專利名稱：一種哈薩克綿羊抗包蟲病基因單倍型篩選方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種哈薩克綿羊抗包蟲病基因單倍型篩選方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
包蟲病(細(xì)粒棘球蚴病)是世界性的人畜共患病，分布十分廣泛。新疆是中國(guó)包 蟲病高發(fā)地區(qū)之一，綿羊包蟲感染率在38. 89%-61. 25%。哈薩克綿羊是新疆地方綿羊品 種，耐粗飼，抗病性強(qiáng)，具有良好的產(chǎn)肉性能。而包蟲病的流行嚴(yán)重地影響了新疆養(yǎng)羊業(yè)的 發(fā)展，同時(shí)也影響著農(nóng)牧民生活質(zhì)量的提高。近年來(lái)，MHC作為疾病抗性和易感性的候選基因成為研究抗病育種的熱點(diǎn)hot spot。組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，簡(jiǎn)稱MHC)是識(shí)別自身與 非自身抗原免疫反應(yīng)的多基因家族，可調(diào)控機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞免疫與體液免疫。MHC的等位基因 與基因型存在豐富的多樣性，研究表明MHC-DRB1基因第2外顯子位點(diǎn)已發(fā)現(xiàn)80多個(gè)等位 基因。MHC基因多態(tài)性與疾病之間的關(guān)系首先發(fā)現(xiàn)于雞的皰疹病毒馬立克，以及雞的勞斯 (氏)肉瘤病毒。Sayers G等研究發(fā)現(xiàn)薩?？搜蚝吞杖匮虻腗HC-DRB1基因多態(tài)性與線 蟲感染具有遺傳抗性關(guān)系。參考文獻(xiàn)[l]Rausch,R. L. ,1995. Life cycle patterns and geographic distribution of Echinococcusspecies. In Thompson, R. C. A. , Lymbery, A. J. (Eds.), Echinococcus and hydatid disease CABInternational, Oxon, UK.[2] Andersen, F. L. , Ouhelli, H. , Kashani, M. , 1997. Compendium on cysticechinococcosis. Brigham Young University, Provo, UT 84602, USA.[3]Eckert, J.and Deplazes, P. , 2004.Biological, Epidemiological, and Clinical Aspects ofEchinococcosis, a Zoonosis of Increasing Concern. Clin. Microbiol. Rev. , 17(1) :107-135.[4]Dalimi A. ,Motamedi G. , Hosseini M. ,Mohammadian B. , Malaki H. ,Ghamari Z.andGhaffari F. F. ,2002. Echinococcosis/hydatidosis in western Iran.Vet. Parasito 1. 105(2) :161_171.[5] Jenkins, D. J. , Romig, T. , Thompson, R. C. A. 2005. Emergence re-emergence ofEchinococcus spp. a global update. Int. J. Parasitol. 35 :1205-1219.[6]李巖，閆江林，李靜.新疆綿羊棘球蚴病流行情況調(diào)查分析[J].石河子大學(xué)學(xué) 報(bào)(自然科學(xué)版)，2005，23(1).[7]阿德力，阿依古麗，陳衛(wèi)國(guó).哈薩克羊品種資源及利用建議.新疆畜牧業(yè) 2009，1 48-49.[8]Klein J (1986)Natural history of the major histocompatibility complex. Wiley, NewYork.[9]Sayers G,Good B,Hanrahan J P et al. Major histocompatibility complexDRB1 gene its role in nematode resistance in Suffolk and Texel sheep breeds[J]. Parasitology 2005，131 (3) :403 409.[10]Briles WE, Stone HA, Cole RK(1977)Marek' s disease :effects of Bhistocompatibility alloalleles in resistant and susceptible chicken lines. Science 195:193-195.[ll]Longenecker BM, Gallatin WM(1978)Genetic control of resistance to Marek，sdisease. IARC Sci Publ 24(Pt 2) :845-850.[12] Schierman Lff, Collins WM (1987) Influence of the major histocompatibilitycomplex on tumor regression and immunity in chickens.Poult Sci 66 :812-818.[13]Kaufman J, Venugopal K (1998)The importance of MHC for Rous sarcoma virusand Marek' s disease virus-some Payne-ful considerations. Avian Pathol 27 S82-S87.[14]劉云芳，高建峰，潘曉亮等.綿羊全血中DNA的微量提純[J].石河子大學(xué)學(xué) 報(bào)，1997，1(2) 136 138.[15]Konnai, S. , Nagaoka, Y. , Takesima, S. , Onuma, M. and Aida, Y. (2003b). Technicalnote :DNA typing for ovine MHC DRB1 using polymerase chain reaction-restrictionfragment length polymorphism(PCR-RFLP). Journal of Dairy Science 86,3362-3365.[16]Dematteis S, Rottenberg M, BazA. Cytokine response and outcome of infectiondepends on the infective dose of parasites in experimental infection by Echinococcusgranulosus. Parasite Immunology,2003, 25 :189 219.[17]Menkir M, Sissay, Arvid Uggla. Prevalence and seasonal incidence of larval and adultcestode infections of sheep and goats in eastern Ethiopia. Trop Anim Health Prod(2008)40 :387_394.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種哈薩克綿羊抗包蟲病基因單倍型篩選方 法及其應(yīng)用。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種哈薩克綿羊抗包蟲病基因單倍型篩選方法，包括以下步驟(1)、樣品采集和 綿羊基因組DNA的提取選擇北疆的哈薩克綿羊羊場(chǎng)，利用綿羊包蟲病ELISA診斷試劑盒 進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，隨機(jī)采集未感染包蟲病綿羊血樣400只，采集感染包蟲病綿羊血樣302 只，所采血樣提取基因組DNA ； (2)引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增對(duì)哈薩克綿羊MHC-DRB1基因外 顯子2進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)，兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系都為20 y L 第1輪擴(kuò)增反應(yīng)包括模板 基因組 DNAlOOng, 1. 5mmol/LMgCl2,120 u mol/L dNTP,引物 0LA-ERB1 5 ' -CCG GAA TTC CCG TCT CTG CAG CAC ATT TCT T_3 ‘和引物 0LA-HL031 :5' -TTT AAA TTC GCG CTC ACC TCG CCG CT-3'分別為0. 2 u mol/L, Taq酶1. 5U ；PCR反應(yīng)優(yōu)化條件為94°C預(yù)變性 5min — 15X (94°C，30s — 50°C，30s — 72°C，45s) — 72°C lOmin ；PCR 產(chǎn)物用 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；第2輪擴(kuò)展反應(yīng)取第1輪PCR產(chǎn)物3 μ L為模板，引物OLA-ERBl 5 ‘ -CCG GAA TTC CCG TCT CTG CAG CAC ATT TCTT-3‘和引物0LA-XRBI 5' -AGC TCG AGC GCT GCA CAG TGA AAC TC-3')分別為0. 1 μ mol/L,MgCl2, dNTPs和Taq酶的濃度同第1輪擴(kuò)增；反 應(yīng)條件為 94°C預(yù)變性 5min —30X (94°C, 30s 63V, 30s 72V, 45s) —72°C IOmin ； (3)、 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)及酶切第2輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行HinlI、MvaI、HaeIII、ScaI和SacII 限制性內(nèi)切酶的單酶切，酶切反應(yīng)體系為20yL，每種內(nèi)切酶用量均為5個(gè)單位，每個(gè)體系 中第2輪PCR產(chǎn)物為10 μ L，10 X Buffer 2 μ L，加入雙蒸水至20 μ L ； (4)、進(jìn)行MHC-DRB1單 倍型分型和遺傳分析，篩選出抗包蟲病的基因單倍型Mvalbc-SacIIab-Hinllab ;(5)根據(jù) 篩選出的抗包蟲病的基因單倍型與非抗包蟲病的基因單倍型，對(duì)哈薩克綿羊進(jìn)行組群，選 取抗性組與非抗性組基因單倍型各8只綿羊，進(jìn)行人工感染攻蟲驗(yàn)證試驗(yàn)；結(jié)果顯示抗性 組中有1只感染包蟲病，非抗性組中有6只感染包蟲病，抗性組與非抗性組包蟲病感染率差 異顯著；從而驗(yàn)證了哈薩克綿羊MHC-DRBl外顯子2的Mvalbc-SacIIab-Hinllab為抗包蟲 病的基因單倍型。一種權(quán)利要求1所述的抗包蟲病基因單倍型Mvalbc-SacIIab-Hinllab在對(duì)哈薩 克綿羊進(jìn)行抗包蟲病新品系標(biāo)記輔助選擇、選育中的應(yīng)用。本試驗(yàn)采用PCR-RFLP方法對(duì)哈薩克綿羊MHC-DRBl基因的多態(tài)性進(jìn)行了檢 測(cè)，分析了該多態(tài)性與包蟲病遺傳抗性之間的關(guān)系，篩選出并驗(yàn)證了 MHC-DRBl基因 Mvalbc-SacIIab-Hinllab單倍型為包蟲病抗性單倍型，從而為快速、準(zhǔn)確地培育抗包蟲病 新品系打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，將促進(jìn)新疆養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。


圖1哈薩克綿羊MHC-DRBl基因外顯子2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果，1到10號(hào)泳道 為 PCR 產(chǎn)物，M 為 PUC19DNA marker ；圖2哈薩克綿羊MHC-DRBl基因外顯子2的SacI酶切M. pucl9DNA marker ；圖3哈薩克綿羊MHC-DRBl基因外顯子2的HinlI酶切M. pucl9DNA marker ；圖4哈薩克羊MHC-DRBl基因第2外顯子MvaI酶切的檢測(cè)M :puc 19DNA marker ；圖5哈薩克綿羊MHC-DRBl基因第2外顯子SacII酶切的檢測(cè)M. pucl9DNAmarker ；圖6哈薩克綿羊MHC-DRBl基因第2外顯子HaeIII酶切的檢測(cè)M. pucl9DNAmarker ； 圖7為本發(fā)明篩選方法的技術(shù)路線圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。1材料和方法1. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)中所有的哈薩克綿羊均來(lái)自新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)四師74團(tuán)，其中包蟲病檢 測(cè)呈陰性羊400只，陽(yáng)性羊302只。頸靜脈采血10mL，ACD(檸檬酸鈉檸檬酸葡萄糖= 1. 32g 0. 32g 1. 47g/100mL)抗凝，-20°C保存。1. 2主要藥品與試劑限制性內(nèi)切酶、瓊脂糖、dNTP、pUC19DNA marker, Tris飽和酚、蛋白酶K、引物以及Taq酶等均為上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。1. 3實(shí)驗(yàn)方法(技術(shù)路線參考圖7)1. 3. 1綿羊包蟲病的診斷采用綿羊包蟲病ELISA診斷試劑盒(深圳康百得公司) 進(jìn)行檢測(cè)，按照診斷試劑盒說(shuō)明書的步驟操作。1.3. 2綿羊基因組DNA的提取從凍存抗凝全血中提取基因組DNA[14]，TE溶 解，-20°C保存。1. 3. 3引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增引物序列是參照Kormai[15]等的報(bào)道，對(duì)哈薩克綿羊 MHC-DRBl基因外顯子2進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)，兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系都為20 μ L。第1輪擴(kuò)增反 應(yīng)包括模板基因組 DNAlOOng, 1. 5mmol/LMgCl2,120 μ mol/L dNTP，引物 0LA-ERB1 (5' -CCG GM TTC CCG TCT CTG CAG CAC ATT TCT T_3')和引物0LA-HL031 (5' -TTT AM TTC GCG CTC ACC TCG CCG CT-3')分別為 0. 2 μ mol/L, Taq 酶 1. 5U ；PCR 反應(yīng)優(yōu)化條件為94°C預(yù) 變性 5min — 15 X (94°C，30s — 50°C，30s — 72°C，45s) — 72°C IOmin0 PCR 產(chǎn)物用 1· 5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。第2輪擴(kuò)展反應(yīng)取第1輪PCR產(chǎn)物3 μ L為模板，引物OLA-ERBl和 引物 OLA-XRBI (5 ‘ -AGC TCG AGC GCT GCA CAGTGA AAC TC-3 ‘)分別為 0. 1 μ mol/L， MgCl2, dNTPs和Taq酶的濃度同第1輪擴(kuò)增；反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min — 30X (94°C, 30s — 63°C，30s — 72°C，45s) — 72°C IOmin0 1. 3. 4PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)及酶切第 2 輪 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行HinlI、MvaI, HaeIII、ScaI和SacII限制性內(nèi)切酶的單酶切，酶切反應(yīng)體系 為20 μ L，每種內(nèi)切酶用量均為5個(gè)單位，每個(gè)體系中PCR產(chǎn)物為10 μ L，10 X Buffer 2 μ L， 加入雙蒸水至20 μ L。優(yōu)化后的酶切反應(yīng)條件及最適濃度的瓊脂糖電泳檢測(cè)見表1。表1. PCR產(chǎn)物的酶切及檢測(cè)條件
內(nèi)切酶溫度(V )時(shí)間(h)凝膠濃度(% )酶切位點(diǎn)SacI3742. 5GAGCT*CHinlI3742. 5G(G/A)*CG (CT) CHaeIII3743. 0GG*CCSacII3742. 5CCGOGGMvaI3742. 5CC* (A/T)GG注*表示酶切位點(diǎn)；/表示識(shí)別A或T ;N表示識(shí)別A，C，T或G。1.3. 5數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用X2檢驗(yàn)法分析不同單倍型與包蟲病抗 性相關(guān)分析，用X2適合性檢驗(yàn)法分析哈薩克綿羊MHC-DRBl基因外顯子2是否處于 Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。其余的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析都用t檢驗(yàn)。2 結(jié)果2. IPCR擴(kuò)增結(jié)果利用引物OLA-ERBl，0LA-HL031和0LA-XRBI對(duì)哈薩克綿羊的MHC-DRBl基因外顯 子2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到了 1條296bp的特異性條
6帶(見圖1)。2. 2PCR-RFLP 結(jié)果參照Kormai等[16]報(bào)道的基因酶切圖譜、等位基因的命名方法，酶切產(chǎn)物用相應(yīng) 濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，利用凝膠成像系統(tǒng)分析軟件，對(duì)哈薩克綿羊MHC-DRBl基因 PCR-RFLP后的電泳檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判型。得到如下結(jié)果內(nèi)切酶SacI酶切后出現(xiàn)了 3種基因型aa，ab和bb。3種基因型酶切片斷大小分 別為aa(296bp)，ab(296bp/208bp/88bp)和 bb (208bp/88bp)。表明 SacI 酶切位點(diǎn)上 DRBl 基因由一對(duì)等位基因(a、b)控制(見圖2)。切酶HinlI酶切后出現(xiàn)了 3種基因型aa，ab和bb。3種基因型酶切片斷大小分別 為aa(296bp)、ab (296bp/178bp/118bp)和 bb (178bp/118bp)。表明了 HinlI 酶切位點(diǎn)上 DRBl基因由一對(duì)等位基因(a、b)控制(見圖3)。內(nèi)切酶MvaI酶切后出現(xiàn)了 3種基因型bb，be和cc，酶切片斷大小分別為 bb(123bp/87bp/86bp)、be (210bp/123bp/87bp/86bp)和 cc (210bp/86bp)。表明了 DRBl 基 因在MvaI酶切位點(diǎn)上由一對(duì)等位基因b和c控制(見圖4)。內(nèi)切酶SacII酶切后出現(xiàn)了 3種基因型aa，ab和bb。3種基因型酶切片斷大小分 別為:aa(296bp)、ab (296bp/229bp/69bp)和 bb (229bp/69bp)。表明了 SacII 酶切位點(diǎn)上 DRBl基因由一對(duì)等位基因(a、b)控制(見圖5)。內(nèi)切酶HaeIII酶切后出現(xiàn)了 16種基因型(見表2)，由a，b，c，d，e和f這6個(gè)等 位基因控制。部分基因型酶切圖譜(見圖6)。經(jīng)軟件分析，內(nèi)切酶在該目的片段內(nèi)具有19種基因型，但在本次試驗(yàn)中只發(fā)現(xiàn)16 禾中，分別為:aa, ab, ac, ad, ae, af, be, cc, ce, cf, dd, de, df, ee, ef 禾口 , HaeIII 醇切位點(diǎn) 上DRBl基因由a，b，c，d，e和f這6個(gè)等位基因控制。表2哈薩克綿羊MHC-DRBl基因第二外顯子PCR-RFLP基因型 對(duì)MHC-DRBl基因進(jìn)行PCR-RFLP，經(jīng)5種內(nèi)切酶酶切后所得的等位基因進(jìn)行克隆測(cè) 序，測(cè)得的片段大小與預(yù)期分析結(jié)果相同。2. 3 X2適合性檢驗(yàn)結(jié)果采用X2適合性檢驗(yàn)法分析了哈薩克綿羊MHC-DRBl基因外顯子2是否處于平衡 狀態(tài)。分析發(fā)現(xiàn)，哈薩克綿羊在5個(gè)限制性內(nèi)切酶MvaI、SacI, SacII、HinlI和HaeIII酶 切位點(diǎn)的 X2 值分別是 173. 8461616 (P < 0. 01) ,9. 235968796 (P < 0. 01) ,0. 326943956 (P > 0. 05)，5. 841046027 (P > 0. 05)和 633. 1948021 (P < 0.01)。結(jié)果表明，哈薩克綿羊在 SacII、HinlI位點(diǎn)已經(jīng)達(dá)到Hardy-Weinberg平衡，而在MvaI、SacI和HaeIII這三個(gè)酶切 位點(diǎn)上沒有達(dá)到平衡。2. 4MHC-DRB1基因多態(tài)性與包蟲病的抗性關(guān)聯(lián)分析MHC-DRBl基因在包蟲病陽(yáng)性和陰性哈薩克綿羊中具有相似的等位基因類型，將 它們之間的等位基因頻率進(jìn)行差異顯著分析(t檢驗(yàn))，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，哈薩克綿羊中Mvalbc、 Hinllab、HaeIIIdcU Haelllde、HaeIII df 和 SacIIab (P < 0. 01)在包蟲病陰性羊中較 多，推測(cè)是包蟲病的抗性基因型。MMvaIbb, SacIIaa, Hinllbb, HaeIIIef (P < 0. 01)和 HaeIIIab(P<0. 05)在包蟲病陽(yáng)性羊中較多，推測(cè)是包蟲病的易感基因型。(見表3)表3包蟲病陰性和陽(yáng)性哈薩克綿羊MHC-DRBl基因的基因型頻率 注包蟲病陰性與陽(yáng)性哈薩克綿羊MHC-DRBl相同基因型間，*P < 0. 05廣P < 0. 01
2. 5人工感染攻蟲驗(yàn)證試驗(yàn)對(duì)篩選出的包蟲病抗性基因型進(jìn)行MHC-DRBl基因單倍型分析，發(fā)現(xiàn)單倍型 Mvalbc-SacIIab-HinlIab在包蟲病陰性羊中高于陽(yáng)性羊(P < 0. 01)(見表4)，為驗(yàn)證單 倍型Mvalbc-SacIIab-Hinllab為抗包蟲病的基因單倍型，進(jìn)行了人工感染攻蟲驗(yàn)證試 驗(yàn)。選取經(jīng)包蟲病ELISA試劑盒檢測(cè)陰性健康并具有單倍型Mvalbc-SacIIab-Hinllab 的8只兩周歲哈薩克綿羊作為試驗(yàn)組，單倍型(SacIIab-Hinllab, MvaIbc-HinlIab, MvaIbc-SacIlab)與包蟲病抗性或易感性無(wú)關(guān)的8只兩周歲健康哈薩克綿羊作為對(duì)照組進(jìn) 行人工攻蟲試驗(yàn)。試驗(yàn)羊在相同飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下同群飼養(yǎng)，每只羊經(jīng)口服20只具有孕卵節(jié) 片的成蟲。表4哈薩克綿羊MHC-DRBl基因不同單倍型與包蟲病抗性相關(guān)分析 注:Χ2> X2o olil = 6. 63，P < 0. 01. X2 > X2a05il = 3. 84，P < 0. 05.X2 < X20 05il = 3. 84，P > 0. 01. *P < 0. 05，**P < 0. 01感染包蟲病20天后，原頭蚴發(fā)育為包囊[16]。本發(fā)明在攻蟲4個(gè)月后，屠宰全部試應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)上述說(shuō)明加以改進(jìn)或變換， 而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種哈薩克綿羊抗包蟲病基因單倍型篩選方法，其特征在于，包括以下步驟(1)、樣品采集和綿羊基因組DNA的提取選擇北疆的哈薩克綿羊羊場(chǎng)，利用綿羊包蟲病ELISA診斷試劑盒進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，隨機(jī)采集未感染包蟲病綿羊血樣400只，采集感染包蟲病綿羊血樣302只，所采血樣提取基因組DNA；(2)引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增對(duì)哈薩克綿羊MHC DRB1基因外顯子2進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)，兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系都為20μL第1輪擴(kuò)增反應(yīng)包括模板基因組DNA100ng，1.5mmol/LMgCl2，120μmol/L dNTP，引物OLA ERB15′ CCG GAA TTC CCG TCT CTGCAG CAC ATT TCT T 3′和引物OLA HL0315′ TTT AAA TTC GCG CTC ACC TCG CCGCT 3′分別為0.2μmol/L，Taq酶1.5U；PCR反應(yīng)優(yōu)化條件為94℃預(yù)變性5min→15×(94℃，30s→50℃，30s→72℃，45s)→72℃10min；PCR產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；第2輪擴(kuò)展反應(yīng)取第1輪PCR產(chǎn)物3μL為模板，引物OLA ERB15′ CCG GAA TTC CCG TCTCTG CAG CAC ATT TCT T 3′和引物OLA XRBI5′ AGC TCG AGC GCT GCA CAG TGAAAC TC 3′)分別為0.1μmol/L，MgCl2，dNTPs和Taq酶的濃度同第1輪擴(kuò)增；反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min→30×(94℃，30s→63℃，30s→72℃，45s)→72℃10min；(3)、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)及酶切第2輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行Hin1I、MvaI、HaeIII、ScaI和SacII限制性內(nèi)切酶的單酶切，酶切反應(yīng)體系為20μL，每種內(nèi)切酶用量均為5個(gè)單位，每個(gè)體系中第2輪PCR產(chǎn)物為10μL，10×Buffer 2μL，加入雙蒸水至20μL；(4)、進(jìn)行MHC DRB1單倍型分型和遺傳分析，篩選出抗包蟲病的基因單倍型MvaIbc SacIIab Hin1Iab；(5)根據(jù)篩選出的抗包蟲病的基因單倍型與非抗包蟲病的基因單倍型，對(duì)哈薩克綿羊進(jìn)行組群，選取抗性組與非抗性組基因單倍型各8只綿羊，進(jìn)行人工感染攻蟲驗(yàn)證試驗(yàn)；結(jié)果顯示抗性組中有1只感染包蟲病，非抗性組中有6只感染包蟲病，抗性組與非抗性組包蟲病感染率差異顯著；從而驗(yàn)證了哈薩克綿羊MHC DRB1外顯子2的MvaIbc SacIIab Hin1Iab為抗包蟲病的基因單倍型。
2.一種權(quán)利要求1所述的抗包蟲病基因單倍型Mvalbc-SacIIab-Hinllab在對(duì)哈薩克 綿羊進(jìn)行抗包蟲病新品系標(biāo)記輔助選擇、選育中的應(yīng)用。全文摘要
本發(fā)明公開了一種哈薩克綿羊抗包蟲病基因單倍型篩選方法，包括以下步驟(1)、樣品采集和綿羊基因組DNA的提取(2)引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增；(3)、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)及酶切；(4)、進(jìn)行MHC-DRB1單倍型分型和遺傳分析，篩選出抗包蟲病的基因單倍型MvaIbc-SacIIab-Hin1Iab；(5)根據(jù)篩選出的抗包蟲病的基因單倍型與非抗包蟲病的基因單倍型，對(duì)哈薩克綿羊進(jìn)行組群，選取抗性組與非抗性組基因單倍型各8只綿羊，進(jìn)行人工感染攻蟲驗(yàn)證試驗(yàn)；結(jié)果顯示抗性組中有1只感染包蟲病，非抗性組中有6只感染包蟲病，抗性組與非抗性組包蟲病感染率差異顯著；從而驗(yàn)證了哈薩克綿羊MHC-DRB1外顯子2的MvaIbc-SacIIab-Hin1Iab為抗包蟲病的基因單倍型。還公開了該基因單倍型在對(duì)哈薩克綿羊進(jìn)行抗包蟲病新品系標(biāo)記輔助選擇、選育中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101928777SQ20101027455
公開日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2010年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月8日
發(fā)明者剡根強(qiáng), 孫延鳴, 李仁燕, 申紅, 賈斌, 趙宗勝 申請(qǐng)人:石河子大學(xué)