一種對t細(xì)胞和造血干細(xì)胞具有高效感染和促增殖能力的慢病毒載體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種用于構(gòu)建具有高效轉(zhuǎn) 染能力和表達(dá)高效生物活性的慢病毒載體方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著生物技術(shù)的發(fā)展，基因工程（genetic engineering)在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用越來越 廣泛?；蚬こ淌且苑肿舆z傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段， 將不同來源的基因按預(yù)先設(shè)計的藍(lán)圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分子，然后導(dǎo)入活細(xì)胞，以改變 生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品的技術(shù)?；蚬こ碳夹g(shù)為基因的結(jié)構(gòu)和功能 的研宄提供了有力的手段。
[0003] 對于哺乳動物細(xì)胞的遺傳改造，需要使用合適的載體，將外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞 中并實現(xiàn)其應(yīng)有的功能。常用的載體包括慢病毒載體、腺病毒載體以及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等。 但是，仍然存在著感染效率低、實驗流程復(fù)雜的問題。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員致力于開發(fā)新 的感染效率高，且生物活性強(qiáng)的哺乳動物細(xì)胞遺傳改造技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于構(gòu)建具有高效轉(zhuǎn)染能力和表達(dá)高效生物活性的 慢病毒載體方法及其應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種重組病毒包膜糖蛋白，所述蛋白具有式I所示的 結(jié)構(gòu)：
[0006] N 端' B-A C 端'（I)
[0007] 其中，
[0008] 元件A為衍生自野生型病毒包膜糖蛋白的蛋白元件；
[0009] 元件B為輔助蛋白元件，并且所述輔助蛋白元件可特異性識別細(xì)胞膜表面蛋白；
[0010] 表示連接上述各元件的肽鍵或肽接頭。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述病毒為慢病毒、腺病毒、或腺相關(guān)病毒。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述慢病毒為水皰口炎病毒。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述野生型病毒包膜糖蛋白為水皰口炎病毒包膜糖蛋白。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述元件A為VSVG (水皰口炎病毒糖蛋白）。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述元件A的氨基酸序列如SEQ ID NO. : 2所示，優(yōu)選地，所述元 件A的編碼多核苷酸序列如SEQ ID NO. : 1所示。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞膜表面蛋白為表達(dá)于T細(xì)胞細(xì)胞膜表面的蛋白；優(yōu)選 地，所述細(xì)胞膜表面蛋白選自：VLA-4、VLA-5、或其組合。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞膜表面蛋白為表達(dá)于造血干細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞膜表面的蛋 白。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述元件B衍生自纖連蛋白、VCAM-I或其活性片段（能夠與 VLA-4和/或VLA-5特異性結(jié)合的多肽片段）。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述元件B選自：FN-P及其活性片段、CSl及其活性片段、或其組 合。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述元件B的序列如SEQ ID NO. :4、或SEQ ID NO. :6所示。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述元件B的編碼多核苷酸序列如SEQ ID NO. :3、或SEQ ID NO. : 5所示。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述重組病毒包膜糖蛋白選自下組：
[0023] (i)具有SEQ ID NO: 19、21所示氨基酸序列的多肽；
[0024] (ii)具有與SEQ ID NO: 19、21所示氨基酸序列彡80%同源性（優(yōu)選地，彡
[0025] 90 %的同源性；等優(yōu)選地彡95 %的同源性；最優(yōu)選地，彡97 %的同源性，
[0026] 如98%以上，99%以上）的多肽，且所述多肽具有與⑷中多肽相似的活
[0027] 性；
[0028] (iii)將（i)中任一所示氨基酸序列經(jīng)過1-5個氨基酸殘基的取代、缺失或
[0029] 添加而形成的，且保留（i)中多肽活性的衍生多肽。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述重組病毒包膜糖蛋白具有選自下組的一個或多個特性：
[0031] a)具有特異性識別細(xì)胞膜表面蛋白的活性；
[0032] b)具有促進(jìn)T細(xì)胞增殖的活性。
[0033] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸編碼本發(fā)明第 一方面所述的重組病毒包膜糖蛋白。
[0034] 本發(fā)明的第三方面，提供了一種載體，它含有本發(fā)明第二方面所述的多核苷酸。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述載體中含有編碼式I所示結(jié)構(gòu)的融合蛋白的多核苷酸序 列，
[0036] B-A (I)
[0037] 其中，
[0038] A為VSVG (水皰口炎病毒糖蛋白）蛋白元件；
[0039] B為輔助蛋白元件，并且所述輔助蛋白元件可特異性識別細(xì)胞膜表面蛋白；
[0040] 表示連接上述各元件的肽鍵或肽接頭。
[0041] 在另一優(yōu)選例中，所述元件A的氨基酸序列如SEQ ID NO. : 2所示，優(yōu)選地，所述元 件A的編碼多核苷酸序列如SEQ ID NO. : 1所示。
[0042] 在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞膜表面蛋白為表達(dá)于T細(xì)胞細(xì)胞膜表面的蛋白；優(yōu)選 地，所述細(xì)胞膜表面蛋白選自：VLA-4、VLA-5、或其組合。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，所述元件B衍生自纖連蛋白或VCAM-1。
[0044] 在另一優(yōu)選例中，所述元件B選自：FN-p及其活性片段、CSl及其活性片段、或其組 合。
[0045] 在另一優(yōu)選例中，所述元件B的氨基酸序列如SEQ ID NO. :4、或SEQ ID NO. :6所 不O
[0046] 在另一優(yōu)選例中，所述元件B的編碼多核苷酸序列如SEQ ID NO. :3、SEQ ID NO. : 5 所示。
[0047] 在另一優(yōu)選例中，所述載體為質(zhì)粒。
[0048] 在另一優(yōu)選例中，所述載體為慢病毒載體、腺病毒載體、或腺病毒相關(guān)載體。
[0049] 本發(fā)明的第四方面，提供了一種基因工程化的重組病毒，所述病毒具有本發(fā)明第 一方面所述的重組病毒包膜糖蛋白。
[0050] 在另一優(yōu)選例中，所述病毒為慢病毒、腺病毒、或腺相關(guān)病毒。
[0051] 在另一優(yōu)選例中，所述病毒的基因組中具有外源基因。
[0052] 在另一優(yōu)選例中，所述外源基因包括表達(dá)CAR(嵌合抗原受體）的外源基因。
[0053] 在另一優(yōu)選例中，所述病毒具有至少兩種權(quán)利要求1所述的重組病毒包膜糖蛋白 (優(yōu)選為具有相同的元件A和不同的元件B)。
[0054] 在另一優(yōu)選例中，所述病毒的包膜糖蛋白中具有SEQ ID NO: 19、和SEQ ID NO. :21 所示的氨基酸序列的多肽。
[0055] 本發(fā)明的第五方面，提供了一種宿主細(xì)胞，它含有本發(fā)明第三方面所述的載體或 基因組中整合有本發(fā)明第二方面所述的多核苷酸。
[0056] 在另一優(yōu)選例中，所述宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞（如CHO細(xì)胞、NSO細(xì)胞、 或293細(xì)胞）。
[0057] 本發(fā)明的第六方面，提供了一種試劑盒，所述試劑盒中包括本發(fā)明第一方面所述 的重組病毒包膜糖蛋白、本發(fā)明第二方面所述的多核苷酸、本發(fā)明第三方面所述的載體、本 發(fā)明第四方面所述的重組病毒、和/或本發(fā)明第五方面所述的宿主細(xì)胞。
[0058] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中包括編碼本發(fā)明第一方面所述的重組病毒包膜糖 蛋白的載體；和，野生型載體，所述野生型載體編碼與所述重組病毒包膜糖蛋白相對應(yīng)的野 生型病毒包膜糖蛋白或其片段。
[0059] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中包括本發(fā)明第四方面所述的重組病毒。
[0060] 本發(fā)明的第七方面，提供了本發(fā)明第一方面所述的重組病毒包膜糖蛋白、本發(fā)明 第二方面所述的多核苷酸、本發(fā)明第三方面所述的載體的用途，用于慢病毒、或腺病毒的包 裝。
[0061] 本發(fā)明的第八方面，提供了一種重組病毒的包裝方法，所述方法包括步驟：
[0062] (1)提供一包裝細(xì)胞；
[0063] (2)配制轉(zhuǎn)染體系，所述轉(zhuǎn)染體系中包括表達(dá)本發(fā)明第一方面所述的重組病毒包 月吳糖蛋白的載體；和
[0064] (3)轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞，進(jìn)行病毒包裝。
[0065] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（2)中，所述轉(zhuǎn)染體系包括至少兩種表達(dá)不同的重組 病毒包膜糖蛋白的重組型載體；優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)染體系中還包括野生型載體，所述野生型載 體編碼與所述重組病毒包膜糖蛋白相對應(yīng)的野生型病毒包膜糖蛋白或其片段。
[0066] 在另一優(yōu)選例中，所述重組型載體為FN-p-VSVG，和/或CSl-VSVG ;所述野生型載 體為野生型載體H2。
[0067] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（2)所述轉(zhuǎn)染體系中包括重組型載體
[0068] FN-p-VSVG，和CSl-VSVG ;以及野生型載體H2 ;優(yōu)選地，所述重組型載體
[0069] (FN-p-VSVG和CSl-VSVG之和）與所述野生型載體的數(shù)量比為7 :3-6。
[0070] 在另一優(yōu)選例中，所述重組型載體中FN-p-VSVG !CSl-VSVG為1 :1。
[0071] 在另一優(yōu)選例中，所述包裝細(xì)胞為HEK-293T細(xì)胞。
[0072] 本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明第四方面所述的重組病毒的用途，用于制備生 產(chǎn)CAR-T細(xì)胞的試劑。
[0073] 本發(fā)明的第十方面，提供了一種制劑，所述制劑含有本發(fā)明第四方面所述的重組 病毒和任選的賦形劑。
[0074] 在另一優(yōu)選例中，所述的制劑為藥物制劑。
[0075] 在另一優(yōu)選例中，所述的賦形劑為藥學(xué)上可接受的賦形劑。
[0076] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0077] 圖1顯示了野生型H2質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖譜。
[0078] 圖2顯示了經(jīng)重組的FN-p - VSVG質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖譜。
[0079] 圖3顯示了經(jīng)重組的CSl-VSVG質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖譜。
[0080] 圖4中A圖顯示了轉(zhuǎn)染體系中不同類型H2質(zhì)粒配比對病毒產(chǎn)量的影響，B圖顯示 了成功表達(dá)的病毒顆粒的免疫印跡檢測結(jié)果。
[0081] 圖5顯示了本發(fā)明中經(jīng)改造的慢病毒對T細(xì)胞的感染效率的檢測結(jié)果。
[0082] 圖6顯示了本發(fā)明中經(jīng)改造的慢病毒能夠顯著的促進(jìn)T細(xì)胞擴(kuò)增。
[0083] 圖7顯示了本發(fā)明中經(jīng)改造的慢病毒對不同類型的細(xì)胞均表現(xiàn)出了較高的感染 效率效率。
【具體實施方式】
[0084] 本發(fā)明人通過廣泛而深入的研宄，獲得一種能夠高效轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞的技術(shù)， 實驗結(jié)果表明，該技術(shù)能夠提高病毒感染效率達(dá)30-70%，而且發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，使用本 發(fā)明的技術(shù)方案還能夠有效刺激T細(xì)胞的增殖，進(jìn)而簡化CAR-T細(xì)胞治療的流程，降低成 本。
[0085] 在描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所述的具體方法和實驗條件，因為這 類方法和條件可以變動。還應(yīng)當(dāng)理解本文所用的術(shù)語其目的僅在于描述具體實施方案，并 且不意圖是限制性的，本發(fā)明的范圍將僅由所附的權(quán)利要求書限制。
[0086] 除非另外定義，否則本文中所用的全部技術(shù)與科學(xué)術(shù)語均具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域 的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。如本文所用，在提到具體列舉的數(shù)值中使用時，術(shù)語 "約"意指該值可以從列舉的值變動不多于1%。例如，如本文所用，表述"約100"包括99 和101和之間的全部值（例如，99. 1、99· 2、99· 3、99· 4等）。
[0087] 雖然在本發(fā)明的實施或測試中可以使用與本發(fā)明中所述相似或等價的任何方法 和材料，本文在此處例舉優(yōu)選的方法和材料。
[0088] 具體地，本發(fā)明涉及一種新型的慢病毒包膜質(zhì)粒，可應(yīng)用于慢病毒的包裝及哺乳 動物細(xì)胞的感染實驗，包括CAR-T細(xì)胞治療T細(xì)胞活化及感染實驗。目前常規(guī)實驗所使用 的慢病毒都是使用VSVG作為包膜糖蛋白的，但是該型包膜糖蛋白的慢病毒在感染一些難 感染的哺乳動物細(xì)胞時，效率較低。本發(fā)明中通過重組人纖連蛋白的細(xì)胞結(jié)合域或CSl功 能域，與VSVG融合表達(dá)，從而使新型的慢病毒獲得特異性靶向VLA-5、VLA-4抗原的能力，進(jìn) 一步提高病毒感染效率。同時，重組的纖連蛋白還能刺激T淋巴細(xì)胞的增殖。在CAR-T細(xì) 胞治療T細(xì)胞活化階段，使用該新型慢病毒可在活化T細(xì)胞的同時即轉(zhuǎn)入外源基因，簡化實 驗流程，降低成本。而普通的慢病毒并無此功能。
[0089] 將纖連蛋白的細(xì)胞識別域與CSl功能域分別與慢病毒的包膜質(zhì)粒H2的VSVG基因 融合表達(dá)，與載體質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒Hl共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，從而得到可靶向細(xì)胞表面的VLA-4、 VLA-5抗原的新型慢病毒顆粒。與傳統(tǒng)方法相比，可極大提高慢病毒感染哺乳動物細(xì)胞的效 率（可達(dá)30-70% )，此外還能促使T淋巴細(xì)胞成千上萬倍的增殖。
[0090] VSVG
[0091] 在本發(fā)明中，術(shù)語VSVG指水皰性口炎病毒糖蛋白，在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方 式中，所述VSVG的氨基酸序列如下：
[0092] MKCLLYLAFLFIGVNCKFTIVFPHNQKGNffKNVPSNYHYCPSSSDLNffHNDLIGTALQVKMPKSHKAIQ ADG