界面處，從而解決了以往實驗中細胞不能全面感受卷煙全煙氣的不足之處；同時，本發(fā)明減少了甲醛固定液的固定步驟，使得實驗過程更加簡便。
文檔編號C12Q1/02GKCN102140489 B發(fā)布類型授權 專利申請?zhí)朇N 201110025480
公開日2012年12月5日 申請日期2011年1月24日
發(fā)明者李翔, 尚平平, 聶聰, 楊松, 王宜鵬, 劉惠民, 謝劍平 申請人:中國煙草總公司鄭州煙草研究院導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (1),