用誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)制備造血干細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于造血干細(xì)胞制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)制 備造血干細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 血液腫瘤治療中，最常用的方法是放療/化療，通過(guò)放/化療可殺死腫瘤細(xì)胞或異 ?？寺〖?xì)胞，終止其無(wú)限增殖；同時(shí)，在治療中加大放/化療劑量，可最大限度殺滅腫瘤細(xì) 胞，增加腫瘤殺滅的效果；但增大放/化療劑量的同時(shí)也會(huì)加重對(duì)造血功能、免疫功能的損 傷。所以血液腫瘤化療/放療之后，一般都需要對(duì)引起的造血功能損傷進(jìn)行修復(fù)和治療。造 血功能損傷分為造血細(xì)胞損傷和造血微環(huán)境損傷，后者損傷嚴(yán)重程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于前者，且更 加持久甚至不可逆轉(zhuǎn)，這是影響患者繼續(xù)接受后續(xù)治療的主要因素。
[0003] 造血細(xì)胞和造血微環(huán)境的損傷修復(fù)比較好的方法細(xì)胞移植，將正常功能的造血干 細(xì)胞（或者是祖細(xì)胞，祖細(xì)胞屬于成體干細(xì)胞，是一種未分化的多能或?qū)Ｄ芨杉?xì)胞）移植至 損傷部位，自行生長(zhǎng)分化從而對(duì)損傷部位進(jìn)行補(bǔ)充和修復(fù)。但是制備所需要的造血干細(xì)胞， 多采用iPS細(xì)胞（inducedpluripotentstemcell，誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，其具有多能干細(xì)胞 的特性，并具有多種分化潛能）進(jìn)行體外誘導(dǎo)制備。采用iPS細(xì)胞在體外分化制備的造血 干細(xì)胞，是自身體細(xì)胞重編程而來(lái)的，不存在異體免疫排斥的問(wèn)題。
[0004] 現(xiàn)有以iPS細(xì)胞分化為造血干/祖細(xì)胞的方法是細(xì)胞因子單層誘導(dǎo)，即以iPS細(xì) 胞在體外培養(yǎng)中用造血干細(xì)胞的細(xì)胞因子誘導(dǎo)其分化。但是這一方法在實(shí)施中，誘導(dǎo)過(guò)程 不是在人體內(nèi)調(diào)控和特定環(huán)境下進(jìn)行，有一部分細(xì)胞的分化方向并不是完全造血干細(xì)胞進(jìn) 行，也有一些細(xì)胞雖然分化具有造血干細(xì)胞的性質(zhì)、但是還會(huì)同時(shí)帶有一些其他的性狀，同 時(shí)還有一部分細(xì)胞分化程度低或者是不分化，達(dá)不到造血干細(xì)胞的程度；所以這一方法制 備造血干細(xì)胞的誘導(dǎo)率不高，能得到較為適合的造血干細(xì)胞的數(shù)量比較少；而且要進(jìn)行大 量培養(yǎng)，細(xì)胞因子在現(xiàn)階段在誘導(dǎo)物中是屬于價(jià)格最昂貴的，所以在產(chǎn)效收益上該方法無(wú) 法滿足規(guī)模實(shí)施的可行性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明實(shí)施的目的在于克服現(xiàn)有造血干細(xì)胞大量制備的缺陷，提供一種用誘導(dǎo)性 多能干細(xì)胞誘導(dǎo)制備造血干細(xì)胞的方法。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案如下：
[0007] -種用誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)制備造血干細(xì)胞的方法，包括如下步驟：
[0008] 獲取誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞和小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞；
[0009] 將所述誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞和小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞于02體積分?jǐn)?shù)1~5%條件下共培 養(yǎng)。
[0010] 采用本發(fā)明的上述方法，采用小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建造血細(xì)胞的模擬骨髓微環(huán) 境，將其與誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞共培養(yǎng)，通過(guò)共培養(yǎng)使細(xì)胞代謝中產(chǎn)生細(xì)胞信號(hào)蛋白、細(xì)胞因 子等，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成造血干細(xì)胞；并且控制誘導(dǎo)的過(guò)程在低氧 條件進(jìn)行，可以加強(qiáng)細(xì)胞的自分泌能力，分泌物的量增加以后可以使上述誘導(dǎo)效果進(jìn)一步 加強(qiáng)，更利于誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的分化，具有更高的細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0012] 本發(fā)明實(shí)例提出一種用誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)制備造血干細(xì)胞的方法，方法步驟 包括：
[0013]S10,獲取誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞和小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞；
[0014]S20,將步驟S10獲取的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞和小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞于含02量1~5% (體積分?jǐn)?shù)）環(huán)境下共培養(yǎng)。
[0015] 本發(fā)明的上述造血干細(xì)胞的制備方法，采用小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建誘導(dǎo)性多能干 細(xì)胞的誘導(dǎo)基質(zhì)。骨髓基質(zhì)細(xì)胞是骨髓中的一類多能干細(xì)胞，在骨髓組織中對(duì)骨髓血系細(xì) 胞起支持誘導(dǎo)作用，又因其來(lái)自于骨髓基質(zhì)，因而稱其為"骨髓基質(zhì)細(xì)胞。而根據(jù)對(duì)骨髓內(nèi) 環(huán)境的分析和研究，骨髓基質(zhì)的重要功能是造血系統(tǒng)提供的微環(huán)境，對(duì)造血系統(tǒng)起支持作 用。骨髓基質(zhì)的重要細(xì)胞組成就是骨髓基質(zhì)細(xì)胞，而小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞源于小鼠骨髓基質(zhì)， 其表面表達(dá)envgp70抗原，在形態(tài)學(xué)、表型及功能上有吞噬細(xì)胞的特征，更容易對(duì)其他細(xì)胞 產(chǎn)生相互作用，利于誘導(dǎo)。所以本案中的采用小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建造血細(xì)胞微環(huán)境，將其 與誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞共培養(yǎng)，通過(guò)共培養(yǎng)使細(xì)胞代謝中產(chǎn)生細(xì)胞信號(hào)蛋白、細(xì)胞因子等，從 而實(shí)現(xiàn)對(duì)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)。
[0016] 同時(shí)，共培養(yǎng)的過(guò)程在含02量1~5%(體積分?jǐn)?shù)）環(huán)境下進(jìn)行，相比通常培養(yǎng)的 空氣氛圍（空氣中含〇2量21% )，低氧環(huán)境培養(yǎng)更加會(huì)接近于體內(nèi)代謝的情況；在多種研究 和報(bào)道中，正常生理狀態(tài)下人體內(nèi)的氧濃度一般是2%~9%，骨髓質(zhì)和骨髓中的氧濃度更 低一些，基本上只有1%左右，所以本案中采用含02量1~5%的低氧環(huán)境進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)， 一方面是為了使細(xì)胞的誘導(dǎo)環(huán)境能更加貼合于體內(nèi)造血干細(xì)胞生成環(huán)境。而且在反復(fù)實(shí)施 后，低氧條件下小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中其生產(chǎn)出的細(xì)胞因子的量有明顯的提升，研 究發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境下，原因可能是在低氧的條件下，細(xì)胞自分泌的功能自身會(huì)增強(qiáng)，導(dǎo)致在聚 集培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞因子的濃度得到提高，而有利于細(xì)胞表型的維持，是自身更加適于低氧 下的生長(zhǎng)和繁殖。
[0017] 因此采用本案的上述方式進(jìn)行共培養(yǎng)，以小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)種子細(xì)胞誘導(dǎo)性 多能干細(xì)胞向造血干細(xì)胞分化，其構(gòu)建的誘導(dǎo)環(huán)境是模擬的細(xì)胞骨髓微環(huán)境，而不是單純 的細(xì)胞因子化學(xué)環(huán)境，通過(guò)細(xì)胞間的通信和相互作用，更加利于分化表型的形成；同時(shí)，在 共培養(yǎng)的過(guò)程中，在對(duì)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化的過(guò)程中，分化的過(guò)程起重要作用可 能不是細(xì)胞因子，而是一些胞間物質(zhì)，所以本案的共培養(yǎng)中小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞分析的很多 細(xì)胞因子之外的代謝物質(zhì)能對(duì)現(xiàn)有的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的不足進(jìn)行彌補(bǔ)；并且在低氧環(huán)境下進(jìn) 行誘導(dǎo)，通過(guò)加強(qiáng)細(xì)胞的自分泌能力，分泌物的量增加以后可以使上述誘導(dǎo)效果進(jìn)一步加 強(qiáng)，更利于誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的分化。
[0018] 在本發(fā)明的上述實(shí)施方式中，細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)的過(guò)程中，培養(yǎng)中由于采用的是低 氧誘導(dǎo)，可能會(huì)影響細(xì)胞的呼吸過(guò)程，不能完全的進(jìn)行有氧代謝；代謝的過(guò)程中培養(yǎng)液中的 乳酸含量相比通常培養(yǎng)的方式中增加的更快，較大濃度的乳酸一方面會(huì)酸化培養(yǎng)環(huán)境，同 時(shí)還會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)；因此相比通常的培養(yǎng)，本案中需要進(jìn)一步加快換液，以避免乳酸大 量積累。基本上實(shí)施中按照20~30h/次進(jìn)行即可。
[0019] 同時(shí)，在本案的共培養(yǎng)中采用mTeSRr培養(yǎng)基，mTeSRr培養(yǎng)基是商品化的無(wú)飼養(yǎng)層 培養(yǎng)基，也是一種不含血清的完全細(xì)胞培養(yǎng)基，可以直接購(gòu)買獲得。其不含有細(xì)胞因子的成 分，一方面相比其他含有細(xì)胞生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基可以避免導(dǎo)致出現(xiàn)非造血干細(xì)胞的誘導(dǎo)； 另一方面在于其中含有一些蛋白成分可以對(duì)細(xì)胞的胞間蛋白進(jìn)行補(bǔ)充，加強(qiáng)誘導(dǎo)過(guò)程中的 細(xì)胞通信。
[0020] 進(jìn)一步在細(xì)胞共培養(yǎng)的過(guò)程中，小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞自身的代謝和自分泌是形成誘 導(dǎo)環(huán)境的主體，步驟S20在實(shí)施的過(guò)程中按照，誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞和小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的 數(shù)量比為1:3~6進(jìn)行共培養(yǎng)。在實(shí)施中，小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞較少時(shí)，誘導(dǎo)的效力非常低， 直接持續(xù)到培養(yǎng)至l〇d左右時(shí)，其誘導(dǎo)分化聲稱的造血干細(xì)胞的量不多；而如果進(jìn)一步增 加小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量至比較多的，共培養(yǎng)體系中誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞自身的生長(zhǎng)和分 化處于競(jìng)爭(zhēng)性劣勢(shì)，反倒小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞自身快速大量擴(kuò)增，造成誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的 生長(zhǎng)分化受到抑制；因此在反復(fù)實(shí)施對(duì)比之后，本案優(yōu)選采用上述比例范圍下進(jìn)行實(shí)施。
[0021] 同時(shí)上述步驟S20實(shí)施至基本上誘導(dǎo)分化生成造血干細(xì)胞的程度基本穩(wěn)定之后， 還可以增加步驟S30,將步驟S20誘導(dǎo)之后生成的造血干細(xì)胞用含有造血干細(xì)胞的典型 細(xì)胞因子的培養(yǎng)基進(jìn)行增強(qiáng)誘導(dǎo)。這些典型細(xì)胞因子就是現(xiàn)有通常的誘導(dǎo)方法中采用的 細(xì)胞因子：SCF(stemcellfactor、干細(xì)胞因子）、VEGF(vascularendothelialgrowth factor、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）、IL-6(白介素-6)、TP0(血小板生成素）、EPO(紅細(xì)胞生成 素）、G-CSF(粒細(xì)胞集落刺激因子）、GM-CSF(粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子）。當(dāng)然本案 中這幾種主要都是與造血干細(xì)胞的功能和表型形成相關(guān)的細(xì)胞因子，所以本案中采用這些 來(lái)做最后的增強(qiáng)誘導(dǎo)。方式可以直接采用將步驟S20誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)之后形成的細(xì) 胞用含上述細(xì)胞因子的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)即可。當(dāng)然，本次步驟S30增強(qiáng)誘導(dǎo)時(shí)間不需要進(jìn) 行很長(zhǎng)時(shí)間，因?yàn)椴襟ES20實(shí)施到共培養(yǎng)結(jié)束之后，雖然可能在某些表型或者細(xì)胞特性上 不是非常完全，其本身已經(jīng)是造血干細(xì)胞。所以步驟S30增強(qiáng)補(bǔ)充誘導(dǎo)的培養(yǎng)的時(shí)間5~ 10h即可，不需要太長(zhǎng)時(shí)間；這一過(guò)程中的培養(yǎng)基可以采用適當(dāng)?shù)臒o(wú)血清培養(yǎng)基即可。同 時(shí)，上述步驟S30實(shí)施的過(guò)程中，不完全需要上述SCF、VEGF、IL-6、ΤΡ0、ΕΡ0、G-CSF、GM-CSF 全部的細(xì)胞因子，選擇3~5種即可。
[0022] 采用本發(fā)明的上述方法，采用小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建造血細(xì)胞的模擬骨髓微環(huán) 境，將其與誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞共培養(yǎng)，通過(guò)共培養(yǎng)使細(xì)胞代謝中產(chǎn)生細(xì)胞信號(hào)蛋白、細(xì)胞因 子等，從而實(shí)現(xiàn)將誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成造血干細(xì)胞；并且控制誘導(dǎo)的過(guò)程在低氧 條件進(jìn)行，可以加強(qiáng)細(xì)胞的自分泌能力，分泌物的量增加以后可以使上述誘導(dǎo)效果進(jìn)一步 加強(qiáng)，更利于誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的分化。
[0023] 為使本發(fā)明的上述實(shí)施的技術(shù)細(xì)節(jié)和過(guò)程方法能更易于本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解 和實(shí)施參考，同時(shí)凸顯出本發(fā)明的性能和品質(zhì)，以下通過(guò)具體的實(shí)施例進(jìn)行舉例說(shuō)明。
[0024] 實(shí)施例1
[0025] SI1，獲取iPS細(xì)胞并進(jìn)行傳代：
[0026] 將購(gòu)于中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院的iPS細(xì)胞株UC013,使用無(wú)飼養(yǎng)層的 培養(yǎng)方式進(jìn)行培養(yǎng)，具體可以參考如下：
[0027] 采用細(xì)胞培養(yǎng)板作為培養(yǎng)器材，將細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)孔用含有1WT% Matrigel(基底膜基質(zhì)膠，BD公司）的DMEM/F12培養(yǎng)基浸泡lh后，用微量移