一種溶血素融合蛋白PeLa-EK-10His-SLO及其表達(dá)質(zhì)粒與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種溶血素融合蛋白PeLa-EK-IOHis-SLO及其表達(dá)質(zhì)粒與應(yīng)用，屬于 醫(yī)學(xué)微生物或生物制藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 化膿鏈球菌是一類常見的細(xì)菌，可引起皮膚、皮下組織的化膿性炎癥、呼吸道感 染、流行性咽炎的爆發(fā)性流行以及新生兒敗血癥、細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、猩紅熱和風(fēng)濕熱、腎小 球腎炎等變態(tài)反應(yīng)。
[0003] 化膿鏈球菌的溶血素（Str印tolysin 0, SL0)能夠與人及其它動(dòng)物的細(xì)胞膜上 的膽固醇相結(jié)合，結(jié)合到細(xì)胞膜上的SLO蛋白會(huì)形成環(huán)狀寡聚體，形成大的孔道，導(dǎo)致細(xì) 胞膜溶解，另外，SLO具有極強(qiáng)的抗原性且易在體內(nèi)殘留，刺激人體及其它動(dòng)物產(chǎn)生抗體 (anti-SLO, AS0)，ASO集聚，導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)。
[0004] SLO作為檢測(cè)試劑，可以用來檢測(cè)患者體內(nèi)的ASO ;其次，可以作為治療腫瘤和殺 死腫瘤細(xì)胞的藥物，另外，SLO作為成孔蛋白，在動(dòng)物基因工程和蛋白工程領(lǐng)域，用作動(dòng)物細(xì) 胞轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)蛋白工具。
[0005] 目前SLO蛋白的基因工程重組技術(shù)主要存在以下缺陷：SLO蛋白對(duì)宿主具有毒性， 表達(dá)量低和生產(chǎn)過程中SLO檢測(cè)方法相對(duì)繁瑣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對(duì)SLO重組蛋白對(duì)宿主具有毒性，表達(dá)量低和SLO蛋白檢測(cè)相對(duì)繁瑣的 問題，提供了一種溶血素融合蛋白PeLa-EK-IOHis-SLO及其表達(dá)質(zhì)粒與應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供了 一種溶血素融合蛋白（PeLa-EK-IOHi s-SLO， PEHSL0)，該溶血素融合蛋白PEHSLO具有果膠酸裂解酶和溶血素蛋白活性；PHlSLO內(nèi)部有 腸激酶的酶切位點(diǎn)，可以根據(jù)需要切除果膠酸裂解酶；另外，還含有10個(gè)組氨基酸序列，為 蛋白純化提供有效的親和基團(tuán)。
[0008] 所述溶血素融合蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO. 1所示的序列。
[0009] 編碼所述溶血素融合蛋白的溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo,可在大腸桿菌 中高效表達(dá)溶血素融合蛋白PEHSL0。
[0010] 所述溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo的核苷酸序列，在本發(fā)明的一種實(shí)施 方式中，如SEQ ID NO. 2所示。
[0011] 所述npela-ek-10his-slo的核苷酸序列，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，使用了曲 霉果膠酸裂解酶酶活性區(qū)Pela序列、大腸桿菌腸激酶位點(diǎn)序列、10個(gè)組氨基酸和化膿鏈球 菌溶血素 slo活性區(qū)與抗原區(qū)序列。而且曲霉果膠酸裂解酶酶活性區(qū)pela序列和化膿鏈 球菌溶血素 slo活性區(qū)與抗原區(qū)序列，依據(jù)大腸桿菌背景下的密碼子優(yōu)化和增加蛋白表明 基團(tuán)親水性等原理，進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì)。
[0012] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種表達(dá)所述溶血素融合蛋白PEHSLO或使用所述 npela-ek-10his-slo融合基因構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒。
[0013] 所述質(zhì)粒，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，為npela-ek-10his-sl〇-pET_28a(+)，其 核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0014] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種表達(dá)所述溶血素融合蛋白PEHSLO的基因工程菌 或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
[0015] 所述基因工程菌，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，以大腸桿菌BL21(DE3)為 宿主，pET-28a⑴為載體，表達(dá)核苷酸序列為SEQ ID NO. 2的溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo〇
[0016] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種檢測(cè)溶血素 SLO的方法，所述方法是融合表達(dá)果 膠酸裂解酶和溶血素蛋白，通過檢測(cè)果膠酶活性定性和定量分析溶血素 SL0。所述融合表達(dá) 是融合表達(dá)編碼氨基酸序列為SEQ ID NO. 1所示的基因。
[0017] 本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種提高SLO可溶性表達(dá)的方法。所述方法是以大腸 桿菌BL21(DE3)為宿主，pET-28a(+)為載體，表達(dá)核苷酸序列為SEQ ID NO. 2的溶血素融 合基因 npela-ek-10his-slo。
[0018] 本發(fā)明還要求保護(hù)所述溶血素融合蛋白PEHSLO在SLO蛋白生產(chǎn)、SLO檢測(cè)、SLO抗 體制品制備、抗癌藥物生產(chǎn)、基因工程或蛋白工程等領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明的有益效果：
[0020] (1)本發(fā)明設(shè)計(jì)并合成了溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo,構(gòu)建了含該 npela-ek-lOhis-slo融合基因的表達(dá)質(zhì)粒和含該表達(dá)質(zhì)粒的工程菌，該工程菌可以表達(dá)溶 血素融合蛋白（PeLa-EK-10His-SL0，PEHSL0)。搖瓶發(fā)酵表達(dá)結(jié)果表明，溶血素融合蛋白 PEHSLO對(duì)宿主細(xì)胞毒性低，20°C條件下表達(dá)48h后，npela-ek-10his-slo工程菌0D600可 以達(dá)到2. 5,高于slo獨(dú)立表達(dá)的工程菌（0D600 :1.60);說明融合表達(dá)可以降低SLO蛋白對(duì) 宿主具有毒性。
[0021] (2)本發(fā)明的工程菌表達(dá)的溶血素融合蛋白PEHSLO同時(shí)具有果膠酶活性、溶血性 和SLO抗原性；該工程菌果膠酶產(chǎn)率為5. 6Unit/mL培養(yǎng)液，溶血酶產(chǎn)率為400000Unit/mL， 可溶性溶血素融合蛋白PEHSLO產(chǎn)率為I. 2mg/mL培養(yǎng)液，占到細(xì)胞總蛋白的30 %，相比slo 胞內(nèi)獨(dú)立表達(dá)（可溶性目標(biāo)蛋白占胞內(nèi)蛋白的5% )，可溶性目標(biāo)蛋白產(chǎn)量上升達(dá)400% ; 說明融合表達(dá)可以提尚SLO蛋白的表達(dá)量。
[0022] (3)在生產(chǎn)監(jiān)控檢測(cè)方面，溶血素融合蛋白PEHSLO可以用果膠酶活性進(jìn)行定性和 定量分析，一次果膠酶檢測(cè)所需時(shí)間為〇. 3h，檢測(cè)成本為0. 15元人民幣，避免使用免疫學(xué) (一次檢測(cè)所需時(shí)間為l〇h，檢測(cè)成本為500. 00元人民幣）和溶血法檢測(cè)（一次檢測(cè)所需 時(shí)間為I. 〇h，檢測(cè)成本為0. 50元人民幣），相對(duì)于經(jīng)測(cè)定免疫學(xué)和溶血法檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間分 別縮短9. 5h和0. 5h，檢測(cè)成本分別節(jié)省499. 85元和0. 35元人民幣，經(jīng)測(cè)定IUnit果膠酶 活性對(duì)應(yīng)于0. 2mg左右的蛋白量和7. OX IO4Unit溶血酶活性。本發(fā)明的方法可以簡便SLO 的檢測(cè)，縮短檢測(cè)時(shí)間、降低檢測(cè)成本。
【附圖說明】
[0023] 圖 1 :設(shè)計(jì)的 npela-ek-10his-sl〇-pET_28a(+)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖；
[0024] 圖 2 :npela-ek-10his-slo/pET_28a(+)酶切鑒定圖；I. DNA Marker， 2. npela-ek-10his-slo/pET_28a，3. npela-ek-10his-slo/pET_28a (+)雙酶切；
[0025] 圖 3 :重組表達(dá) Pela-EK-IOHis-SLO 的 SDS-PAGE 圖譜；1.蛋白 Marker， 2. npela-slo/pET28a(+)/BL21 (DE3)的胞內(nèi)上清，3.純化的 Pela-EK-10His-SL0。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 以下通過實(shí)施例來進(jìn)一步闡明本發(fā)明，下列實(shí)施例用于說明目的而非用于限制本 發(fā)明范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，基本上都按照常見的分子克隆手冊(cè) 所述的條件進(jìn)行操作。
[0027] 實(shí)施例1溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo設(shè)計(jì)與表達(dá)質(zhì)粒設(shè)計(jì)
[0028] 所述核苷酸序列使用了曲霉果膠酸裂解酶酶活性區(qū)pela序列、大腸桿菌腸激酶 位點(diǎn)序列、10個(gè)組氨基酸和化膿鏈球菌溶血素 Slo活性區(qū)與抗原區(qū)序列，而且曲霉果膠酸 裂解酶酶活性區(qū)pela序列和化膿鏈球菌溶血素 Sl0活性區(qū)與抗原區(qū)序列，依據(jù)大腸桿菌背 景下的密碼子優(yōu)化和增加蛋白表明基團(tuán)親水性等原理，進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì)。在果膠酸裂解酶 酶pela序列的上游添加 Noc I位點(diǎn)序列，在果膠酸裂解酶酶pela序列下游加上腸激酶序 列、10個(gè)組氨酸序列和Nde I位點(diǎn)序列；Nde I位點(diǎn)序列下游，連接slo基因序列，slo下 游加上BamH I序列，構(gòu)建的融合基因的具體核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，其氨基酸序 列如SEQ ID N0.1所示，表達(dá)質(zhì)粒npela-ek-10his-sl〇-pET-28a(+)的核苷酸序列如SEQ ID N0.3。npela-ek-10his-sl〇-pET_28a(+)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如圖 1 所不。
[0029] 本發(fā)明加入果膠酸裂解酶pela序列的目的，是利用該P(yáng)ela蛋白在大腸桿菌中可 以高效表達(dá)出活性蛋白同時(shí)對(duì)宿主毒性低的優(yōu)越性，提高SLO蛋白的可溶性，降低SLO蛋 白對(duì)宿主的毒性，同時(shí)提供一種低成本和短時(shí)間的目標(biāo)蛋白檢測(cè)方法；加腸激酶序列的作 用是可以根據(jù)應(yīng)用需要出發(fā)，提供切除果膠酸裂解酶Pela的便利；加入10個(gè)組氨酸序列， 是為了提供Ni-親和層析的親和基團(tuán)，由于是加在二個(gè)蛋白基團(tuán)之間，根據(jù)本本發(fā)明的需 要，10個(gè)組氨基，能保證有效結(jié)合，同時(shí)在40mM咪唑濃度下可以有效洗脫，不必使用常規(guī)的 500mM咪唑，可以減少成本。
[0030] 實(shí)施例2溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo中npela-ek-lOhis序列的合成與 克隆
[0031] 使用化學(xué)合成和Over-Lap PCR的方法合成血紅素融合基因 npela-ek-10his-slo 的 npela-ek-10his 部分（SEQ ID NO. 2 的 l_992bp)，合成 npela-ek-10his 片段，上游加 上Noc I位點(diǎn)，下游加上Nde I序列將合成的片段與PMD18T載體連接，轉(zhuǎn)化JM109,轉(zhuǎn) 化產(chǎn)物涂布含100g/mL氨芐青霉素的LB平板，經(jīng)過37 °C培養(yǎng)過夜，得到單克隆轉(zhuǎn)化子 npela-ek-10his/PMD18T/JM109,經(jīng)過菌落PCR鑒定，質(zhì)粒酶切鑒定和測(cè)序鑒定，測(cè)定的序 列和設(shè)計(jì)序列完全相同。
[0032] 實(shí)施例3溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo中slo序列的合成與克隆
[0033] 使用化學(xué)合成和Over-Lap PCR的方法合成血紅素融合基因 npela-ek-10his-slo 的slo部分（SEQ ID NO. 2的992-2483bp)，上游加上Nde I位點(diǎn)，下游加上BamH I序列， 將合成的slo基因與PMD18T載體連接，轉(zhuǎn)化JM109,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含100g/mL氨芐青霉素的 LB平板，經(jīng)過37°C培養(yǎng)過夜，得到單克隆轉(zhuǎn)化子slo/PMD18T/JM109,經(jīng)過菌落PCR鑒定，質(zhì) 粒酶切鑒定和測(cè)序鑒定，表明新合成的slo基因全長為1485bp，編碼495氨基酸，測(cè)定的序 列和設(shè)計(jì)序列完全相同，提取slo/PMD18T備用。
[0034] 實(shí)施例 4 npela-ek-10his-slo/pET_28a(+)表達(dá)載體構(gòu)建
[0035] 用于實(shí)現(xiàn)融合基因在大腸桿菌中表達(dá)的載體是pET_28a(+)，但對(duì)構(gòu)架有較 大改變，不使用pET-28a(+)的二個(gè)His-tag和Thrombin序列，將pET-28a(+)質(zhì)粒和 npela-ek-10his/PMD18T用Noc I和Nde I切，酶切產(chǎn)物切膠回收，再用T4連接酶連接，連 接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過37°C培養(yǎng)過夜，挑選轉(zhuǎn)化子，通過菌落PCR鑒 定，質(zhì)粒酶切鑒定（見圖2)和測(cè)序鑒定，保存鑒定的npela- ek-10hiS/pET-28a(+)E.C〇li JM109 菌，提取 npela-ek-10his/pET_28a(+)備用。將 npela-ek-10his/pET_28a(+)質(zhì)粒和 slo/PMD18T用Nde I和BamH I切，酶切產(chǎn)物切膠回收，再用T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，在100g/mL卡那霉素的LB平板，經(jīng)過37°C培養(yǎng)過夜，挑選轉(zhuǎn)化 子，通過菌