專利名稱：利用單倍切割確定單倍型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及遺傳學(xué)、分子細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，更具體而言，本發(fā)明涉及單倍型確定的方法。
背景技術(shù)：
正常人體體細(xì)胞是二倍體(即，具有兩個(gè)拷貝的基因組每個(gè)細(xì)胞核中有一套父本染色體和一套母本染色體)。每個(gè)個(gè)體中，這兩套染色體在多個(gè)基因座處具有不同的核苷酸序列(單核苷酸多態(tài)性(SNP))。傳統(tǒng)的基因型分型測(cè)定分析這兩套染色體的混合物，這導(dǎo)致不確定性和復(fù)雜性。例如，對(duì)于都是雜合的任意兩個(gè)SNP基因座，這兩個(gè)SNP之間具有四種可能的單倍型。然而，由于當(dāng)用傳統(tǒng)平臺(tái)進(jìn)行單個(gè)SNP基因型分型時(shí)，消除了相信息， 因此不能排除這四種可能單倍型中的任何一種可能。解決該問題的一種方法是尋找重建或收回相信息的可靠的方法。另一種方法是在進(jìn)行基因型分型之前提取相信息。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用各種統(tǒng)計(jì)學(xué)算法來重建相信息。這些算法包括Clark算法、 期望最大化(EM)算法、基于聯(lián)合的算法(pseudo-Gibbs取樣器和完美/非完美的系統(tǒng)發(fā)生)以及由完全的貝葉斯模型(單倍型)或由EM(PLEM)實(shí)施的分區(qū)-連接算法(Liu N, et al. ,Advances in Genetics, 60 =325-405,2008) 基于非定相的基因型數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的單倍型構(gòu)型通常給出大量不確定的單倍型，這顯著降低了其在遺傳學(xué)應(yīng)用中的能力。此外，對(duì)于是否應(yīng)當(dāng)將構(gòu)建的單倍型看成這些研究中基因型和表現(xiàn)型的客觀觀察數(shù)據(jù)，仍存在爭(zhēng)議。盡管來自家庭成員的基因型通常能幫助確定單倍型，但由家庭數(shù)據(jù)所推斷的單倍型常受缺少信息價(jià)值的數(shù)據(jù)或數(shù)據(jù)缺失的限制。此外，對(duì)大多數(shù)常見的人類疾病的晚期侵襲可以排除從前幾代收集DNA樣品。因此，這些方法不適于未來個(gè)性化用藥中的分子診斷。平行地，一些研究者開發(fā)了在基因型分型之前提取基因組DNA樣品中的相信息的實(shí)驗(yàn)方法。這些方法全部都基于基因型分型之前兩條同源基因組DNA的物理分離。挑戰(zhàn)在于如何分離二倍體細(xì)胞中兩個(gè)幾乎相同的染色體拷貝。已經(jīng)開發(fā)出了將二倍體樣品分離為其單倍體組分的數(shù)種策略/技術(shù)，例如，1)長(zhǎng)距離等位基因特異性基因組 PCR(Michalatos-Beloin S, et al.，Nucleic Acids Res 24 :4841_4843，1996 ；和 YuCE， et al.，Genomics 84 :600-612,2004) ；2)單倍型特異性分離(HSE) (NagyM, et al.， TissueAntigens 69 176-180，2007) ；3)體單倍體細(xì)胞的產(chǎn)生，例如GMP轉(zhuǎn)化(Douglas JA, et al. ,Nat Genet 28 :361-364,2001) ；4)Polony(Mitra et al. ,Proc Natl Acad Sci US AlOO :5926-5931,2003 ；Zhang K，et al.，Nat Genet 38 :382-387, 2006) ；5)基于克隆的系統(tǒng)單倍型分型(CSH) (Burgtorf C，et al.，Genome Res 13 :2717-2724,2003) ；6)單分子稀釋法(SMD) (Ding C, et al.，Proc Natl Acad Sci U S A 100 :7449-7453,2003)；以及 7) 精子分型。
長(zhǎng)距離等位基因特異性基因組PCR使用專門設(shè)計(jì)的PCR引物以僅從姐妹染色體之一選擇性地?cái)U(kuò)增靶區(qū)。通過設(shè)計(jì)引物使其3'端與等位基因之一匹配/錯(cuò)配來實(shí)現(xiàn)選擇性擴(kuò)增。因此，引物不能有效地?cái)U(kuò)增未匹配的染色體DNA模板。隨后在擴(kuò)增產(chǎn)物上進(jìn)行基因型分型。由于這些PCR產(chǎn)物僅獲自染色體之一，因此沿著這些PCR產(chǎn)物的不同SNP的等位基因顯示出單倍型。在本方法中，通過DNA制備中PCR能達(dá)到的最大長(zhǎng)度和染色體完整性來確定單倍型中遺傳標(biāo)記的最大距離。因此，單倍型長(zhǎng)度受PCR的能力限制，其對(duì)于長(zhǎng)PCR約為401Λ。 該方法在技術(shù)上通常是有挑戰(zhàn)性的，并且對(duì)于每個(gè)引物對(duì)都需要大量地優(yōu)化PCR條件，以提高長(zhǎng)PCR的擴(kuò)增效率。通常推薦數(shù)個(gè)引物對(duì)和緩沖液的不同組合以優(yōu)化PCR條件。然而， 該方法不適用于單倍型的高通量分析。單倍型特異性分離(HSE)使用專門設(shè)計(jì)的探針以僅從姐妹染色體之一選擇性地捕獲片段。通過設(shè)計(jì)特異性識(shí)別SNP的一個(gè)等位基因的探針來實(shí)現(xiàn)選擇性結(jié)合。如果個(gè)體是雜合子，當(dāng)將該探針添加至變性的基因組DNA樣品時(shí)，所述探針將搜索并只與含有它的靶等位基因的基因組DNA片段結(jié)合。因此，通過固定化的磁珠捕獲探針結(jié)合的DNA片段，并且?guī)в性揝NP另一個(gè)等位基因的未結(jié)合的DNA片段將被洗掉。目前將二倍體狀態(tài)的基因組 DNA縮減為單倍體狀態(tài)，并準(zhǔn)備用于所有隨后的分析包括基因型分型/單倍型。由于在兩條親本染色體之間總是存在明顯的多態(tài)差異，因此HSE能區(qū)分和分離任何染色體片段的兩親本拷貝。在本方法中，通過DNA制備中染色體完整性和DNA變性來確定單倍型中遺傳標(biāo)記的最大距離。目前該方法能解決<501Λ距離中的單倍型。如果需要超過延伸距離的分子單倍型，則必須進(jìn)行多重的單倍型分離。GMP轉(zhuǎn)化技術(shù)建立在來自活的人細(xì)胞(通常為淋巴細(xì)胞或成纖維細(xì)胞)和嚙齒動(dòng)物細(xì)胞系的細(xì)胞雜種構(gòu)建的基礎(chǔ)上。由于這些雜種細(xì)胞僅保留了人染色體的子集，因此對(duì)于每對(duì)人染色體他們可以是零染色體的、單染色體的或二染色體的。那些單染色體的細(xì)胞是相應(yīng)染色體的單倍體，并準(zhǔn)備用于隨后的用于單倍型確定的基因型分型測(cè)定。在本技術(shù)中，將細(xì)胞電融合，然后在選擇性條件下進(jìn)行增殖，例如使用HPRTl/ HAT (次黃嘌呤、氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷)系統(tǒng)。生長(zhǎng)2-4周之后，收獲融合的克隆，并制備用于分析的DNA。通過對(duì)每條染色體少量高度多態(tài)的標(biāo)記進(jìn)行基因型分型來鑒定單染色體克隆，其最低限度要求單個(gè)的雜合基因型。但是，基于轉(zhuǎn)化的單倍型分型仍存在一些技術(shù)挑戰(zhàn)，包括低DNA濃度、優(yōu)先擴(kuò)增和染色體片段的插入或缺失(Douglas JAet al, Nat Genet 28 :361-364,2001)。已經(jīng)觀察到在雜種細(xì)胞中通常保留的是全染色體而非染色體片段(同上Douglas 2001)。因此，本方法對(duì)單倍型中的SNP距離沒有任何限制。GMP轉(zhuǎn)化技術(shù)的應(yīng)用受限于非常有限的個(gè)體數(shù)量和染色體區(qū)域數(shù)量，這是因?yàn)槿诤虾瓦x擇條件的低效和變化。每個(gè)個(gè)體需要多個(gè)細(xì)胞系?；谵D(zhuǎn)化的單倍型分型仍非常浪費(fèi)時(shí)間且非常昂貴。Polony技術(shù)使用聚丙烯酰胺凝膠處理染色體DNA的原位單條分子。在本技術(shù)中， 最初將來自個(gè)體的基因組DNA稀釋至非常低的濃度，然后與丙烯酰胺混合并在玻璃顯微鏡載玻片上展開以形成薄的含有DNA的聚丙烯酰胺凝膠。由于DNA濃度非常低，因此DNA分子彼此良好分開。然后直接在該凝膠上進(jìn)行凝膠內(nèi)的PCR，用兩對(duì)PCR引物從單條DNA分子擴(kuò)增目的SNP的兩個(gè)基因座。由于丙烯酰胺基質(zhì)限制線性DNA分子的擴(kuò)散，因此PCR產(chǎn)物在它們擴(kuò)增模板周圍積累形成兩個(gè)重疊的PCR集落(polony)。通過分別地對(duì)這兩個(gè)SNP 的單堿基延伸(SBE)測(cè)定，原位確定這兩個(gè)SNP的基因型，然后通過激光掃描儀讀取凝膠。 在疊加這兩個(gè)SBE圖像之后，同一斑點(diǎn)所觀察到的等位基因指示該患者樣品這兩個(gè)SNP的等位基因組合(單倍型)。在丙烯酰胺聚合之前、期間或之后通過DNA斷裂或降解來確定Polony的最大單倍型長(zhǎng)度。據(jù)報(bào)道，目前為止本方法已經(jīng)檢測(cè)了長(zhǎng)至451Λ的單倍型(Mitra，et al.，PNAS USA 100 :5926-5931,2003 ；Zhang K, et al.，Nat Genet 38 :382-387,2006)。在Polony方法中有數(shù)條內(nèi)在的警告事項(xiàng)。Polony單倍型分型的一個(gè)主要局限是不能有效地放大SNP的數(shù)量。但是通常需要對(duì)染色體大量(100-10，000)的SNP進(jìn)行單倍型分型。第二，DNA分子可能在凝膠中重疊。因此，DNA濃度和鋪板條件是重要的。第三， PCR共擴(kuò)增效率低(對(duì)于來自頰粘膜棉簽的樣品為4-15%，對(duì)于來自其他收集方法的樣品為15-34% )。在熱循環(huán)和DNA斷裂或降解期間，共擴(kuò)增效率與Polony凝膠中非凝膠化的丙烯酰胺的存在有關(guān)?？赡苄枰M(jìn)行技術(shù)優(yōu)化(諸如脫氣和聚合條件)。最后，本技術(shù)需要中期細(xì)胞?；诳寺〉南到y(tǒng)單倍型分型(CSH)使用fosmid/黏?？寺亩扼w染色體分離單拷貝。由于每個(gè)載體分子僅能容納一個(gè)插入分子，來自成功的載體-插入連接體的每個(gè)集落會(huì)僅容納單倍體染色體片段。通過篩查集落文庫(kù)，獲得含有靶染色體片段的集落用于隨后的單倍型分型分析。由于載體不能成功地接收超過它們最大克隆能力的非常大尺寸的插入子，因此CSH能分離約501Λ的單倍體片段。此外，本方法非常浪費(fèi)時(shí)間且昂貴。單分子稀釋法(SMD)建立在單分子一定是單倍體片段的概念的基礎(chǔ)上，這是由于二倍體染色體是一對(duì)拷貝且需要兩個(gè)DNA分子組成二倍體。為了在每個(gè)反應(yīng)管中獲得單分子，將基因組DNA樣品稀釋至相當(dāng)?shù)偷臐舛?。我們已?jīng)了解人類的每個(gè)二倍體基因組約為 6. 7pg，所以如果管中僅含有約3. 3pg的基因組DNA，則它一定有一些染色體區(qū)域的單分子， 這是因?yàn)镈NA量不足以使每個(gè)染色體區(qū)域在那個(gè)管中有兩個(gè)拷貝。通過連續(xù)稀釋達(dá)到該非常低的DNA濃度。連續(xù)稀釋之后，對(duì)于任何給定的染色體片段，每管可以不含DNA、含有該區(qū)域的一個(gè)DNA分子或含有該區(qū)域的兩個(gè)DNA分子。然后對(duì)這些管中的微量DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增和基因型分型；將事先鑒定的該個(gè)體雜合SNP基因座處的等位基因缺失用來篩出“單分子”管用于下一步的實(shí)驗(yàn)。本方法的警告事項(xiàng)是它依賴于單DNA分子的統(tǒng)計(jì)學(xué)分離，所以對(duì)于它的成功沒有實(shí)驗(yàn)保證。本方法中，由于連續(xù)稀釋中頻繁的剪切，基因組DNA被斷裂。目前報(bào)道的最大距離是約 24kb 的單倍型分型距離(Ding C, et al.，PNAS USAlOO :7449-7453,2003)。精子分型建立在精子是減數(shù)分裂的產(chǎn)物且僅含有單倍體基因組的事實(shí)上。盡管精子是單倍體，但是精子單倍型并不簡(jiǎn)單地等于贈(zèng)與者的單倍型。精子單倍體基因組并不是該個(gè)體任何親本染色體之一。然而，通過對(duì)來自一個(gè)個(gè)體的數(shù)個(gè)精子進(jìn)行基因型分型，然后分析這些精子的單倍型數(shù)據(jù)，可以推斷該個(gè)體的單倍型。因此，由于精子分型不是直接的單倍型分型，其與上述的分子單倍型分型方法不同。在減數(shù)分裂重組中，不同的精子經(jīng)歷不同的交換事件，所以來自同一個(gè)體的精子具有不同的單倍型。在交換中，兩條染色單體交換它們的染色體端臂；人類該染色體末端僅交換一次，有時(shí)兩次或更多次。因此，假設(shè)在研究的精子中僅發(fā)生一次交換事件，則可能從多個(gè)精子推斷出最初患者的單倍型。然而，由于精子分型僅限于男性，程序冗長(zhǎng)且昂貴， 并且單倍型是推斷的結(jié)果而不是直接的觀察；因此精子分型不能廣泛應(yīng)用于分子單倍型分型?？傊?，當(dāng)前可用的染色體分離的實(shí)驗(yàn)方法常引起染色體斷裂，所以它們不能獲得長(zhǎng)范圍的單倍型。此外，由于它們相當(dāng)浪費(fèi)時(shí)間且是勞動(dòng)密集的，所以它們?cè)谘芯抗ぷ鲗?shí)驗(yàn)室和臨床實(shí)際上是不可行的。仍存在低成本快速進(jìn)行單倍型分型方法的需要。發(fā)明_既述公開了對(duì)個(gè)體進(jìn)行分子單倍型分型的方法。所述方法包括在個(gè)體多個(gè)裂解的二倍體細(xì)胞的每一個(gè)細(xì)胞中隨機(jī)選擇一組染色體；將從所述多個(gè)細(xì)胞選擇的染色體收集進(jìn)多個(gè)樣品管中，其中每個(gè)樣品管含有選自一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的染色體；對(duì)每個(gè)樣品管中的基因組DNA進(jìn)行基因型分型；以及基于來自基因型分型數(shù)據(jù)的等位基因核苷酸序列信息和相應(yīng)的核苷酸信號(hào)強(qiáng)度來確定等位基因的單倍型。在一個(gè)實(shí)施方案中，確定等位基因單倍型的步驟包括下述步驟從基因型分型數(shù)據(jù)提取等位基因核苷酸序列信息和相應(yīng)的核苷酸信號(hào)強(qiáng)度；計(jì)算每個(gè)雜合基因座處兩個(gè)等位基因的核苷酸信號(hào)強(qiáng)度比(等位基因強(qiáng)度比)；以及確定等位基因的單倍型。在另一個(gè)實(shí)施方案中，計(jì)算等位基因強(qiáng)度比的步驟包括計(jì)算純合基因座處核苷酸A、C、G和T的相對(duì)比，確定每種核苷酸的k值，進(jìn)而將它們的信號(hào)強(qiáng)度調(diào)到相同的水平； 使用k值調(diào)整雜合基因座處的核苷酸信號(hào)強(qiáng)度；以及計(jì)算雜合基因座處的等位基因強(qiáng)度比。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述確定步驟還包括下述步驟通過等位基因強(qiáng)度比對(duì)每個(gè)基因座處的等位基因順序進(jìn)行整理；將較高強(qiáng)度等位基因保持在第一欄而將較低強(qiáng)度等位基因保持在第二欄；確定每條染色體中是否有斷點(diǎn)，如果在染色體中沒有斷點(diǎn)，用第一欄中的等位基因形成一個(gè)單倍型，且用第二欄中的等位基因形成另一個(gè)單倍型，如果在染色體中有斷點(diǎn)，使用來自其他染色體收集管中的結(jié)果搭接所述斷點(diǎn)。在相關(guān)的實(shí)施方案中，細(xì)胞是外周血淋巴細(xì)胞。在另一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，將來自2-10個(gè)隨機(jī)選擇的細(xì)胞的染色體收集進(jìn)樣品管中，并且一共收集4-8個(gè)樣品管。在另一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，所述基因型分型步驟包括擴(kuò)增基因組DNA。還公開了對(duì)個(gè)體進(jìn)行分子單倍型分型的另一種方法。所述方法包括從個(gè)體分離一個(gè)或多個(gè)單個(gè)的二倍體細(xì)胞；對(duì)每個(gè)分離的單個(gè)的二倍體細(xì)胞進(jìn)行裂解以產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)單細(xì)胞裂解物；將每個(gè)單細(xì)胞裂解物分成兩等份；對(duì)每等份中的基因組DNA進(jìn)行基因型分型；創(chuàng)建來自所有等份的基因型分型數(shù)據(jù)的目錄；以及基于所述目錄確定個(gè)體的染色體單倍型。在相關(guān)的實(shí)施方案中，所述分離步驟包括從個(gè)體分離4-12個(gè)單個(gè)的二倍體細(xì)胞。在另一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，所述分離步驟包括從個(gè)體分離6-10個(gè)單個(gè)的二倍體細(xì)胞。在另一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，所述分離步驟包括從個(gè)體分離8個(gè)單個(gè)的二倍體細(xì)胞。
還公開了對(duì)個(gè)體進(jìn)行分子單倍型分型的另一種方法。所述方法包括從個(gè)體分離單個(gè)的二倍體細(xì)胞；對(duì)分離的單個(gè)的二倍體細(xì)胞進(jìn)行裂解和染色以展示染色體；通過激光顯微切割從單細(xì)胞收集一組染色體；對(duì)所收集的染色體中的基因組DNA進(jìn)行基因型分型； 對(duì)來自相同個(gè)體的一個(gè)或多個(gè)完整的二倍體細(xì)胞的基因組DNA進(jìn)行基因型分型；以及確定染色體收集組中的染色體的單倍型，其中所述染色體以單倍體形式存在于所述染色體收集組中。在相關(guān)的實(shí)施方案中，分離并裂解多個(gè)單個(gè)的二倍體細(xì)胞。收集多組染色體；從同一個(gè)體不同的單細(xì)胞收集每組染色體。收集組的數(shù)量足夠大，以便個(gè)體基因組中的每條染色體以大于99%的概率存在于單倍體形式中。在相關(guān)的實(shí)施方案中，所述個(gè)體是真核有機(jī)體。在相關(guān)的實(shí)施方案中，所述真核有機(jī)體是動(dòng)物或植物。在另一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，所述動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。本發(fā)明的另一方面涉及具有用于實(shí)施上述方法的計(jì)算機(jī)執(zhí)行指令的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。本發(fā)明的另一方面涉及用于單倍切割的測(cè)定試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述測(cè)定試劑盒含有用于細(xì)胞收集試劑和細(xì)胞發(fā)生染色的試劑，以及用于基因組DNA擴(kuò)增和基因組基因型分型的試劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含具有計(jì)算機(jī)執(zhí)行指令的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，用于基于基因型分型數(shù)據(jù)確定單倍型。附圖簡(jiǎn)要說明

圖1用圖表說明通過將失調(diào)引入染色體比的單倍切割方法實(shí)施方案的一般原理。圖2是顯示單倍切割方法實(shí)施方案的流程圖。圖3是使用Leica AS LMD計(jì)算機(jī)指導(dǎo)的激光顯微切割進(jìn)行的染色體收集的圖。收集收集區(qū)域內(nèi)的染色體用于單倍型分型。圖4是顯示用于確定以單倍型為基礎(chǔ)的基因型分型數(shù)據(jù)的方法實(shí)施方案的流程圖。圖5是顯示使用單細(xì)胞裂解物的單倍切割方法的另一個(gè)實(shí)施方案的流程圖。圖6是說明單細(xì)胞單倍型分割原理的簡(jiǎn)圖。圖7是說明使用單細(xì)胞切割的單倍切割方法進(jìn)行單倍型分型的原理簡(jiǎn)圖。圖8是顯示單細(xì)胞切割方法步驟和一些單倍型分型結(jié)果的流程簡(jiǎn)圖。通過他們的親本來源顯示單倍型(Fa，父親；Mo，母親)。發(fā)明的詳細(xì)描述除非另有所指，下面進(jìn)一步詳細(xì)描述的實(shí)施方案的實(shí)施將使用本領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)的遺傳學(xué)方法、基因組分子生物學(xué)方法、細(xì)胞生物學(xué)方法、診斷學(xué)方法和生物信息學(xué)方法。文獻(xiàn)中對(duì)這類技術(shù)有充分地說明。無論是上文還是下文中本文所引用的所有公開、專利和專利申請(qǐng)，都通過引用將其全部?jī)?nèi)容并入本文。本發(fā)明一方面涉及對(duì)個(gè)體進(jìn)行分子單倍型分型的方法。在下文中將該方法稱為 “單倍切割(HaploDissection)”方法。如下文更詳細(xì)的描述，所述新方法克服了單倍型長(zhǎng)度的瓶頸，并且對(duì)SNP數(shù)量或樣品數(shù)量沒有限制。本發(fā)明滿足了遺傳研究、基因組研究和表觀基因組研究，尤其在全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)、基因表達(dá)的長(zhǎng)順式調(diào)節(jié)相互作用以及染色質(zhì)重塑形研究中精確單倍型的需要。精確單倍型是解釋這些結(jié)果并將其轉(zhuǎn)化為臨床實(shí)踐所必須的。圖1圖示了單倍切割方法的一個(gè)實(shí)施方案。簡(jiǎn)單而言，單倍切割方法保持待進(jìn)行基因型分型的個(gè)體DNA樣品的相信息，但該保持并非基于兩染色體拷貝的分開或單拷貝的分離。所述方法通過將相對(duì)少量的染色體收入每個(gè)樣品管簡(jiǎn)單地在兩條親本染色體數(shù)量上穩(wěn)定的1 1比中引入失調(diào)。因此，雖然基因型/等位基因信息仍保留在DNA樣品中，并且可應(yīng)用于高通量基因型分型平臺(tái)，但是將相信息記錄在兩等位基因的數(shù)量比中。這些等位基因的相對(duì)比實(shí)際上是所有這些基因型分型平臺(tái)的輸出之一，但在基因型分型說明中，它們常被忽略。單倍切割方法將讀取等位基因讀數(shù)和等位基因強(qiáng)度讀數(shù)的輸出信息。然后通過專門設(shè)計(jì)的算法分析基因型分型信息和相信息，從而確定個(gè)體的單倍型。在一個(gè)實(shí)施方案中，隨后通過專門設(shè)計(jì)的被稱為“HapReader”的軟件分析基因型分型信息和相信息。由于單倍切割方法在引入等位基因在數(shù)量上的失調(diào)時(shí)保護(hù)染色體的完整性，因此由該方法獲得的單倍型將在完整的染色體范圍變化，或不受距離限制。單倍切割方法的實(shí)施方案顯示在圖2中。在該實(shí)施方案中，方法100包括在個(gè)體多個(gè)裂解的細(xì)胞的每一個(gè)細(xì)胞中選擇(110) —組染色體；將從所述多個(gè)細(xì)胞選擇的染色體收集(120)進(jìn)多個(gè)樣品管中，其中每個(gè)樣品管含有選自一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的染色體；對(duì)每個(gè)樣品管中的基因組DNA進(jìn)行基因型分型(130)；以及基于來自基因型分型數(shù)據(jù)的等位基因核苷酸序列信息和相應(yīng)的核苷酸信號(hào)強(qiáng)度來確定(140)等位基因的單倍型?？蓮娜魏晤愋偷募?xì)胞選擇染色體。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞是從個(gè)體血液樣品分離的外周血淋巴細(xì)胞。用于分離外周血淋巴細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，將分離的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中直至它們開始增殖。能誘導(dǎo)增殖的生長(zhǎng)介質(zhì)在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基是含有15% FBS和 100單位/ml青霉素/鏈霉素的RPMI 1640。可以將諸如植物凝集素(PHA)的促分裂原添加至培養(yǎng)基以刺激細(xì)胞增殖，且可以添加諸如秋水仙胺的有絲分裂抑制劑使細(xì)胞停止在中期。然后使用公知的細(xì)胞遺傳學(xué)方法收獲正在增殖的外周血淋巴細(xì)胞，將其裂解、染色以展示染色體。隨機(jī)選擇并收集了一組染色體用于進(jìn)一步的分析，所述一組染色體通常約為裂解的細(xì)胞中染色體的一半。圖3顯示了使用計(jì)算機(jī)指導(dǎo)的激光顯微切割從用于收集的單個(gè)細(xì)胞選擇染色體的實(shí)例。收集標(biāo)記區(qū)域內(nèi)的染色體。如早期所指出的，隨機(jī)選擇染色體用于收集。將來自隨機(jī)選擇的細(xì)胞的隨機(jī)選擇的染色體收集進(jìn)多個(gè)樣品管中。每管含有從多個(gè)細(xì)胞收集的染色體。在一個(gè)實(shí)施方案中，每管含有從2-20個(gè)，優(yōu)選2-10個(gè)隨機(jī)選擇的細(xì)胞收集的染色體。對(duì)于每個(gè)個(gè)體，總共收集2-12個(gè)，優(yōu)選4-8個(gè)樣品管。使用保持染色體完整性的技術(shù)收集所選擇的染色體。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用計(jì)算機(jī)指導(dǎo)的激光顯微切割收集染色體。在下一步驟中，對(duì)每個(gè)樣品管中所收集的染色體進(jìn)行基因型分型。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用均衡的全基因組擴(kuò)增(WGA)方法通過PCR對(duì)收集的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。然后將擴(kuò)增的DNA進(jìn)行全基因組基因型分型。對(duì)于每個(gè)個(gè)體，用2-4管樣品進(jìn)行基因型分型，以確保高的基因組覆蓋度并實(shí)現(xiàn)精確復(fù)制。在一個(gè)實(shí)施方案中，包括了基因組DNA樣品用于全基因組基因型分型。
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使用將測(cè)序信息相信息與整合的方法分析來自基因型分型的輸出數(shù)據(jù)集，從而確定個(gè)體的單倍型，所述相信息反映在每個(gè)基因座處測(cè)序信號(hào)的強(qiáng)度上。簡(jiǎn)單而言，從基因型分型數(shù)據(jù)提取等位基因核苷酸序列信息和相應(yīng)的核苷酸信號(hào)強(qiáng)度，所述基因型分型數(shù)據(jù)來自每個(gè)樣品管中收集的染色體。計(jì)算染色體每個(gè)基因座的兩等位基因的核苷酸信號(hào)強(qiáng)度比 (等位基因強(qiáng)度比)，并將其用于確定等位基因的單倍型。圖4是顯示基于等位基因的核苷酸序列信息和相應(yīng)的核苷酸信號(hào)強(qiáng)度確定等位基因單倍型的方法的實(shí)施方案的流程圖。在該實(shí)施方案中，方法200包括從基因型分型數(shù)據(jù)提取(210)等位基因核苷酸序列信息和相應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度；計(jì)算(220)純合基因座處核苷酸A、C、G和T的相對(duì)比；確定(230)每個(gè)核苷酸的k值，從而對(duì)于給定的具體實(shí)驗(yàn)將它們的信號(hào)強(qiáng)度調(diào)整至同等水平；使用k值調(diào)整(MO)雜合基因座處的核苷酸信號(hào)強(qiáng)度，計(jì)算 (250)每個(gè)基因座處兩等位基因的信號(hào)強(qiáng)度比(等位基因強(qiáng)度比)；通過等位基因強(qiáng)度比對(duì)每個(gè)基因座處的等位基因順序進(jìn)行整理O60)，將較高強(qiáng)度等位基因保持在第一欄而將較低強(qiáng)度等位基因保持在第二欄；確定(270)每條染色體中是否有斷點(diǎn)，如果在染色體中沒有斷點(diǎn)，用形成單倍型的第一欄中的等位基因形成(觀0) —個(gè)單倍型，且用第二欄中的等位基因形成另一個(gè)單倍型，如果在染色體中有斷點(diǎn)，使用(四0)來自其他染色體收集管中的結(jié)果搭接所述斷點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用專門開發(fā)用于單倍切割技術(shù)的“HapReader”軟件進(jìn)行分析。實(shí)施例中對(duì)所述軟件有更詳細(xì)的描述。單倍切割方法的另一個(gè)實(shí)施方案基于來自單個(gè)細(xì)胞裂解物的單倍體基因組的分開。在所有當(dāng)前的分子單倍型分型方法中，二倍體至單倍體的縮減是從不確定的和大量的染色體拷貝中完成。本發(fā)明方法建立在每個(gè)體細(xì)胞精確地具有每條染色體的兩個(gè)拷貝的事實(shí)上。該精確的數(shù)量提供了分開兩條染色體的非常簡(jiǎn)單的方法。簡(jiǎn)單而言，所述方法在單細(xì)胞基礎(chǔ)上分開染色體。該新起點(diǎn)使分開比以前的發(fā)明更容易，由于該起點(diǎn)處僅有每條染色體的兩個(gè)拷貝。此外，所述方法克服了其他方法的主要缺點(diǎn)-短單倍型距離。因此，該新方法開啟了通過簡(jiǎn)單而有效的方法獲得長(zhǎng)距離單倍型的大門。如圖5所示，方法300包括下述步驟從個(gè)體分離(310) —個(gè)或多個(gè)單個(gè)的二倍體細(xì)胞；對(duì)來自個(gè)體的每個(gè)單個(gè)的二倍體細(xì)胞進(jìn)行裂解(320)以產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)單細(xì)胞裂解物；將每個(gè)單細(xì)胞裂解物分成(330)兩等份；對(duì)每等份中的基因組DNA進(jìn)行基因型分型 (340)；創(chuàng)建(350)來自所有等份基因型分型數(shù)據(jù)的目錄；以及基于所述目錄確定(360)個(gè)體的染色體單倍型。二倍體細(xì)胞可以是來自個(gè)體的頰粘膜細(xì)胞、淋巴細(xì)胞或任何其他細(xì)胞類型。在一個(gè)實(shí)施方案中，從個(gè)體收集人頰粘膜細(xì)胞。頰粘膜細(xì)胞是口或臉頰的內(nèi)膜上的細(xì)胞。它們常規(guī)性地蛻落并由新細(xì)胞取代。當(dāng)老細(xì)胞死亡時(shí)，它們?cè)诳诘耐僖褐蟹e累，并能通過用漱口劑的簡(jiǎn)單方法容易地將它們收集。通過棉簽、細(xì)胞刷、漱口劑以及諸如FTA或IsoCode卡的處理過的卡可以容易地收集頰粘膜細(xì)胞。然后，分離單個(gè)的細(xì)胞并保存在單獨(dú)的管中。這可以通過能分離單個(gè)細(xì)胞而保留細(xì)胞基因組DNA的任何方法來進(jìn)行。這類方法的實(shí)例包括但不限于，激光顯微切割或流式細(xì)胞術(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用激光顯微切割或諸如細(xì)胞分類的任何其他方法實(shí)施單個(gè)細(xì)胞的分離。激光顯微切割是允許從組織樣品精確地切除目的細(xì)胞或在直接的顯微鏡顯示下通過激光束進(jìn)行涂片的顯微操作方法。在計(jì)算機(jī)監(jiān)測(cè)下標(biāo)記目的區(qū)域，然后通過計(jì)算機(jī)控制將其切下?？梢酝ㄟ^顯微鏡下的檢查模式立即對(duì)收集管中的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢查，以確保成功的分離。在細(xì)胞分離期間所用的染色方案不應(yīng)當(dāng)干擾隨后的DNA擴(kuò)增和等位基因確定。優(yōu)選的染色方法不包括任何固定步驟，并且不基于腐蝕性化學(xué)試劑的使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用巴氏(Papanicolaou)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用蘇木精和曙紅 (HE)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。然后將通過顯微切割收集的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞裂解。多種技術(shù)可用于細(xì)胞破碎， 包括物理方法和基于去垢劑的方法。所選的用于細(xì)胞破碎的技術(shù)必須考慮與預(yù)期的下游應(yīng)用一基因型分型和單倍型分型的兼容性。因此，細(xì)胞裂解方法不應(yīng)當(dāng)侵略性地連接DNA 分子和將染色體斷裂為小的碎片?？梢赃x擇任何基因組DNA保護(hù)劑，有效的、簡(jiǎn)單的以及低成本的方法。選擇細(xì)胞裂解方案還應(yīng)當(dāng)考慮細(xì)胞或組織來源。物理裂解方法和基于去垢劑的裂解方法都可以用于細(xì)胞破碎。優(yōu)選的細(xì)胞裂解方法包括低滲裂解和蛋白酶K裂解。然后，將單細(xì)胞裂解物平均分成兩管。為了確保收集了任何給定染色體的單倍體拷貝，收集多個(gè)單細(xì)胞裂解物和相應(yīng)的分割部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，收集了 4-12個(gè)單細(xì)胞裂解物。在其他的實(shí)施方案中，收集了 6-10個(gè)單細(xì)胞裂解物。在仍然其他的實(shí)施方案中， 收集了8個(gè)單細(xì)胞裂解物。如圖6所示，二倍體細(xì)胞含有每條染色體的兩個(gè)拷貝(一拷貝來自父本，一拷貝來自母本)。當(dāng)將含有染色體的兩個(gè)拷貝的溶液平均分成兩管時(shí)，兩個(gè)拷貝可能同時(shí)進(jìn)入管1 或管2，或者它們中的每一個(gè)可能進(jìn)入不同的管中?？梢匀菀椎乇O(jiān)測(cè)存在于這些兩個(gè)分割管中的染色體的方式。如果一管不含該染色體，則另一管一定含有該染色體的兩個(gè)拷貝。如果兩管都含有該染色體，則它們一定是每管含有一個(gè)拷貝。對(duì)于一次分割操作，獲得任意給定染色體的單倍體拷貝的概率是成功概率=失敗概率=1/4+1/4 = 0. 50。如果收集了 η個(gè)單細(xì)胞，并按上述將分割進(jìn)行η次(每個(gè)單細(xì)胞一次)，則這些管對(duì)沒有一個(gè)具有給定染色體的單倍體拷貝(對(duì)于該給定染色體，所有的管都是二倍體或異倍體)的概率是失敗概率=1/2η。成功概率=1-1/2η。因此，如果收集了 8個(gè)單細(xì)胞(S卩，η = 8)并分成16等份，則在這些分割部分中獲得任意特定染色體的單倍體拷貝的可能性是1-1/28 = 0 . 9961。這意味著有99. 61%的機(jī)會(huì)這些16個(gè)分割管至少之一將含有靶染色體的單倍體拷貝。因此，如果樣品大小是1000個(gè)人個(gè)體，從每個(gè)個(gè)體收集8個(gè)細(xì)胞，在第一輪分割操作中，996個(gè)個(gè)體將成功地獲得用于分子單倍型分型的任何染色體的單倍體拷貝。分割之后，一管可能含有一條染色體的單倍體拷貝；然而，它可能含有另一條染色體的兩個(gè)拷貝。如果一管含有染色體A的單倍體拷貝、染色體B的兩個(gè)拷貝和不含染色體C，則該管仍可理想地用于染色體A的隨后分析(諸如單倍型確定)。存在染色體B的兩個(gè)拷貝和缺失染色體C將不干擾對(duì)染色體A的結(jié)果。有相當(dāng)罕見的情況，其中來自一個(gè)單個(gè)的體細(xì)胞的單倍型不代表相同個(gè)體的單倍型。該罕見情況是發(fā)生在體細(xì)胞中的有絲分裂交換。已知有絲分裂交換可能發(fā)生在一些無性繁殖的真菌和人類癌細(xì)胞中。因此，用于對(duì)罹患癌癥的個(gè)體進(jìn)行單倍型分型，有必要注意并獲得多個(gè)細(xì)胞。實(shí)際上，通過單細(xì)胞分割策略可容易地測(cè)定該種情況。具體地，如果來自個(gè)體的細(xì)胞含有某染色體的多于兩個(gè)拷貝，則在兩個(gè)分割的管中都存在那條染色體將不能表明每個(gè)管中都具有單倍體染色體。例如，如果有3拷貝的染色體，當(dāng)兩管都含有該染色體時(shí)，一管將有一個(gè)拷貝，另一管將有兩個(gè)拷貝。有兩個(gè)拷貝的管在一些多態(tài)位點(diǎn)將顯示雜合基因型。因此，我們的方法可以測(cè)定拷貝數(shù)多態(tài)現(xiàn)象。然后對(duì)每管中的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增用于基因型分型。可以使用均衡的全基因組擴(kuò)增(WGA)的任何方法。與旨在擴(kuò)增特定序列的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)不同，WGA旨在無偏愛性地?cái)U(kuò)增全部基因組。全面的WGA需要保真地復(fù)制30億堿基而不丟失或畸變?nèi)魏翁囟ǖ幕蜃虻任换?。這類方法的實(shí)例包括但不限于，多重置換擴(kuò)增(MDA，GE Healthcare GenomiPhi和 Qiagen R印li_g)、引物延伸預(yù)擴(kuò)增(PEP)、改進(jìn)的引物延伸預(yù)擴(kuò)增(iPEP)、簡(jiǎn)并寡聚核苷酸引物PCR(D0P，Sigma GenomePlex)。市場(chǎng)中當(dāng)前的WGA方法有下述不同(i)擴(kuò)增能力和產(chǎn)量；( )保真性；(iii)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度；(iv)可擴(kuò)展性以及(ν)擴(kuò)增包括單細(xì)胞的少量起始材料的能力。例如，R印li-g和GenomiPhi產(chǎn)生約101Λ大小的產(chǎn)物，而SigmaGenomePlex 產(chǎn)生約數(shù)百個(gè)堿基對(duì)的產(chǎn)物。由于本發(fā)明的分子單倍型分型方法能解決的距離不依賴于擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度，因此WGA方法的長(zhǎng)度特征不是本發(fā)明的關(guān)鍵特征。相反，擴(kuò)增能力和潛在的等位基因偏愛和基因座偏愛是本發(fā)明的關(guān)鍵。之前通過使用人類精子的遺傳學(xué)研究已經(jīng)很好地說明了從單倍體染色體進(jìn)行擴(kuò)增的可行性。對(duì)單個(gè)精子進(jìn)行基因型分型的能力最初在1988年報(bào)道(Li HH, et al,Nature 335:414-417,1988)。目前法醫(yī)科學(xué)家已經(jīng)廣泛地使用對(duì)來自單個(gè)精子細(xì)胞(單倍體)的 DNA 樣品進(jìn)行基因型分型(Di Martino D, et al. Forensic SciInt 146 增刊S151-153， 2004)。已經(jīng)顯示通過I1aqGold DNA聚合酶可以擴(kuò)增高達(dá)10. 4pg的DNA，用于可靠的STR (短串聯(lián)重復(fù)，與SNP平行的遺傳學(xué)多態(tài)現(xiàn)象類型)譜。除了單個(gè)精子細(xì)胞，使用WGA-多重置換擴(kuò)增(MDA)方法已經(jīng)成功地實(shí)現(xiàn)單淋巴細(xì)胞(二倍體)或單卵裂球(二倍體)的擴(kuò)增。普遍關(guān)注的WGA是在雜合基因座處的等位基因缺失，這是在一個(gè)多態(tài)基因座處兩個(gè)等位基因中偏愛的不對(duì)稱擴(kuò)增的結(jié)果。等位基因缺失將使雜合個(gè)體在基因型分型中顯示為純合個(gè)體。因此，當(dāng)觀察到純合基因型時(shí)，這理論上仍是可能是假純合基因型；它可能來源于WGA中的等位基因缺失。當(dāng)使用用于分子單倍型分型的細(xì)胞-分割方法時(shí)，由于有單拷貝的單倍體，如果在特定的基因座沒有基因座偏愛，則在隨后的基因型分型測(cè)定中等位基因讀數(shù)將代表那個(gè)相應(yīng)的單倍型上的等位基因。因此，沒有必要注意區(qū)分等位基因缺失和真正的純合子。如上面所討論的，如果來自8個(gè)單細(xì)胞的16個(gè)分割管是從一個(gè)個(gè)體收集的，則 99. 6%會(huì)有一些管含有任何給定染色體的單倍體拷貝。其它管可能含有相同染色體的二倍體拷貝或無相同染色體拷貝(異倍體)。每管可能含有某種染色體的單倍體拷貝、其它染色體的二倍體拷貝，以及沒有其它染色體拷貝。因此，有必要為每管創(chuàng)建關(guān)于它的內(nèi)容的目錄，用于包括單倍型確定在內(nèi)的隨后分析?？梢酝ㄟ^能檢測(cè)DNA存在的任何方法編目錄。例如，PCR可以用來檢測(cè)DNA片段的存在。如果將PCR設(shè)計(jì)為覆蓋足夠數(shù)量的代表所有基因組染色體的區(qū)域，然后它可以用來創(chuàng)建基因組范圍的目錄。還可以將PCR設(shè)計(jì)為僅覆蓋研究課題的靶基因組區(qū)。此外，還可以使用全基因組瓦片陣列創(chuàng)建該目錄，但是是以更加系統(tǒng)和高通量的形式。如果分割對(duì)的兩管都含有染色體A，則將具有染色體A的單倍體拷貝的兩管用于單倍型確定。基于用于隨后分析的該目錄選擇具有任何特定染色體的單倍體拷貝的管?？梢詫碜栽摲椒ǖ臉悠酚米鞒Ｒ?guī)的DNA樣品，并直接進(jìn)行各種高通量基因型分型測(cè)定。在單倍型確定中，將來自單倍體樣品的基因型與來自相同個(gè)體用作質(zhì)量對(duì)照的的二倍體樣品進(jìn)行比較。通過該比較將容易地檢測(cè)任何假-單倍體管。單倍切割方法的另一個(gè)實(shí)施方案允許確定來自單細(xì)胞某染色體的單倍型。所述方法包括從個(gè)體分離單個(gè)的二倍體細(xì)胞，對(duì)分離的單個(gè)的二倍體細(xì)胞進(jìn)行裂解和染色以展示染色體，通過激光顯微切割從單細(xì)胞收集一組染色體，對(duì)所收集的染色體中的基因組DNA 進(jìn)行基因型分型，對(duì)來自相同個(gè)體的另一個(gè)完整的單細(xì)胞的基因組DNA進(jìn)行基因型分型， 確定染色體收集組中的染色體的單倍型，其中所述染色體以單倍體形式存在于所述染色體收集組中。如圖7所示，當(dāng)沿著虛線切割細(xì)胞并收集右半細(xì)胞時(shí)，所收集的染色體包含僅為染色體2、3和5的單拷貝(單倍體)、染色體1的兩個(gè)拷貝(二倍體)和沒有染色體4拷貝 (異倍體)。因此，從傳統(tǒng)基因型分型平臺(tái)對(duì)該半個(gè)細(xì)胞的基因型讀取(genotype calls) 將直接返回染色體2、3和5的單倍型，而對(duì)于染色體1將仍是二倍體基因型，對(duì)于染色體4 沒有基因型讀取。如早期所討論的，對(duì)于每條給定的染色體，如果所收集的一組染色體含有單個(gè)的二倍體細(xì)胞染色體總數(shù)的約一半，則有50%的機(jī)會(huì)收集單倍體拷貝。當(dāng)從多個(gè)單細(xì)胞收集多組染色體時(shí)，概率會(huì)顯著增加。例如，如果從8個(gè)單細(xì)胞收集8組染色體，并且每組收集的染色體含有單細(xì)胞染色體總數(shù)的約一半，則有大于99. 6%的機(jī)會(huì)收集給定染色體的單倍體拷貝。因此，使用8個(gè)半個(gè)細(xì)胞可以高概率(大于99. 6%)實(shí)現(xiàn)對(duì)來自個(gè)體的完整染色體組進(jìn)行單倍型分型。因此，在相關(guān)的實(shí)施方案中，分離并裂解多個(gè)單個(gè)的二倍體細(xì)胞。收集多組染色體；從不同的單細(xì)胞收集每組染色體。收集組的數(shù)量足夠大，以便個(gè)體基因組中的每條染色體以大于99%的概率存在于單倍體形式中。將上述的單倍切割方法應(yīng)用于任何真核有機(jī)體中。在某些實(shí)施方案中，所述個(gè)體是動(dòng)物或植物。在其他的實(shí)施方案中，所述個(gè)體是哺乳動(dòng)物。在其他的實(shí)施方案中，所述個(gè)體是人。本發(fā)明的另一方面涉及具有用于實(shí)施本發(fā)明方法的計(jì)算機(jī)執(zhí)行指令的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。本發(fā)明的另一方面涉及用于單倍切割的測(cè)定試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述測(cè)定試劑盒含有用于細(xì)胞收集、細(xì)胞裂解和任選地細(xì)胞發(fā)生染色的試劑，以及用于基因組DNA 擴(kuò)增和基因組基因型分型的試劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含具有計(jì)算機(jī)執(zhí)行指令的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，用于基于基因型分型數(shù)據(jù)確定單倍型。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含專門設(shè)計(jì)的用于從單細(xì)胞或少量細(xì)胞收集一組染色體用于單倍型讀取和染色體生物檢查的裝置。在一個(gè)實(shí)施方案中，將單倍切割方法用在產(chǎn)前診斷學(xué)中，用于檢測(cè)胎兒的重要基因型缺陷。已經(jīng)了解到一些胎兒細(xì)胞在母體外周血中循環(huán)。因此，可以從懷孕的母體血液收集胎兒細(xì)胞。使用上述的方法可以對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行單倍型分析。由于通常是單倍型(不同基因型等位基因的組合)引起疾病，通過單倍型確定的產(chǎn)前診斷會(huì)比基因型確定的產(chǎn)前診斷更精確。本發(fā)明的單細(xì)胞特性為母體血液中胎兒細(xì)胞的單倍型確定提供可行性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將單倍切割方法用在個(gè)性化用藥中。個(gè)性化用藥是醫(yī)生基于人具體的遺傳變異定制治療的實(shí)踐。例如，服用同一抗高血壓藥物的兩人可能有截然不同的反應(yīng)。一名可能具有嚴(yán)重的，甚至威脅生命的副作用，而另一名經(jīng)歷較少甚至沒有副作用，并且似乎順利通過了所述治療。兩人對(duì)同一藥物會(huì)有如此大不同反應(yīng)的原因在于他們的基因。人們遺傳他們的基因中變異，并且即使微小的變異都可能會(huì)對(duì)人患有的同一疾病亞型以及人對(duì)某些藥物如何響應(yīng)產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。在個(gè)性化用藥中，臨床中目前的方法開始改變。在患者服用單一劑量的藥物之前， 可以對(duì)患者進(jìn)行血液化驗(yàn)以確定遺傳變異。所述化驗(yàn)可以表明該患者的可能對(duì)某一藥物具有不利影響的變異。醫(yī)生可以決定藥物處方和劑量，以便與患者的遺傳學(xué)匹配。因此，特有的遺傳譜能幫助醫(yī)生對(duì)患者進(jìn)行個(gè)性化地治療，改善藥物開發(fā)以及降低醫(yī)療成本。目前廣泛接受多-SNP單倍型比單-SNP基因型更能精確地代表人類的基因型。然而，沒有直接讀取單倍型的簡(jiǎn)單、廉價(jià)且高通量的實(shí)驗(yàn)方法。統(tǒng)計(jì)的單倍型構(gòu)型引起諸多歧義。該技術(shù)瓶頸不僅限制發(fā)現(xiàn)引起常見疾病的遺傳基礎(chǔ)的努力，而且它還限制遺傳檢驗(yàn)在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用。單倍切割方法可以解決該技術(shù)瓶頸。例如，在患者服用任何藥物之前，從他的口中收集少量細(xì)胞，并通過使用本方法確定那些疾病突變的單倍型。醫(yī)生將開出與患者特有的遺傳譜相匹配的某劑量的藥物，以進(jìn)行個(gè)性化治療。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將單倍切割方法用在法醫(yī)檢驗(yàn)中。在法醫(yī)研究中、在性侵犯和其他犯罪的任何情況以及親子鑒定中，準(zhǔn)確的單倍型分型比單個(gè)SNP基因型分型提供更高的精確度。在諸多法醫(yī)檢驗(yàn)的情況中，可用的樣本量非常有限。由于我們發(fā)明的單細(xì)胞特性以及本技術(shù)得出的準(zhǔn)確的單倍型結(jié)果，使得單倍切割方法會(huì)通式增加敏感度和精確度。通過下面實(shí)施例進(jìn)一步說明了本發(fā)明，不應(yīng)當(dāng)將下面實(shí)施例理解為限制。通過引用將本申請(qǐng)所引用的所有參考文獻(xiàn)、專利和公開的專利申請(qǐng)的內(nèi)容，以及圖形和表格并入本文。
實(shí)施例實(shí)施例1 細(xì)胞的制備I.樣品收集從人體收集血液并分離淋巴細(xì)胞。II.細(xì)胞培養(yǎng)將淋巴細(xì)胞培養(yǎng)于含15% FBS和100單位/ml青霉素/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中。III.細(xì)胞裂解1.在增殖階段，將植物凝集素添加至細(xì)胞培養(yǎng)物。2.在植物凝集素(PHA)處理48小時(shí)后收獲細(xì)胞。3.將溴化乙錠(16. 7 μ g/ml)和 Act-D (6. 7 μ g/ml)添加至細(xì)胞。4.于37°C孵育0. 5小時(shí)。0.5小時(shí)之后，將秋水仙胺(0. 083 μ g/ml)添加至細(xì)胞并于37°C孵育1小時(shí)。5.于 IOOOrpm 離心 10 分鐘。6.吸去所有上清僅留0. 3ml上清，輕輕重懸細(xì)胞團(tuán)。添加預(yù)熱的0. 075mol/L KCl 輕輕渦旋，確保KCl與細(xì)胞團(tuán)混勻。7.處于37°C 20分鐘，并再處于室溫5分鐘。于IOOOrpm離心10分鐘。并移除上清。8.添加冷的固定劑(甲醇乙酸為3 1)，通過顛倒管輕輕混合。9.固定和離心3次后，將細(xì)胞滴加至載玻片，并用吉姆薩(geimesa)染色20分鐘。10.使載玻片在通風(fēng)櫥中風(fēng)干20分鐘。IV.染色體分離1.打開激光，顯微鏡(Leica，ASLMD)和計(jì)算機(jī)。將收集器中的PCR管置于固定架上。2.將載玻片置于支架上。3.來到計(jì)算機(jī)屏幕。點(diǎn)擊LEICAADMINISTRATOR開啟程序。4.將物鏡設(shè)至IOX找到細(xì)胞，然后調(diào)至40 X。5.收集染色體隨機(jī)地從每個(gè)細(xì)胞切下并選擇不超過30條染色體。收集4-8個(gè)樣品。每個(gè)樣品含有來自約7-11個(gè)細(xì)胞的染色體。6.退出 LBICA ADMINISTRATOR 程序。7.依次關(guān)掉計(jì)算機(jī)、顯微鏡和激光。實(shí)施例2 全基因組DNA擴(kuò)增單細(xì)胞裂解和斷裂1.使用激光捕捉顯微切割、細(xì)胞分選或其他方法將單細(xì)胞分離進(jìn)準(zhǔn)備進(jìn)行PCR的管中。如果已分選，則緩沖液應(yīng)該是低離子強(qiáng)度的，諸如Tris EDTA(TE)緩沖液，并且是最小的分選體積。2.將充足體積的水添加至單細(xì)胞樣品，使最終體積為9mL。3.通過將2mL的蛋白酶K溶液添加至32mL的10單細(xì)胞裂解&斷裂緩沖液，并完全渦旋來制備工作裂解和斷裂緩沖液。4.將ImL新鮮制備的蛋白酶K溶液-10'單細(xì)胞裂解&斷裂緩沖液添加至單細(xì)胞樣品，并完全混合。5.將DNA混合物于50°C孵育1小時(shí)，然后加熱至99°C，精確地持續(xù)4分鐘。注意所述孵育是十分時(shí)間敏感的，且任何偏差都可能改變結(jié)果。冰上冷卻。在進(jìn)行文庫(kù)制備之前降速旋轉(zhuǎn)樣品。文庫(kù)制備
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6.將2mL的1個(gè)單細(xì)胞文庫(kù)制備緩沖液添加至每個(gè)樣品。7.添加ImL的文庫(kù)穩(wěn)定溶液。8.完全混合并置于熱循環(huán)儀中于95°C持續(xù)2分鐘。9.將樣品于冰上冷卻，通過離心合并樣品，并重新放在冰上。10.添加ImL文庫(kù)制備酶，完全混合，并短暫離心。11.將樣品置于熱循環(huán)儀中，并按下述孵育16°C持續(xù)20分鐘持續(xù)20分鐘；37°C持續(xù)20分鐘；75°C持續(xù)5分鐘；并于 4°C保存。12.將樣品移出熱循環(huán)儀并短暫離心?？梢粤⒓磳?duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)增或于-20°C保存 3天。擴(kuò)增13.將下面試劑添加至全部14M1反應(yīng)7. 5mL 10'擴(kuò)增 Master Mix ；48. 5mL 無核酸酶的水；以及 5. OmL WGADNA 聚合酶。14.完全混合，短暫離心，并開始熱循環(huán)。下面參數(shù)已優(yōu)化用于PE9700或同等的熱循環(huán)儀于95 °C預(yù)變性3分鐘。按下述進(jìn)行35個(gè)循環(huán)于94°C變性30秒；于65°C退火/延伸5分鐘；并于4°C保存。當(dāng)完成循環(huán)后，將反應(yīng)液保持于4°C或保存于_20°C直至準(zhǔn)備分析或純化。WGADNA 的穩(wěn)定性與基因組相當(dāng)。將DNA保存在同等條件下。實(shí)施例3 全基因組基因型分型將擴(kuò)增的DNA進(jìn)行諸如Hap3000K和其他的Illumina高通量全基因組基因型分型。對(duì)于每人，用2-4管樣品進(jìn)行基因型分型，以確保高的基因組覆蓋度并實(shí)現(xiàn)精確復(fù)制。 包括了基因組DNA樣品用于全基因組基因型分型。也可以用其他高通量基因型分型平臺(tái)進(jìn)行本步驟。實(shí)施例4:單倍型確定從Illumina人CNV370_Duo芯片獲得全基因組基因型分型數(shù)據(jù)。使用hfmium.
測(cè)定，該芯片含量覆蓋超過370，000個(gè)標(biāo)記。掃描之后，將所有的數(shù)據(jù)上傳進(jìn)BeacKtudio， 并使用BeacKtudio基因型分型模塊的版本3進(jìn)行分析。在嚴(yán)格的過濾去除缺失基因型的 SNP之后，剩余的SNP可用于分析。將Illumina基因型分型輸出中的θ、R、X和Y值用來確定每個(gè)SNP兩等位基因的相對(duì)比。通過沿著染色體的等位基因比構(gòu)建單倍型。使用專門開發(fā)用于該技術(shù)的軟件“HapReader”進(jìn)行單倍型構(gòu)建。其基本程序和算法如下1)在個(gè)體水平，一個(gè)人接一個(gè)人地進(jìn)行所述分析。沒有來自不同個(gè)體數(shù)據(jù)表的組合。 2)每人會(huì)有3-5張基因型分型數(shù)據(jù)表，一個(gè)數(shù)據(jù)表如果來自基因組DNA，則其他數(shù)據(jù)表來自染色體收集管。從每張Illumia輸出數(shù)據(jù)表提取等位基因讀取(allele calls) 和它們相應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度。
3)基于來自基因組DNA樣品的數(shù)據(jù)表，選擇該人的純合基因座。計(jì)算這些基因座處A、C、G和T平均數(shù)的相對(duì)比。確定A、C、G、T的k值，以對(duì)于給定特定實(shí)驗(yàn)將它們的強(qiáng)度調(diào)至相同的水平。4)使用這些k值，調(diào)整雜合基因座.5)對(duì)于每個(gè)基因座，計(jì)算兩等位基因的比。6)對(duì)于每個(gè)基因座，通過它們的等位基因強(qiáng)度比對(duì)那些兩個(gè)等位基因的順序進(jìn)行整理，以相同的方式對(duì)所有基因座進(jìn)行整理，且將較高強(qiáng)度等位基因保持在A欄而將較低強(qiáng)度等位基因保持在B欄。7)沿著染色體檢查并比較比值，以確定每條染色體中是否有斷點(diǎn)。8)如果在步驟7)中沒有斷點(diǎn)，A欄中的等位基因形成單倍型，且B欄中的等位基因會(huì)形成該人的另一個(gè)單倍型。如果在步驟7)中有斷點(diǎn)，使用來自其他染色體收集管中的結(jié)果搭接所述斷點(diǎn)。本發(fā)明的一方面在于本步驟。通過使用LeicaASLMD激光顯微切割系統(tǒng)的顯微切割將染色體收集進(jìn)PCR管。本步中，不是所有的染色體都從一個(gè)細(xì)胞收集；相反，僅僅一部分(約一半)染色體從任意單個(gè)裂解的細(xì)胞收集(圖幻。對(duì)于任何裂解的細(xì)胞染色體的選擇是隨機(jī)的?？紤]該隨機(jī)收集來自5-11個(gè)隨機(jī)選擇的細(xì)胞。將來自這些5-11個(gè)顯微切割細(xì)胞的所有染色體收集進(jìn)一管中。每人收集4-8管。在該步驟中，通過在計(jì)算機(jī)上選擇激光切割界限保持染色體完整性，所以確保了染色體完整性。使用Sigma GenomePlex WGA-4試劑盒對(duì)每個(gè)PCR管中收集的DNA樣品擴(kuò)增20_24 個(gè)循環(huán)。實(shí)際上，可以使用任何均衡的全基因組擴(kuò)增(WGA)方法進(jìn)行該步驟。這些方法包括但不限于，多重置換擴(kuò)增(MDA，GEHealthcase GenomiPhi和Qiagen R印li_g)、引物延伸預(yù)擴(kuò)增(PEP)、改進(jìn)的引物延伸預(yù)擴(kuò)增(iPEP)和簡(jiǎn)并寡聚核苷酸引物PCR (DOP，Sigma GenomePlex)，Repli-g 禾口 GenomiPhi 產(chǎn)生約 IOkb 大小的產(chǎn)物，而 Sigma GenomePlex 產(chǎn)生約數(shù)百個(gè)堿基對(duì)的產(chǎn)物。實(shí)施例5 使用單細(xì)胞裂解物法確定單倍型使用Leica AS LDM激光顯微切割系統(tǒng)(Leica Microsystems,Germany)從來自人個(gè)體的新鮮細(xì)胞刷-棉簽頰粘膜細(xì)胞分離單細(xì)胞。簡(jiǎn)單而言，將頰粘膜細(xì)胞涂在帶箔的載玻片(固定在標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡載玻片邊緣的矩形的可用于UV切割的箔片)上，風(fēng)干5分鐘，然后進(jìn)行非常短暫的染色。在顯微鏡下檢查該部分，選擇單細(xì)胞，并用激光顯微切割系統(tǒng)將其從帶箔的載玻片切下。將單細(xì)胞收集進(jìn)每管有10 μ 1細(xì)胞裂解緩沖液的管中。然后將每管中的單細(xì)胞裂解物平均分成兩管。將每管中的基因組DNA WGA擴(kuò)增用于基因型分型。使用基因型分型數(shù)據(jù)創(chuàng)建基因組范圍的目錄。使用所述目錄進(jìn)行單倍型確定。實(shí)施例6 使用單細(xì)胞切割方法確定單倍型染色體顯微切割將淋巴細(xì)胞培養(yǎng)于含15% FBS和100單位/ml青霉素/鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。運(yùn)用植物凝集素(PHA)刺激細(xì)胞48小時(shí)，接著添加溴化乙錠 (16. 7 μ g/ml)和放射菌素D (6. 7 μ g/ml)，并于37°C孵育30分鐘。將秋水仙胺(0. 083 μ g/ ml)添加至細(xì)胞，并于37°C孵育1小時(shí)。通過在1，OOOrpm離心10分鐘收集細(xì)胞，重懸，在預(yù)熱的0. O75mol/LKC1中于37°C孵育20分鐘，然后于室溫5分鐘。用冷的固定劑(甲醇 乙酸為3 1)固定后，將細(xì)胞滴加至載玻片破裂細(xì)胞核，隨后用吉姆薩染色20分鐘。使用激光顯微切割顯微鏡(ASLMD，Leica，Germany)收集一個(gè)細(xì)胞的染色體的一半。全基因組擴(kuò)增(WGA)通過Sigma GenomePlex WGA4試劑盒按照制造商的說明書對(duì)收集的染色體進(jìn)行擴(kuò)增。簡(jiǎn)單而言，將樣品在裂解和斷裂緩沖液中于50°C孵育1小時(shí)，然后加熱至99°C持續(xù)4分鐘。然后將單細(xì)胞文庫(kù)制備緩沖液和文庫(kù)穩(wěn)定溶液添加至樣品于 95°C孵育2分鐘。用下面循環(huán)制備文庫(kù)16°C持續(xù)20分鐘、24°C持續(xù)20分鐘、37°C持續(xù)20 分鐘、75°C持續(xù)5分鐘。通過95°C預(yù)變性3分鐘，隨后94°C /30秒和65°C /5分鐘進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增。通過QIAquick PCR純化試劑盒純化擴(kuò)增的DNA?；蛐头中褪褂肐llumina人CNV370-Quad芯片進(jìn)行基因型分型。該芯片含有包括SNP和拷貝數(shù)變異(CNV)標(biāo)記在內(nèi)的約370，000個(gè)標(biāo)記。將用Qiagen試劑盒提取的三個(gè)獨(dú)立的顯微切割的樣品和一個(gè)基因組樣品進(jìn)行基因型分型實(shí)驗(yàn)。掃描之后，將所有的數(shù)據(jù)上傳進(jìn)BeacKtudio，并使用BeacKtudio基因型分型模塊的版本3進(jìn)行分析。無讀取閾值設(shè)置為默認(rèn)值(0. 15)。數(shù)據(jù)分析從國(guó)際人類基因組單倍型圖計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(kù)(International HapMap Project database)(階段(Phase) 2 公開發(fā)行(Public Release) #22 和階段 3 公開發(fā)行 #1， 階段2+3發(fā)行#27)檢索到GM 10847和他父母的非定相的基因型(GM和GM)。還從Illumina 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到GM10847的非定相的基因型。通過按照孟德爾遺傳定律確定每個(gè)等位基因的親本來源來用GM10847的親本基因型計(jì)算地重建GM10847的單倍型。在數(shù)據(jù)分析中，僅將 GM10847的那些雜合基因座進(jìn)行單倍型確定。排除了純合基因座，因?yàn)樗鼈儧]有單倍型分型問題(已知相)。排除了 Illumina基因型分型輸出中兩個(gè)等位基因強(qiáng)度都在1，000以下的等位基因讀取。從UCSC基因組瀏覽器(UCSC Genome Browser)(人類2006三月組裝)檢索基因組范圍的ItepeatMasker檢測(cè)。用SAS9. 1進(jìn)行所有的數(shù)據(jù)整合。通過三組獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)用HapMap計(jì)劃(國(guó)際人類基因組單倍型圖協(xié)作組2003)招募的個(gè)體GM10847檢驗(yàn)單倍型分型方法。接著上述程序之后，我們將顯微切割樣品的基因型讀取與基因組DNA的基因型讀取以及從國(guó)際人類基因組單倍型圖計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(kù)(階段2公開發(fā)行#2 下載數(shù)據(jù)的基因型讀取進(jìn)行比較。通過染色體范圍的雜合讀取是否轉(zhuǎn)變?yōu)轱@微切割樣品中的純合讀取來指示每個(gè)樣品中每條染色體的單染色體狀態(tài)、二染色體狀態(tài)和零染色體狀態(tài)(圖8)。發(fā)現(xiàn)樣品1成功地以染色體2、4、6、15、16、17、18和20為單倍型；樣品2以染色體lq、3、4、5、10、16、17、18、20和21為單倍型；樣品3以染色體3、7、9和20為單倍型。共定相了 24，481個(gè)雜合基因座。通過復(fù)制并與使用孟德爾遺傳定律下的三重結(jié)構(gòu)從非定相的基因型所決定的單倍型(HapMap階段2公開發(fā)行#22)進(jìn)行比較來確定本方法的精確度(Hodge SE, et al,Nat Genet, 21 (4) :360-1 ； 1999)。在用我們的7DDNA單倍型分型方法成功定相的那些M，245個(gè) SNP基因座之中，464個(gè)SNP基因座沒有被HapMap階段2基因型數(shù)據(jù)覆蓋，4，744個(gè)SNP由于全部3倍雜合子沒有來自HapMap基因型的明確的單倍型，并且142個(gè)SNP由于HapMap2 中丟失的數(shù)據(jù)沒有被定相。所以我們?cè)谖覀兊膯伪缎秃虷apMap2來源的單倍型之間比較了 18，895個(gè)SNP基因座。當(dāng)與通過HapMap三重結(jié)構(gòu)所決定的單倍型比較時(shí)，有18，625個(gè) SNP (98. 57%)顯示出一致的等位基因相。在那些270個(gè)不一致的SNP基因座中，45個(gè)SNP 基因座是由于與階段3基因型讀取比較HapMap階段2基因型分型錯(cuò)誤，并且103個(gè)基因座有如ItepeatMasker所檢測(cè)的各種重復(fù)。除了由ItepeatMasker所識(shí)別的那些之外其他的不一致性可潛在地歸于全基因組擴(kuò)增錯(cuò)誤、基因型分型錯(cuò)誤或的未評(píng)注部分的復(fù)制。通過 2，089次復(fù)制直接地進(jìn)一步確定精確度，其中2，065個(gè)SNP表現(xiàn)出一致的結(jié)果，它們中沒有不一致的單倍型，且盡管整個(gè)染色體表現(xiàn)出不一致性(表基因座在復(fù)制物之一中具有二倍體等位基因讀取，估計(jì)有98. 85%的精確率。
表1通過數(shù)據(jù)再現(xiàn)估計(jì)精確率
權(quán)利要求
1.對(duì)個(gè)體進(jìn)行分子單倍型分型的方法，所述方法包括在所述個(gè)體多個(gè)裂解的二倍體細(xì)胞的每一個(gè)細(xì)胞中隨機(jī)選擇一組染色體； 將從所述多個(gè)細(xì)胞選擇的染色體收集進(jìn)多個(gè)樣品管中，其中每個(gè)樣品管含有選自一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的染色體；對(duì)每個(gè)樣品管中的基因組DNA進(jìn)行基因型分型；和基于來自基因型分型數(shù)據(jù)的等位基因核苷酸序列信息和相應(yīng)的核苷酸信號(hào)強(qiáng)度來確定等位基因的單倍型。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述確定步驟包括從基因型分型數(shù)據(jù)提取等位基因核苷酸序列信息和相應(yīng)的核苷酸信號(hào)強(qiáng)度； 計(jì)算每個(gè)雜合基因座處兩個(gè)等位基因的核苷酸信號(hào)強(qiáng)度比(等位基因強(qiáng)度比)；和確定等位基因的單倍型。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述計(jì)算步驟包括 計(jì)算純合基因座處核苷酸A、C、G和T的相對(duì)比。確定每種核苷酸的k值，以將它們的信號(hào)強(qiáng)度調(diào)到相同的水平； 使用所述k值調(diào)整雜合基因座處的核苷酸信號(hào)強(qiáng)度；和計(jì)算雜合基因座處的等位基因強(qiáng)度比。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，所述方法還包括通過等位基因強(qiáng)度比對(duì)每個(gè)基因座處的等位基因順序進(jìn)行整理； 將較高強(qiáng)度等位基因保持在第一欄而將較低強(qiáng)度等位基因保持在第二欄；和確定每條染色體中是否有斷點(diǎn)，如果在染色體中沒有斷點(diǎn)，用第一欄中的等位基因形成一個(gè)單倍型，且用第二欄中的等位基因形成另一個(gè)單倍型，如果在染色體中有斷點(diǎn)，使用來自其他染色體收集管中的結(jié)果搭接所述斷點(diǎn)。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中將來自2-10個(gè)隨機(jī)選擇的細(xì)胞的染色體收集進(jìn)每個(gè)樣品管中。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中一共收集了4-8個(gè)樣品管。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述基因型分型步驟包括擴(kuò)增基因組DNA。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述個(gè)體是哺乳動(dòng)物。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
10.對(duì)個(gè)體進(jìn)行分子單倍型分型的方法，其包括 從所述個(gè)體分離一個(gè)或多個(gè)單個(gè)的二倍體細(xì)胞；對(duì)來自個(gè)體的每個(gè)分離的單個(gè)的二倍體細(xì)胞進(jìn)行裂解以產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)單細(xì)胞裂解物；將每個(gè)單細(xì)胞裂解物分成兩等份； 對(duì)每等份中的基因組DNA進(jìn)行基因型分型； 創(chuàng)建來自所有等份的基因型分型數(shù)據(jù)的目錄；和基于所述目錄確定所述個(gè)體的染色體單倍型。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述分離步驟包括從所述個(gè)體分離4-12個(gè)單個(gè)的二倍體細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述分離步驟包括從所述個(gè)體分離6-10個(gè)單個(gè)的二倍體細(xì)胞。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述分離步驟包括從所述個(gè)體分離8個(gè)單個(gè)的二倍體細(xì)胞。
14.如權(quán)利要求10所述的方法，所述基因型分型步驟包括擴(kuò)增基因組DNA。
15.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述個(gè)體是哺乳動(dòng)物。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
17.對(duì)個(gè)體進(jìn)行分子單倍型分型的方法，所述方法包括 從所述個(gè)體分離單個(gè)的二倍體細(xì)胞；對(duì)所述分離的單個(gè)的二倍體細(xì)胞進(jìn)行裂解和染色以展示染色體； 通過激光顯微切割從單細(xì)胞收集一組染色體； 對(duì)所收集的染色體中的基因組DNA進(jìn)行基因型分型；對(duì)來自相同個(gè)體的一個(gè)或多個(gè)完整的二倍體細(xì)胞的基因組DNA進(jìn)行基因型分型；和確定染色體收集組中的染色體的單倍型，其中所述染色體以單倍體形式存在于所述染色體收集組中。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中重復(fù)所述分離步驟、裂解步驟和收集步驟一次或多次，以確定所述個(gè)體每條染色體的單倍型。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中重復(fù)所述分離步驟、裂解步驟和收集步驟足夠多的次數(shù)，以便所述個(gè)體基因組中的每條染色體以大于99%的概率存在于單倍體形式中。
20.如權(quán)利要求17所述的方法，所述基因型分型步驟包括擴(kuò)增基因組DNA。
21.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述個(gè)體是哺乳動(dòng)物。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
23.用于單倍切割的測(cè)定試劑盒，其包含 用于細(xì)胞收集和細(xì)胞發(fā)生染色的試劑；和用于基因組DNA擴(kuò)增和基因組基因型分型的試劑。
24.如權(quán)利要求23所述的測(cè)定試劑盒，其還包含操作手冊(cè)。
25.如權(quán)利要求23所述的測(cè)定試劑盒，其還包含具有計(jì)算機(jī)執(zhí)行指令的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，用于基于基因型分型數(shù)據(jù)確定單倍型。
26.用于實(shí)施權(quán)利要求1的方法的具有計(jì)算機(jī)執(zhí)行指令的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。
27.用于實(shí)施權(quán)利要求10的方法的具有計(jì)算機(jī)執(zhí)行指令的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。
28.用于實(shí)施權(quán)利要求17的方法的具有計(jì)算機(jī)執(zhí)行指令的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。
全文摘要
公開了對(duì)個(gè)體進(jìn)行分子單倍型分型的方法。所述方法包括在個(gè)體多個(gè)裂解的二倍體細(xì)胞的每一個(gè)細(xì)胞中隨機(jī)選擇一組染色體；將從所述多個(gè)細(xì)胞選擇的染色體收集進(jìn)多個(gè)樣品管中，其中每個(gè)樣品管含有選自一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的染色體；對(duì)每個(gè)樣品管中的基因組DNA進(jìn)行基因型分型；以及基于來自基因型分型數(shù)據(jù)的等位基因核苷酸序列信息和相應(yīng)的核苷酸信號(hào)強(qiáng)度來確定等位基因的單倍型。還公開了使用單細(xì)胞裂解物或單細(xì)胞顯微切割進(jìn)行分子單倍型分型的其他方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102203285SQ200980141955
公開日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2009年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月21日
發(fā)明者宋清, 肖燕, 馬麗 申請(qǐng)人:莫爾豪斯醫(yī)學(xué)院