專利名稱：采用重組微生物的聚乳酸的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用重組微生物的聚乳酸的制造方法。
背景技術(shù)：
從地球環(huán)境問題的觀點來看，作為自然界中容易被分解的生物降解性塑料，以及作為可以由糖或植物油等可再生的碳資源合成的“綠色”塑料，生物來源的聚酯備受關(guān)注。 這其中，聚乳酸，由于成本較為低廉，融點也具有170°C以上這樣充分的耐熱性，可以熔融成型，因此可以期待其是實用上優(yōu)良的生物降解性聚合物。然而，以往，如特開2004-204464中所示，經(jīng)過中和微生物生產(chǎn)的乳酸，并進行純化的工序，在形成二聚物的環(huán)狀化合物(丙交酯(Iactide))之后聚合，從而生產(chǎn)聚乳酸，因此存在成本增高的問題。迄今為止，報道了許多具有以糖作為碳源來生產(chǎn)聚酯能力的微生物(非專利文獻 1)。微生物生產(chǎn)的生物降解性塑料的代表例是以3-羥基丁酸(3HB)作為單體的聚-3-羥基丁酸(polyhydoroxybutylatelHB)。PHB是具有熔解溫度為180°C左右的熱可塑性高分子，除了生物降解性之外，它還具有熔融加工性優(yōu)異這樣的優(yōu)點。另一方面，由于PHB的結(jié)晶性高，因而又硬又脆，即存在耐沖擊性差這種物性上的問題。作為解決PHB物性上問題的一種方法，人們在開發(fā)使用微生物制造由3HB與其它羥基鏈烷酸構(gòu)成的共聚酯的方法。例如，專利文獻1中公開了由3HB與3-羥基吉草酸(3HV)構(gòu)成的共聚物的制造方法。而且，專利文獻2中公開了通過使甲基桿菌屬(MethylcAacterium sp.)、副球菌屬 (Paracoccus sp.)、產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes sp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)的微生物與碳原子數(shù)為3至7的伯醇接觸，生產(chǎn)3HB與3HV的共聚物的方法。經(jīng)確認，這種3HB和3HV的共聚物與PHB相比，富有柔軟性，而且共聚酯中3HV含有率如果增加，柔軟性就提高。在使用上述微生物的3HB和3HV的共聚物的制造法中，例如在前述專利文獻1中，通過在培養(yǎng)基中添加丙酸，以及在專利文獻3中，通過在培養(yǎng)基中添加丙烷-1-醇，從而控制共聚酯中3HV的含有率。3HB和3-羥基已酸(以下，簡稱為3HH)這兩種成分的共聚酯P (3HB-CO-3HH)及其制造方法也分別記載于例如專利文獻4和專利文獻5中。這些公報的P(3HB-co-3HH)共聚物的制造方法采用從土壤中分離的豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)，由油酸等脂肪酸或橄欖油等油脂，發(fā)酵生產(chǎn)。而且，還有克隆該豚鼠氣單胞菌的PHA合酶基因，將該基因?qū)氲礁谎醍a(chǎn)堿菌(Alcaligenes eutrophus)中，使用這種重組菌株，以脂肪酸作為碳源，生產(chǎn) P(3HB-co-3HH)的報道(專利文獻6)。此外，上述的共聚酯的使用微生物的制造法中，無論何種情況下，都需要使用作為具有直接合成聚合物活性的酶蛋白質(zhì)的多羥基鏈烷酸合成酶，但人們也在嘗試改變這種合成酶，調(diào)節(jié)單體單元的摩爾分率。例如，專利文獻7公開了通過改變被鑒定為假單胞菌屬 (Pseudomonas sp. )61-3的微生物的多羥基鏈烷酸合成酶的氨基酸序列，生產(chǎn)3HB含有率高的PHB的變異酶。另一方面，人們期待以3-羥基鏈烷酸以外的成分作為單體單元的共聚酯具有與上述共聚酯不同的物性。專利文獻8公開了，作為這種含有3-羥基鏈烷酸以外的單體單元的共聚酯的例子，在培養(yǎng)基中添加乳酸，并同時培養(yǎng)整合了編碼丙酸梭菌(Clostridium propionicum)的丙酰CoA轉(zhuǎn)移酶的核酸的富養(yǎng)羅爾斯通氏菌(Ralstonia eutropha、舊名富氧產(chǎn)堿菌(Alcaligenes eutrophus))，制造由3HB和乳酸(LA)構(gòu)成的共聚酯的方法。而且，同篇文獻中還公開了通過在培養(yǎng)基中添加乳酸和癸烯酸，同時培養(yǎng)整合了編碼丙酸梭菌來源的丙酰CoA轉(zhuǎn)移酶的核酸和編碼假單胞菌屬61-3來源的多羥基鏈烷酸合成酶的核酸的大腸桿菌，制造由3-羥基己酸酯、3-羥基辛酸酯、3-羥基癸酸酯和乳酸構(gòu)成的共聚物的方法。以上是以3-羥基鏈烷酸作為單體單元的共聚酯、以3-羥基鏈烷酸以外的成分作為單體單元的共聚酯，以及使用微生物的它們的制造方法。但是，沒有關(guān)于以糖作為原料，通過微生物發(fā)酵，有效生產(chǎn)聚乳酸的方法的報道。非專利文獻1 《生物降解性塑料手冊》、生物降解性塑料研究會編、1995年、第 178-197頁、(株)工3 歹4一 工ζ發(fā)行)專利文獻1 特開昭57-150393號公報專利文獻2 特開平5-74492號公報專利文獻3 特公平7-79705號公報專利文獻4 特開平5-93049號公報專利文獻5 特開平7165065號公報專利文獻6 特開平10-108682號公報專利文獻7 國際公開公報W02003/100055專利文獻8 國際公開公報W02006/U679
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供通過以糖作為原料的微生物發(fā)酵來有效生產(chǎn)聚乳酸的方法。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)入了編碼前述專利文獻7中所述的多羥基鏈烷酸合成酶的變異體的核酸的重組微生物能夠有效地由糖直接制造聚乳酸，從而完成了下述各發(fā)明。(1)聚乳酸的制造方法，包括在含有碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組微生物的工序1)， 和從工序1)的培養(yǎng)物回收所述聚乳酸的工序2)；所述重組微生物具有對CoA轉(zhuǎn)移到丙酸和/或乳酸的反應(yīng)進行催化的蛋白質(zhì)，和由下述的a)或b)的氨基酸序列構(gòu)成的對多羥基鏈烷酸的合成反應(yīng)進行催化的蛋白質(zhì)a)序列號2所示的氨基酸序列的第130位、第325位、第477位和第481位的氨基酸中的至少1個以上被取代為其它氨基酸的氨基酸序列，b)在a)中規(guī)定的蛋白質(zhì)中，還有第130位、第325位、第477位和第481位以外的 1個或多個氨基酸缺失或被取代，或者插入了 1個或多個氨基酸殘基的氨基酸序列。(2)根據(jù)(1)中所述的制造方法，所述對CoA轉(zhuǎn)移到丙酸和/或乳酸的反應(yīng)進行催化的蛋白質(zhì)的氨基酸序列是序列號4所示的氨基酸序列、或序列號4所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了 1個或多個氨基酸的氨基酸序列。(3)根據(jù)(1)中所述的制造方法，所述對CoA轉(zhuǎn)移到丙酸和/或乳酸的反應(yīng)進行催化的蛋白質(zhì)的氨基酸序列是序列號6所示的氨基酸序列、或序列號6所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了 1個或多個氨基酸的氨基酸序列。(4)根據(jù)(1)中所述的制造方法，所述對多羥基鏈烷酸的合成反應(yīng)進行催化的蛋白質(zhì)的氨基酸序列是序列號2所示的氨基酸序列的第325位和第481位的氨基酸分別被取代為其它氨基酸的氨基酸序列。(5)根據(jù)(1)中所述的制造方法，所述對多羥基鏈烷酸的合成反應(yīng)進行催化的蛋白質(zhì)的氨基酸序列是序列號2所示的氨基酸序列的第325位的Ser被取代為Thr、第481位的Gln被取代為Lys的氨基酸序列。(6)根據(jù)(1)中所述的制造方法，前述蛋白質(zhì)都是由導(dǎo)入到微生物中的重組表達載體編碼的蛋白質(zhì)。(7)重組微生物，具有對CoA轉(zhuǎn)移到丙酸和/或乳酸的反應(yīng)進行催化的蛋白質(zhì)，和由下述的a)或b)的氨基酸序列構(gòu)成的對多羥基鏈烷酸的合成反應(yīng)進行催化的蛋白質(zhì)的a)序列號2所示的氨基酸序列的第130位、第325位、第477位和第481位的氨基酸中的至少1個以上被取代為其它氨基酸的氨基酸序列b)在a)中規(guī)定的蛋白質(zhì)中，還有第130位、第325位、第477位和第481位以外的 1個或多個氨基酸被缺失或取代，或者還插入了 1個或多個氨基酸殘基的氨基酸序列。(8)根據(jù)(7)中所述的重組微生物，所述對CoA轉(zhuǎn)移到丙酸和/或乳酸的反應(yīng)進行催化的蛋白質(zhì)的氨基酸序列是序列號4所示的氨基酸序列、或序列號4所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了 1個或多個氨基酸的氨基酸序列。(9)根據(jù)(7)中所述的重組微生物，所述對CoA轉(zhuǎn)移到丙酸和/或乳酸的反應(yīng)進行催化的蛋白質(zhì)的氨基酸序列是序列號6所示的氨基酸序列、或序列號6所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了 1個或多個氨基酸的氨基酸序列。(10)根據(jù)(7)中所述的重組微生物，所述對多羥基鏈烷酸的合成反應(yīng)進行催化的蛋白質(zhì)的氨基酸序列是序列號2所示的氨基酸序列的第325位和第481位的氨基酸分別被取代為其它氨基酸的氨基酸序列。(11)根據(jù)(7)中所述的重組微生物，所述對多羥基鏈烷酸的合成反應(yīng)進行催化的蛋白質(zhì)的氨基酸序列是序列號2所示的氨基酸序列的第325位的Ser被取代為Thr、第481 位的Gln被取代為Lys的氨基酸序列。(12)根據(jù)(7)中所述的重組微生物，其特征在于導(dǎo)入了具有編碼前述蛋白質(zhì)的基因的重組表達載體。本說明書包括作為本申請的優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本專利申請?zhí)?008-276185號的說明書和/或附圖中記載的內(nèi)容。本發(fā)明的制造方法能夠以便宜的碳源作為原料，有效地制造聚乳酸，可以降低生物降解性塑料的制造成本。


[圖1]是表示重組質(zhì)粒pTV118NPCTCl(ST/QK)的構(gòu)成的概要圖。圖中phaCl (ST/QK)表示STQK基因，PCT表示埃氏巨球形菌(Melsdenii)來源的PCT基因，Pre表示富養(yǎng)羅爾斯通氏菌(R. eutropha)來源的啟動子，Plac表示大腸桿菌乳糖操縱子啟動子。[圖2]實施例中制備的聚合物的分子量分布曲線。[圖3A]是表示使用含有埃氏巨球形菌來源的PCT基因和phaCl(ST/QK)基因的重組質(zhì)粒PTV118NPCTC1 (ST/QK)制備的聚合物的GC/MS分析結(jié)果的表圖。[圖3B]是表示使用含有埃氏巨球形菌來源的PCT基因和phaCl(WT)基因的重組質(zhì)粒pTV118NPCTCl (WT)制備的聚合物的GC/MS分析結(jié)果的表圖。[圖3C]是表示使用PLA標準品(MW20000)制備的聚合物的GC/MS分析結(jié)果的表圖。[圖3D]是表示使用含有埃氏巨球形菌來源的PCT基因或丙酸梭菌來源的PCT基因和phaCl (ST/QK)基因的重組質(zhì)粒pTV118NPCTCl (ST/QK)制備的聚合物的GC/MS分析結(jié)果的表圖。[圖4]是表示實施例中制備的聚合物的1H-NMR光譜分析結(jié)果的表圖。[圖5]是表示重組質(zhì)粒pTV118NPCTCl(WT)構(gòu)成的概要圖。圖中，phaCl (WT)表示假單胞菌sp. 61-3來源的多羥基鏈烷酸合成酶基因(野生型)，PCT表示埃氏巨球形菌來源的PCT基因，PRe表示富氧產(chǎn)堿菌來源的啟動子，Plac表示乳糖操縱子啟動子。[圖6]是經(jīng)時表示由于PCT基因的差異導(dǎo)致的乳?；鵆oA產(chǎn)量的差異的圖。[圖7]是表示埃氏巨球形菌來源的PCT基因與丙酸梭菌來源的PCT基因的聚乳酸生產(chǎn)性的比較的圖。
具體實施例方式本發(fā)明是聚乳酸的制造方法，包括在含有碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組微生物的工序1)，和從工序1)的培養(yǎng)物回收所述聚乳酸的工序2)；所述重組微生物具有對CoA轉(zhuǎn)移到丙酸和/或乳酸的反應(yīng)進行催化的蛋白質(zhì)，和由下述的a)或b)的氨基酸序列構(gòu)成的對多羥基鏈烷酸的合成反應(yīng)進行催化的蛋白質(zhì)a)序列號2所示的氨基酸序列的第130位、第325位、第477位和第481位的氨基酸中的至少1個以上被取代為其它氨基酸的氨基酸序列，b)在a)中規(guī)定的蛋白質(zhì)中，還有第130位、第325位、第477位和第481位以外的 1個或多個氨基酸缺失或被取代，或者插入了 1個或多個氨基酸殘基的氨基酸序列。以下，就本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)、重組微生物、和本發(fā)明的制造方法的各個條件進行說明。1)對CoA轉(zhuǎn)移到丙酸和/或乳酸的反應(yīng)進行催化的蛋白質(zhì)本發(fā)明中使用的“對CoA轉(zhuǎn)移到丙酸和/或乳酸的反應(yīng)進行催化的蛋白質(zhì)”，是具有催化CoA由適當?shù)腃oA底物轉(zhuǎn)移到丙酸和/或LA上的反應(yīng)的活性的蛋白質(zhì)。具有這種活性的蛋白質(zhì)一般被稱為丙酰CoA轉(zhuǎn)移酶(PropionylCoA "TransferashPCT)。以下，本發(fā)明中，將該蛋白質(zhì)表示為PCT。表1中示出了迄今為止已報道的PCT來源的(微生物名)的代表例以及編碼它們的堿基序列信息的文獻信息。[表1]
權(quán)利要求
1.聚乳酸的制造方法，包括在含有碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組微生物的工序1)，和從工序1)的培養(yǎng)物回收所述聚乳酸的工序2)；所述重組微生物具有對CoA轉(zhuǎn)移到丙酸和/或乳酸的反應(yīng)進行催化的蛋白質(zhì)，和由下述的a)或b)的氨基酸序列構(gòu)成的對多羥基鏈烷酸的合成反應(yīng)進行催化的蛋白質(zhì)a)序列號2所示的氨基酸序列的第130位、第325位、第477位和第481位的氨基酸中的至少1個以上被取代為其它氨基酸的氨基酸序列，b)在a)中規(guī)定的蛋白質(zhì)中，還有第130位、第325位、第477位和第481位以外的1個或多個氨基酸缺失或被取代，或者插入了 1個或多個氨基酸殘基的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制造方法，所述對CoA轉(zhuǎn)移到丙酸和/或乳酸的反應(yīng)進行催化的蛋白質(zhì)的氨基酸序列是序列號4所示的氨基酸序列，或序列號4所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了 1個或多個氨基酸的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制造方法，所述對CoA轉(zhuǎn)移到丙酸和/或乳酸的反應(yīng)進行催化的蛋白質(zhì)的氨基酸序列是序列號6所示的氨基酸序列，或序列號6所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了 1個或多個氨基酸的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制造方法，對多羥基鏈烷酸的合成反應(yīng)進行催化的蛋白質(zhì)的氨基酸序列是序列號2所示的氨基酸序列的第325位和第481位的氨基酸分別被取代為其它氨基酸的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制造方法，對多羥基鏈烷酸的合成反應(yīng)進行催化的蛋白質(zhì)的氨基酸序列是序列號2所示的氨基酸序列的第325位的Ser被取代為Thr、第481位的Gln 被取代為Lys的氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制造方法，所述蛋白質(zhì)都是由導(dǎo)入到微生物的重組表達載體所編碼的蛋白質(zhì)。
7.重組微生物，具有對CoA轉(zhuǎn)移到丙酸和/或乳酸的反應(yīng)進行催化的蛋白質(zhì)，和由下述的a)或b)的氨基酸序列構(gòu)成的對多羥基鏈烷酸的合成反應(yīng)進行催化的蛋白質(zhì)a)序列號2所示的氨基酸序列的第130位、第325位、第477位和第481位的氨基酸中的至少1個以上被取代為其它氨基酸的氨基酸序列，b)在a)中規(guī)定的蛋白質(zhì)中，還有第130位、第325位、第477位和第481位以外的1個或多個氨基酸缺失或被取代，或者插入了 1個或多個氨基酸殘基的氨基酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組微生物，所述對CoA轉(zhuǎn)移到丙酸和/或乳酸的反應(yīng)進行催化的蛋白質(zhì)的氨基酸序列是序列號4所示的氨基酸序列，或序列號4所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了 1個或多個氨基酸的氨基酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組微生物，所述對CoA轉(zhuǎn)移到丙酸和/或乳酸的反應(yīng)進行催化的蛋白質(zhì)的氨基酸序列是序列號6所示的氨基酸序列，或序列號6所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了 1個或多個氨基酸的氨基酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組微生物，對多羥基鏈烷酸的合成反應(yīng)進行催化的蛋白質(zhì)的氨基酸序列是序列號2所示的氨基酸序列的第325位和第481位的氨基酸分別被取代為其它氨基酸的氨基酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組微生物，對多羥基鏈烷酸的合成反應(yīng)進行催化的蛋白質(zhì)的氨基酸序列是序列號2所示的氨基酸序列的第325位的Ser被取代為Thr、第481位的Gln被取代為Lys的氨基酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組微生物，其特征在于，導(dǎo)入了具有編碼所述蛋白質(zhì)的基因的重組表達載體。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供通過以糖作為原料的微生物發(fā)酵來有效生產(chǎn)聚乳酸的方法。聚乳酸的制造方法，包括在含有碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有催化CoA轉(zhuǎn)移到丙酸和/或乳酸的反應(yīng)的蛋白質(zhì)、和下述的a)或b)的氨基酸序列構(gòu)成的催化多羥基鏈烷酸的合成反應(yīng)的蛋白質(zhì)的重組微生物的工序1)a)序列號2所示的氨基酸序列的第130位、第325位、第477位和第481位的氨基酸中的至少1個以上被取代為其它氨基酸的氨基酸序列b)a)中規(guī)定的蛋白質(zhì)中，還有第130位、第325位、第477位和第481位以外的1個或多個氨基酸被缺失或取代，或者還插入了1個或多個氨基酸殘基的氨基酸序列，和從工序1)的培養(yǎng)物中回收前述聚乳酸的工序2)。
文檔編號C12P7/62GK102197140SQ200980142438
公開日2011年9月21日 申請日期2009年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月27日
發(fā)明者伊藤正和, 小畑充生, 嶋村隆, 幸田勝典, 田口精一, 神戶浩美 申請人:豐田自動車株式會社, 國立大學(xué)法人北海道大學(xué)