卷煙煙氣總粒相物誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激gsh/gssg的測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及到卷煙煙氣總粒相物的體外毒理學(xué)研究，具體來說是一種檢測卷煙煙 氣總粒相物誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷后胞內(nèi)谷胱甘肽還原態(tài)與氧化態(tài)比值（GSH/GSSG)的測定方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 卷煙煙氣是一種復(fù)雜的混合物，已報道的化學(xué)成分超過8000種，并且部分化 學(xué)成分顯示出一定的氧化性。當(dāng)細(xì)胞或組織暴露在卷煙煙氣中時，細(xì)胞體系的氧化/ 抗氧化平衡被打破，細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，并最終導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生病理性損傷。當(dāng)細(xì)胞發(fā) 生氧化應(yīng)激時，細(xì)胞內(nèi)活性氧族（R0S)以及活性氮族（R0N)增加，會對脂質(zhì)、蛋白質(zhì)以 及DNA等產(chǎn)生不同程度的氧化損傷，同時激活細(xì)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)如細(xì)胞外超氧化物歧 化酶（EC-S0D)，還原型谷胱甘肽（GSH)，過氧化氫酶等。在這些抗氧化物中，GSH在細(xì)胞 內(nèi)發(fā)揮重要的抗氧化作用。GSH是細(xì)胞內(nèi)含量豐富的硫醇式縮氨酸，對維持細(xì)胞氧化 還原平衡發(fā)揮重要作用，被廣泛作為細(xì)胞氧化應(yīng)激標(biāo)志物。針對細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)下 胞內(nèi)GSH/GSSG的檢測，用熒光測定法較易于操作，但檢測結(jié)果易受干擾；而采用高效液 相色譜法分析時，樣品前處理過程耗時長，并且對于大樣品的檢測不方便，所用的柱子 也較特殊。當(dāng)前，較常用的檢測方法是酶循環(huán)法，該方法最初由Owen和Belcher提出 (OwensCff,BelcherRV.Acolorimetricmicro-methodforthedeterminationof glutathione.BiochemJ. 1965;94:705-711)，之后由Tietze(TietzeF.Enzymic methodforquantitativedeterminationofnanogramamountsoftotalandoxidized glutathione:applicationstomammalianbloodandothertissues.AnalBiochem. 1969; 27 (3): 502-522.)和Griffith(Griffith0W.Determinationofglutathioneand glutathionedisulfideusingglutathionereductaseand2-vinylpyridine.Anal Biochem. 1980; 106(1) : 207-212.)進(jìn)行了改進(jìn)。但該方法仍然存在一些不足之處：首先， 其特異性不夠高，主要是由于5, 5' -二硫代雙-2-硝基苯甲酸（DTNB)可與許多含活性巰基 基團(tuán)的物質(zhì)反應(yīng)，同時，檢測的是谷胱甘肽總量，不能區(qū)分出GSH和GSSG;此外，該方法對樣 品的處理時間要求嚴(yán)格，從開始準(zhǔn)備樣品到檢測，時間不能超過3分鐘，否則將影響測定 結(jié)果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的正是針對上述存在的問題對部分操作步驟進(jìn)行了改進(jìn)，基于酶循環(huán) 法建立一種卷煙煙氣總粒相物誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激時胞內(nèi)GSH/GSSG的檢測方法。
[0004] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的： 一種卷煙煙氣總粒相物誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激GSH/GSSG的測定方法，包括以下工藝步驟： 1)配制實驗試劑：包括（1)生長培養(yǎng)液，（2)磷酸緩沖鹽溶液（PBS)，（3) 1 %的胰酶， (4) 三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液（SBB)，（ 5)掩蔽劑，（6)脫蛋白質(zhì)劑，（7)GSSG標(biāo)準(zhǔn)溶 液，（8)反應(yīng)混合液，（9)還原型輔酶II(NADPH)溶液，（10)陰性對照； 2 )制備卷煙煙氣總粒相物：將捕集有卷煙煙氣總粒相物的劍橋濾片直接放入錐形瓶 中，加入適量體積的DMSO,萃取捕集在劍橋濾片上的主流煙氣粒相組分，室溫振蕩20min， 去濾片過濾除菌，制備煙氣總粒相物濃度為10mg/ml的樣品儲存液，于-80°C保存。
[0005] 3 )細(xì)胞接種培養(yǎng)：細(xì)胞進(jìn)行消化以后，制備細(xì)胞懸液，6孔板的所有孔中每孔加入 2. 0mL生長培養(yǎng)液+ 450yL細(xì)胞懸液，于37 °C、5 %C02條件下培養(yǎng)24h; 4 )卷煙煙氣總粒相物染毒：用生長培養(yǎng)液將卷煙煙氣總粒相物儲存液調(diào)整到不同濃 度，終濃度設(shè)置至少包括2個非零濃度，使細(xì)胞存活率在70 %以上，培養(yǎng)24h后的細(xì)胞，吸 去培養(yǎng)液，6孔板中陰性對照組每孔加入2.5mL20iig/mLDMS0生長培養(yǎng)液，實驗組每孔 加入2.5mL含有不同濃度卷煙煙氣總粒相物的生長培養(yǎng)液，于37 °C、5 %C02條件下培養(yǎng) 24h； 5) 樣品處理及GSH/GSSG測定：細(xì)胞孵育24h后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入1mL37°C預(yù) 熱的PBS洗一次，經(jīng)胰酶消化制得細(xì)胞團(tuán)樣品，細(xì)胞團(tuán)樣品在1. 5mL離心管中重懸于500 yLSBB緩沖液中，細(xì)胞超聲破碎儀破碎細(xì)胞(功率300W，3 ~5秒/次，間隔10秒，重復(fù) 3~5次)，10000g、4 °C下離心10min，收集上清液，加入5 %(v/v)5-磺基水楊酸，混均，取 50yL加入1. 5mL離心管，并加入50yLPBS稀釋，制得檢測樣品； 取96孔板上兩列孔，將樣品以及標(biāo)準(zhǔn)品，一式兩份，每孔50yL，加入相應(yīng)孔內(nèi)，空白 孔加入50yLPBS緩沖液；其中，用于檢測GSSG的一列樣品孔內(nèi)加入掩蔽劑1yL/孔， 另一列樣品孔用于檢測總的GSH，不加入掩蔽劑。孵化1min;樣品孔以及標(biāo)準(zhǔn)品孔，所有檢 測孔，每孔加入150iiL反應(yīng)混合液，孵化2min;樣品孔以及標(biāo)準(zhǔn)品孔，所有檢測孔，每孔 加入NADPH溶液50yL;立即在412nm下測定吸光值0D，每30s記錄一次0D值，記錄3 min； 6) 結(jié)果分析： (1) 原始吸光值0D。，反應(yīng)t時間時檢測的吸光值0Dt; (2) 反應(yīng)t時間內(nèi)吸光值的變化值A(chǔ)〇Dt:A〇Dt=0Dt_ 0D。； (3) 所有檢測孔內(nèi)由相應(yīng)的A〇Dt做關(guān)于時間t的一次函數(shù)，其中斜率為該孔檢測濃度 下的A〇D/min; (4) 所有檢測孔的A〇D/min，經(jīng)空白對照A〇D/min(空白）校正為A〇D/min(校正）：A〇D/ min(校正）=A0D/min--AOD/min(空白） AODl/min:GSH(總）檢測孔的AOD/min(校正） A〇D2/min:GSSG檢測孔的AOD/min(校正） (5) 以GSSG標(biāo)準(zhǔn)樣品的AOD/min(校正;和濃度，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線r-萬 (6) 樣品中GSH/GSSG為： 各實驗試劑的配制萬法如卜：
(1)生長培養(yǎng)液：RPMI-1640，10 %胎牛血清，2mML-谷氨酰胺，100IU/ml青霉素，100yg/ml鏈霉素； ⑵磷酸緩沖鹽溶液（PBS):0.2gKC1，0.2gKH2P04,8gNaCl，2.9gNa2HP04*12H20， 加雙蒸水至1L，pH7. 2~7. 4,高壓滅菌； (3) 1 %的胰酶：1g胰酶定容至100mLPBS中（冰浴下攪拌3h~4h)，濾膜過濾，分 裝到10mL離心管，于-20°C凍存； (4) 三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液（SBB):其中含有：100mM三羥甲基氨基甲烷鹽 酸鹽，10mM硼酸鹽，5mM絲氨酸，1mM二乙烯三胺五乙酸，PH7. 0; (5) 掩蔽劑：v/v25 %的2-乙烯基吡啶無水乙醇溶液； (6) 脫蛋白質(zhì)劑：5_磺基水楊酸； (7)GSSG標(biāo)準(zhǔn)溶液：12. 5yM的GSSG標(biāo)準(zhǔn)液用PBS逐級2倍稀釋至0. 195yM; (8) 反應(yīng)混合液(現(xiàn)用現(xiàn)配）：由以下三種溶液定量混合而成：15mMDTNB(5, 5'-二 硫代雙2-硝基苯甲酸）300yL，5U/mL谷胱甘肽還原酶200yL，4. 0mLPBS緩沖液； (9) 還原型輔酶II(NADPH)溶液：10mLPBS溶解100mg的NADPH，使用時稀釋至2mg/mL； (10) 陰性對照：2 % (v/v)二甲基亞砜（DMSO)。
[0006] 本發(fā)明建立了一種卷煙煙氣總粒相物誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時胞內(nèi)谷胱甘肽還原態(tài) (GSH)與氧化態(tài)（GSSG)比值的測定方法，其特點在于：應(yīng)用SBB緩沖液重懸細(xì)胞，防止人為 的氧化GSH，同時增加了樣品的有效處理時間；考慮到細(xì)胞裂解液中存在活性巰基的蛋白 質(zhì)，為了減少非谷胱甘肽的硫化物與DTNB結(jié)合而干擾檢測，在樣品測定前，加入5-磺基水 楊酸用于脫去樣品中蛋白質(zhì)，減少了測定過程中的干擾；由于本方法同時檢測GSH和GSSG， 所以在結(jié)果處理時應(yīng)用了差減法，可以分別得到GSH和GSSG濃度，并經(jīng)化簡處理得到分析 結(jié)果中的計算公式。本發(fā)明具有耗時短，操作簡便，靈敏度高，結(jié)果可靠的優(yōu)點。
[0007]
【附圖說明】
[0008] 圖1.CSC染