專(zhuān)利名稱(chēng)：一種橡膠樹(shù)多酚氧化酶、其編碼基因及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種橡膠樹(shù)多酚氧化酶、其編碼基因及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多酹氧化酶(Polyphenol Oxidase, PP0)是一類(lèi)廣泛分布于動(dòng)物、植物、真菌和細(xì)菌中的含銅氧化還原酶。在O2存在下，PPO可催化單酚羥基化為鄰二酚，二羥酚氧化為鄰醌。廣義的PPO包含漆酶(laccase, EC. I. 10. 3. I)、酪氨酸酶(tyrosinase,或單酹氧化酶，monophenolase, EC. I. 14. 18. I)和兒茶酌■氧化酶(catechol oxidse,或雙酌■氧化酶，o-diphenoloxidase, EC. I. 10. 3. 2)。一般所說(shuō)的PPO是指兒茶酚氧化酶和漆酶的統(tǒng)稱(chēng)。兒茶酚氧化酶是植物中主要存在的PP0，它由核基因編碼，大多植物中以多個(gè)基因家族形式存在。PPO通常以無(wú)活性的前體形式存在，該前體一般由N-端導(dǎo)肽(transit peptide)、中間高度保守的Cu結(jié)合區(qū)及C-端疏水區(qū)組成。導(dǎo)肽具有葉綠體定位蛋白的典型特征，它可引導(dǎo)PPO前體蛋白定位到葉綠體的類(lèi)囊體和其它類(lèi)型質(zhì)體的基質(zhì)中。Cu結(jié)合區(qū)是功能區(qū)，該區(qū)域6-7個(gè)高度保守的組氨酸(His)和I個(gè)半胱氨酸(Cys)殘基對(duì)于其酶活性是必需的。晶體結(jié)構(gòu)顯示，兩組His殘基(每組3-4個(gè))分別可與一個(gè)Cu以配位鍵形式相連，從而形成具有特定三維結(jié)構(gòu)(Type-3 copper bridged)的活性部位。疏水性的C-端只在前體中存在，常由幾個(gè)￠-鏈形成反向平行的￠-折疊，它可與Cu結(jié)合，可能與PPO三維結(jié)構(gòu)的形成及酶活性有關(guān)。PPO基因的表達(dá)特性比較復(fù)雜，不同家族成員在不同組織、不同發(fā)育時(shí)期及不同環(huán)境條件下呈現(xiàn)出不同表達(dá)模式，并且不同成員的底物特異性明顯不同。PPO基因可被機(jī)械損傷、病原物侵染、植食性昆蟲(chóng)取食為害、蟲(chóng)害誘導(dǎo)揮發(fā)物及茉莉酸、水楊酸等防御反應(yīng)信號(hào)分子處理誘導(dǎo)。除參與植物病原物侵染及蟲(chóng)害等防御反應(yīng)外，PPO是水果、蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品發(fā)生有害褐變的主要原因。天然橡膠(順-1，4-聚異戊二烯)是一種重要的工業(yè)原料，其主要來(lái)源為巴西橡膠樹(shù)(Hevea brasiliensis Muell. Arg.)。橡膠樹(shù)中，除膠乳中存在PPO夕卜(CoupeM, Pujarniscle S， d’ Auzac J. Compartimentation de diverses oxydo-reductases(peroxydase, o-dipheno1-oxydase et malate deshydrogenase) dans Ie latex d’Heveabrasiliensis (Kunth). Miill Arg Physiologie Vegetale, 1972, 10: 459 - 464;Wititsuwannakul D, Chareonthiphakorn N, Pace M, Wititsuwannakul R. Polyphenoloxidases from latex of Hevea brasiliensis: purification and characterization.Phytochemistry, 2002, 61 (2) : 115-121)，橡膠樹(shù)的芽、葉片、種子和懸浮細(xì)胞均具有PPO活性。據(jù)最近的報(bào)道，橡膠樹(shù)的愈傷和懸浮細(xì)胞中存在2種PPO蛋白(這里我們將其命名為HbPPOl和HbPP02)，其中HbPPOl受損傷抑制，而HbPP02則為損傷所誘導(dǎo)，這表明HbPP02可能了參與橡膠樹(shù)的防御反應(yīng)，同時(shí)也可能是造成橡膠樹(shù)組培外植體褐化的主要原因。深入研究發(fā)現(xiàn)，HbPP02的分子量約為70 kDa，酸性蛋白，最優(yōu)底物為兒茶酚(MuhamadN， Chirapongsatonkul N， Churngchow N. Defense-Related Polyphenol Oxidase fromHevea brasiliensis Cell Suspension: Purification and Characterization. ApplBiochem Biotechnol, 2012, 167(1) : 177-189)。雖然如此，然而至今還未見(jiàn)有關(guān)該酶編碼基因及其蛋白序列的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種受損傷誘導(dǎo)的橡膠樹(shù)多酚氧化酶、其編碼基因及應(yīng)用。本發(fā)明提供的多酚氧化酶，最初來(lái)自于大戟科橡膠樹(shù)屬巴西橡膠樹(shù)(Heveabrasiliensis Muell. Arg.),名稱(chēng)為 HbPP02,是如下(I)或(2)的蛋白質(zhì)(I)由序列表中SEQ ID NO: 2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，其分子量為67 kDa,等電點(diǎn)為6. 66，帶電荷數(shù)為-0.41，酸性蛋白； (2)由序列表中SEQ ID NO: 2的序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的替代和/或插入和/或缺失且具有多酚氧化酶活性的衍生蛋白質(zhì)。序列表中SEQ ID NO: 2的序列由592個(gè)氨基酸殘基組成。所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的替代和/或插入和/或缺失是指不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的替代和/或插入和/或缺失。上述(I)中的HbPP02可從巴西橡膠樹(shù)的芽、葉片、種子、愈傷及懸浮細(xì)胞等組織或細(xì)胞中分離、純化，優(yōu)先推薦采用抽濾處理后的懸浮細(xì)胞；同時(shí)也可以從利用HbPP02的編碼基因獲得的轉(zhuǎn)基因材料中分離、純化。上述(2)中的HbPP02可人工合成，也可以先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到；所述的編碼基因是指通過(guò)一個(gè)或幾個(gè)堿基的替代和/或插入和/或缺失獲得的且其編碼蛋白質(zhì)具有多酚氧化酶活性的衍生基因。所述HbPP02的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述HbPP02的編碼基因?yàn)槿缦垄?、⑵?3)的核苷酸序列(I)序列表中SEQ ID NO: I的核苷酸序列；(2)由序列表中SEQ ID NO: I的核苷酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的替代和/或插入和/或缺失而獲得且其編碼蛋白質(zhì)具有多酚氧化酶活性的衍生基因；(3)基因編碼區(qū)序列與序列表中SEQ ID NO: I的核苷酸序列的相似性在90%以上且其編碼蛋白質(zhì)具有多酚氧化酶活性的基因。 序列表中SEQ ID NO: I由1869個(gè)核苷酸組成。含有所述多酚氧化酶編碼基因的表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植株或轉(zhuǎn)基因重組菌均屬本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的HbPP02具有多酚氧化酶活性，其底物至少包括兒茶酚(catechol)和多巴胺(dopamine)，其中以兒茶酚為優(yōu)；該酶在pH 4. 0-10. 0及溫度10-60°C之間具有較高的活性，其中以pH 6. 0為優(yōu)；該酶的活性可以被0. 5 mmol/L的抗壞血酸(ascorbic acid,ASA 或維生素 C，Vitamin C，Vc) >0. 5 mmol/L 的二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)或I. 0 mmol/L的0 -巰基乙醇(0 -mercaptoethanol, ^ -ME)完全抑制；該酶至少存在于芽、葉片、種子、愈傷及懸浮細(xì)胞中，且蛋白水平至少受病原物侵染和機(jī)械損傷所誘導(dǎo)。該酶或經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的替代和/或插入和/或缺失且具有多酚氧化酶活性的衍生蛋白至少可用于食品和工業(yè)領(lǐng)域中漂白或氧化有色物質(zhì)；利用該基因的部分或全部序列反義表達(dá)至少可抑制橡膠樹(shù)組培中的褐化現(xiàn)象；利用該基因或經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的替代和/或插入和/或缺失而獲得的功能性衍生基因過(guò)量表達(dá)至少可提高橡膠樹(shù)的抗病蟲(chóng)能力。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步地說(shuō)明，但不用來(lái)限定本發(fā)明之權(quán)利范圍，因此依本發(fā)明權(quán)利要求所做的等同變化，仍屬于本發(fā)明所涵蓋的范圍。以下實(shí)施例中所述的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例I多酚氧化酶HbPP02的分離HbPP02可從芽、葉片、種子、愈傷及懸浮細(xì)胞等細(xì)胞和組織中分離，本發(fā)明優(yōu)先推 薦利用懸浮細(xì)胞，原因有二 1).懸浮細(xì)胞可通過(guò)培養(yǎng)大量獲得；2).懸浮細(xì)胞中只存在HbPP02和另一種同時(shí)也在乳管細(xì)胞中表達(dá)的多酚氧化酶，并且懸浮細(xì)胞經(jīng)過(guò)抽濾處理后HbPP02會(huì)顯著誘導(dǎo)，而另一種多酚氧化酶則基本消失。懸浮細(xì)胞可以來(lái)源于橡膠樹(shù)不同的組織，優(yōu)先推薦采用種子的內(nèi)珠被和未成熟的花藥，以內(nèi)珠被為例，其流程如下愈傷誘導(dǎo)將橡膠樹(shù)種子的內(nèi)珠被在添加3%的蔗糖、I. 0 mg/L 2，4_D(2, 4-dichlorophnoxyacetic acid, 2, 4_ 二氯苯氧乙酸)、1.0 mg/L BAP(6-benzylaminopurine, 6-芐基腺嘌呤)，pH 5. 7 的 MS 培養(yǎng)基上，25±2°C暗培養(yǎng) 6-8 周；期間可每月將材料轉(zhuǎn)移至新鮮的上述培養(yǎng)基中繼代；懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)將上述愈傷轉(zhuǎn)移到添加2.0 mg/L 2，4_D、0. I mg/L TDZ(Thidiazuron,噻苯隆)，pH 5. 7的MS培養(yǎng)基中，25°C，光周期為12/12，100 rpm培養(yǎng)；每2周按I :100的(如0. 3 g細(xì)胞轉(zhuǎn)到30 mL新鮮的懸浮培養(yǎng)液)倍數(shù)稀釋后繼代培養(yǎng)；繼代數(shù)次后，優(yōu)先推薦繼代2次，即采用28 d的懸浮細(xì)胞用于HbPP02的分離；HbPP02的分離將上述培養(yǎng)物，4°C，5000 rpm離心10 min，收集細(xì)胞；細(xì)胞在液氮存在下研磨成粉末，并按I :1的比例加入提取緩沖液(0. 2 mo I/L pH 6. 5的磷酸緩沖液，0. 25 % (v/v) Triton X-100 和 3 % (w/v) PVPP)，4°C，12，000 rpm 離心 15 min,收集沉淀即得初酶提取物；該初酶可直接應(yīng)用，也可以用于下面的純化；HbPP02的純化120 g的懸浮細(xì)胞經(jīng)上述抽提后，首先用20 mL的DEAE瓊脂糖凝膠CL 6B柱進(jìn)行純化4°C下，柱子用20 mmol/L pH 8.0的磷酸緩沖液以30 mL/h的流速平衡；上樣后，蛋白依次用添加0.05和0. I mol/L NaCl的上述緩沖液洗脫。然后，一次純化蛋白液用I mL的Con A-瓊脂糖柱進(jìn)一步純化柱子先用含有0.5 mol/L NaCl,5 mmol/LMgCl2,5 mmol/L MnCl2和5 mmol/L CaCl2的溶液平衡；裝柱后，蛋白依次用濃度分別為40、80,160,320和800 mmol/L的甲基- a -D-吡喃甘露糖苷溶液洗脫；產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，挖取含有PPO活性的帶，溶解后用20 mmol/L pH 8. 0的磷酸緩沖液透析即獲得高純度的HbPP02蛋白。實(shí)施例2多酚氧化酶HbPP02編碼基因的克隆由于橡膠樹(shù)的懸浮細(xì)胞中只有兩種多酚氧化酶，我們以其為材料進(jìn)行RNA的提取及PCR模板的制備；由于橡膠樹(shù)中至今還未見(jiàn)有關(guān)多酚氧化酶編碼基因的報(bào)道，我們根據(jù)其它物種中PPO保守的Cu結(jié)合區(qū)的序列設(shè)計(jì)兼并引物，應(yīng)用PCR技術(shù)從懸浮細(xì)胞來(lái)源的cDNA模板中成功擴(kuò)增到2條差異的基因片段；在此基礎(chǔ)上，我們利用cDNA末端的快速擴(kuò)增技術(shù)RACE成功獲得HbPP02的3’和5’序列；通過(guò)在HbPP02的3’和5’端設(shè)計(jì)引物，分別以葉片來(lái)源的基因組DNA和懸浮細(xì)胞來(lái)源的cDNA為模板，我們首次成功擴(kuò)增得到該基因的基因組及cDNA序列。具體流程如下保守片段的獲得根據(jù)其它物種中PPO保守的Cu結(jié)合區(qū)的序列設(shè)計(jì)兼并引物如下，HbPPOF: 5’ THG AYG AYC CAN CNT TYG CNY TNC C 3’ ；HbPPOR: 5’ CCN ARN GTY TTCCAD ATN GTC CAC A 3’?；蚪MDNA的提取以幼嫩的橡膠樹(shù)葉片為材料，品系優(yōu)先推薦我們橡膠研究所培育并擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的品種熱研7-33-97，方法優(yōu)先推薦文獻(xiàn)(安澤偉，黃華孫.一種提取橡膠樹(shù)葉中總DNA的方法 植物生理學(xué)通訊，2005，41(4): 513-515)中的方法。懸浮細(xì)胞總RNA的提取優(yōu)先推薦文獻(xiàn)(黃貴修，吳坤鑫，陳守才.一種改良的橡膠樹(shù)膠乳總RNA提取方法.華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，8(4) : 1_4)中的方法。
mRNA 的分離純化優(yōu)先推薦 PolyATtract mRNA isolation System III withMagnetic Stand (Promega),具體操作詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。cDNA第一條鏈的合成優(yōu)先推薦PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)，具體操作詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。以合成的cDNA為模板，采用兼并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下lyL模板cDNA, 5 u L 10XPCR buffer, 4. 5 u L 25 mmol/L MgS04，4.5 u L 2mmol/L dNTP,0. 2 u L25 u mol/L HbPP0F,0. 2 u L 25 uM HbPPOR, I. 0 u L I u/u L LA Taq (TaKaRa)JpddH2O至50 y L ;優(yōu)先推薦用Eppendorf 5331 PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件如下94°C預(yù)變性 3 min，然后94°C 30s,55°C 30 s，65°C 30 s，25個(gè)循環(huán)，再68°C延伸 5 min。吸取 2. 5 u LPCR產(chǎn)物與2. 5 ii L溴酚藍(lán)混勻后用I. 5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后，經(jīng)溴化乙錠(EB)染色，發(fā)現(xiàn)500 bp處有明亮的清晰條帶，挖膠回收后克隆到TA載體，膠回收優(yōu)先推薦MinEluteGel Extraction Kit (Qiagen), TA 載體優(yōu)先推薦 pMD 20-T (TaKaRa),經(jīng)藍(lán)白斑篩選和菌落PCR驗(yàn)證后委托北京三博遠(yuǎn)志生物有限責(zé)任公司進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果表明獲得2條近466 bp的差異的基因片段，其中一條與前期在膠乳中克隆到的HbPPOl序列一致，對(duì)應(yīng)于懸浮細(xì)胞中受機(jī)械損傷抑制的ffiPPOl ;另一條為未知序列，命名為HbPP02，推測(cè)對(duì)應(yīng)于對(duì)應(yīng)于懸浮細(xì)胞中受機(jī)械損傷誘導(dǎo)的HbPP02。HbPP02 5’及3’端序列的克隆根據(jù)上述獲得的保守序列分別設(shè)計(jì)3’ RACE外側(cè)引物 HbPP02Fl (5，TGC GAT TGC CAG CTC TAT ATG C 3’)和 3’ RACE 內(nèi)側(cè)引物 HbPP02F2(5，AGC TCA ACT ATC TAG CAA TCT TAC C 3’)以及 5’ RACE 外側(cè)引物 HbPP02Rl (5，TTCGAT CAA CGT TAG AGT GAT GAG 3’)和 5’ RACE 內(nèi)側(cè)引物 HbPP02R2 (5，ATG TTC TCA ATAGAA CCA GCA CC 3’)，RACE 試劑盒優(yōu)先推薦 5’-Full RACE Kit 和 3’-Full RACE CoreSet Ver. 2. 0 (TaKaRa)，具體操作詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)，PCR反應(yīng)、產(chǎn)物克隆及測(cè)序與上述保守序列的獲得類(lèi)似。這樣，通過(guò)5’ RACE我們獲得一條近I kb的序列，通過(guò)3’ RACE我們也獲得一條近I kb ;通過(guò)拼接，我們得到一條1869 bp、包含完整讀碼框(長(zhǎng)1779 bp)的核苷酸序列。HbPP02全長(zhǎng)cDNA及基因序列的克隆根據(jù)上述拼接得到的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物HbPP02F (5，AAC CAA ATC ATG GGT TCT TTT TGT CCT TC 3，)和HbPP02R (5，TGC TCA AGATCA TCA ATC TTG CAC AAA G 3，)，分別以基因組DNA和合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)、產(chǎn)物克隆及測(cè)序與上述保守序列的獲得類(lèi)似。這樣，我們從基因組DNA和合成的cDNA模板都得到I條1800 bp的核苷酸序列，兩條序列一致，這表明該基因無(wú)內(nèi)含子，正式將其命名為HbPP02。HbPP02基因與懸浮細(xì)胞來(lái)源HbPP02蛋白的對(duì)應(yīng)關(guān)系的進(jìn)一步證實(shí)雖然我們通過(guò)采用特異的材料一懸浮細(xì)胞分離ffiPP02基因和HbPP02蛋白，并通過(guò)測(cè)定分子量和等電點(diǎn)初步證實(shí)HbPP02 基因就是懸浮細(xì)胞來(lái)源的酸性PPO蛋白的編碼基因，但我們還是很難排除橡膠樹(shù)中還存在與ffiPP02高度同源的蛋白質(zhì)。為此，我們充分利用了我所測(cè)定的橡膠樹(shù)的基因組序列(未公布)，通過(guò)基因組范圍內(nèi)的搜索，我們找到5個(gè)其預(yù)測(cè)的編碼蛋白中包含Tyrosinase [pfam00264]結(jié)構(gòu)域的基因序列，而這些基因中僅有一個(gè)基因編碼一酸性蛋白，其序列與ffiPP02基因一致。這樣，我們正式確認(rèn)上述分離的HbPP02基因就是上述HbPP02蛋白的編碼基因。
權(quán)利要求
1.一種橡膠樹(shù)多酚氧化酶，其特征在于是如下(I)或(2)的蛋白質(zhì) (1)由序列表中SEQID NO: 2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，其分子量為67 kDa，等電點(diǎn)為6. 66，帶電荷數(shù)為-0.41，酸性蛋白； (2)由序列表中SEQID NO: 2的序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的替代和/或插入和/或缺失且具有多酚氧化酶活性的衍生蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求I所述橡膠樹(shù)多酚氧化酶的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因?yàn)槿缦?1)、(2)或(3)的核苷酸序列(1)序列表中SEQID NO: I的核苷酸序列； (2)由序列表中SEQID NO: I的核苷酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的替代和/或插入和/或缺失而獲得且其編碼蛋白質(zhì)具有多酚氧化酶活性的衍生基因； (3)基因編碼區(qū)序列與序列表中SEQID NO: I的核苷酸序列的相似性在90%以上且其編碼蛋白質(zhì)具有多酚氧化酶活性的基因。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植株或轉(zhuǎn)基因重組菌。
5.權(quán)利要求2或3所述編碼基因的部分或全部序列在愈傷組織中的反義表達(dá)在抑制橡膠樹(shù)組培中的褐化現(xiàn)象方面的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求2或3所述編碼基因的過(guò)量表達(dá)在提高橡膠樹(shù)的抗病蟲(chóng)能力方面的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求I所述的橡膠樹(shù)多酚氧化酶在漂白或氧化有色物質(zhì)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種橡膠樹(shù)多酚氧化酶、其編碼基因及應(yīng)用。該基因無(wú)內(nèi)含子，其cDNA序列長(zhǎng)度約為1869 bp，具有序列表中SEQ ID NO: 1的序列，命名為HbPPO2。HbPPO2編碼592個(gè)氨基酸，具有序列表中SEQ ID NO: 2的序列，其分子量為67 kDa，等電點(diǎn)為6.66，帶電荷數(shù)為-0.41，酸性蛋白；該酶至少存在于芽、葉片、種子、愈傷及懸浮細(xì)胞中，且蛋白水平至少受病原物侵染和機(jī)械損傷所誘導(dǎo)。該酶或其衍生蛋白至少可用于食品和工業(yè)領(lǐng)域中漂白或氧化有色物質(zhì)；利用該基因的部分或全部序列反義表達(dá)至少可抑制橡膠樹(shù)組培中的褐化現(xiàn)象；利用該基因所獲得的功能性衍生基因過(guò)量表達(dá)至少可提高橡膠樹(shù)的抗病蟲(chóng)能力。
文檔編號(hào)C12N9/02GK102747051SQ201210218230
公開(kāi)日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月28日
發(fā)明者楊禮富, 王真輝, 袁坤, 鄒智 申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所