專利名稱：Cox-2抑制劑用于治療不攜帶與肝臟毒性相關(guān)的hla等位基因的患者中cox-2依賴性疾病 ...的制作方法
C0X-2抑制劑用于治療不攜帶與肝臟毒性相關(guān)的HLA等位基因的患者中C0X-2依賴性疾病的用途本公開的背景 本公開尤其涉及通過確定人白細(xì)胞抗原(HLA)等位基因的存在而預(yù)測患者因施用C0X-2抑制劑羅美昔布(lumiracoxib)而發(fā)生肝臟毒性風(fēng)險的方法。非類固醇抗炎藥(NSAIDs)是廣泛使用并充分建立起來的用于骨關(guān)節(jié)炎中慢性疼痛、疼痛和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的炎癥的療法。全部NSAIDs的作用機(jī)制歸因于它們通過抑制環(huán)加氧酶途徑阻斷前列腺素合成。但是，抑制前列腺素產(chǎn)生造成共同的副作用，如胃刺激、 血管縮窄和腎損害。羅美昔布(2- [ (2-氯-6-氟苯基)氨基]-5-甲基-苯乙酸)(C15H13NO2ClF)是環(huán)加氧酶(C0X)-2的強(qiáng)力和選擇性抑制劑。羅美昔布在減輕骨關(guān)節(jié)炎、疼痛和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的體征和癥狀方面如非選擇性、非類固醇NSAIDs那樣有效。它具有良好的口服生物利用率和迅速吸收作用，在給藥2小時后達(dá)到最大血漿濃度(C. M. Rordorff等人，Clin. Pharmacokinet.，44 (12)，1247-1266 (2005))。盡管具有短的消除半衰期，為自血漿的4小時消除半衰期，然而羅美昔布有效地分布至發(fā)炎組織并且停留直至24小時 (A. Buvanendran 和 R. Barkin, Drugs of Today, 43 (3)，137-147 (2007))。與現(xiàn)有的 NSAIDs 相比，羅美昔布也具有改善的耐受性特征，尤其對于胃腸系統(tǒng)(Y. Yuan和R.Himt，Current Pharm. Design,13，2237-2247(2007))。盡管總體上安全和良好耐受，一些用羅美昔布治療的患者經(jīng)歷了血液中升高的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和/或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平。ALT/AST水平的這種升高可以導(dǎo)致罕見但嚴(yán)重的肝臟毒性副作用(Y. Li等人，Drug Metab. Disp.，36，469-473 (2008))。盡管基因組認(rèn)識取得進(jìn)展，然而缺乏對遺傳變體如何與患者不良藥物反應(yīng)有關(guān)的權(quán)威性和可再現(xiàn)性深入了解。定義特定遺傳等位基因如何與患者對不良藥物反應(yīng)的易感性相關(guān)為改善和更安全地治療疾病提供了機(jī)會。本領(lǐng)域需要評估患者應(yīng)答于羅美昔布時發(fā)生肝臟毒性的易感性的有用方法。本公開概述本公開提供了預(yù)測患者應(yīng)答于選擇性C0X-2抑制劑羅美昔布時發(fā)生肝臟毒性的風(fēng)險的方法。發(fā)現(xiàn) HLA 等位基因 DQAl * 0102,DRBl * 150UDQB1 * 0602 和 DRB5 * 0101 與羅美昔布誘導(dǎo)的肝臟毒性高度相關(guān)。因而，HLA等位基因DQAl * 0102,DRBl * 150UDQB1 女0602和DRB5 ^ 0101可以用作預(yù)測患者用羅美昔布治療時發(fā)生肝臟毒性風(fēng)險的個體生物標(biāo)記物。因此，本申請?zhí)峁┝嗽u估患者應(yīng)答于施用羅關(guān)昔布后發(fā)生肝臟毒性的風(fēng)險的方法。一旦已經(jīng)確定風(fēng)險，該患者可以用羅美昔布治療(或治療繼續(xù)或用劑量增加進(jìn)行治療) (在低風(fēng)險或無風(fēng)險確定的情形下)，或該患者可以不用羅美昔布治療(或治療中斷或用降低的劑量治療)(在高風(fēng)險確定的情形下)。因而，本公開提供了用羅美昔布治療的方法，其中基于對 HLA 等位基因 DQAl * 0102,DRBl * 150UDQB1 * 0602 和 DRB5 * 0101 的分析和肝臟毒性風(fēng)險確定所述治療方案?？梢酝ㄟ^確定選自由DQAl * 0102、DRBl * 1501、DQBl^ 0602或DRB5 ★ 0101組成的組中的至少一個HLA等位基因存在或不存在而實(shí)現(xiàn)評估患者應(yīng)答于羅美昔布時發(fā)生肝臟毒性的風(fēng)險，其中所述HLA等位基因的存在表示有肝臟毒性風(fēng)險。優(yōu)選地，HLA等位基因DQAl ★ 0102的存在或不存在表示有肝臟毒性的風(fēng)險。可以使用從生物樣品制備的基因組DNA直接檢測等位基因內(nèi)部的區(qū)域/核苷酸來檢測遺傳等位基因。盡管如實(shí)施例中所述從血液鑒定這些生物標(biāo)記物，然而可以從中檢測這些生物標(biāo)記物的樣品不限于血液，可以在其他類型樣品如血沉棕黃層(buffy coat)、血清、血漿、淋巴液、尿、淚、唾液、腦脊液、口腔拭子、痰或組織中檢測到這些生物標(biāo)記物。這也可以通過檢測等位基因的等同遺傳標(biāo)記物確定，所述等同遺傳標(biāo)記物可以例如是SNP(單核苷酸多態(tài)性)、微衛(wèi)星標(biāo)記或其他類型的遺傳多態(tài)性。換而言之，遺傳標(biāo)記物在相同單倍型上作為 HLA 等位基因 DQAl * 0102、DRBl * 1501、DQBl * 0602 或 DRB5 * 0101 等位基因存在而不是等位基因本身表示患者發(fā)生肝臟毒性反應(yīng)的風(fēng)險。HLA單倍型的示例性等同遺傳標(biāo)記物包括由NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)鑒定為rs3131294、 rs3129868、rs9270986、rs3129900 和 rs3135365 的單核苷酸多態(tài)性。 用于確定患者是否攜帶HLA等位基因DQAl ★ 0102以評估該患者應(yīng)答于羅美昔布時發(fā)生肝臟毒性風(fēng)險的方法也在本公開的范圍內(nèi)。該方法包括從獲自受試者的生物樣品中檢測HLA等位基因DQAl女0102的存在。該區(qū)域可以通過本領(lǐng)域已知的方法例如與 LuminexxMAP 技術(shù)序列特異性引物(SSP)分型法偶聯(lián)的序列特異性寡核苷酸(SSO)雜交、基于序列的分型法(SBT)來檢測。在備選的實(shí)施方案中，這些方法可以用來確定患者是否攜帶至少一個HLA等位基因亞型 DRBl * 1501、DQBl * 0602 或 DRB5 * 0101。本公開也涉及鑒定或預(yù)測用羅美昔布治療的受試者中肝臟毒性的素質(zhì)或肝臟毒性發(fā)生風(fēng)險和/或升高的ALT或AST的方法，包括對獲自受試者(例如，人)的生物樣品分析至少一個HLA等位基因的存在，其中所述的至少一個HLA等位基因的存在表示所述受試者中存在或增加的預(yù)測肝臟毒性和/或升高的ALT或AST或增加的肝臟毒性發(fā)生風(fēng)險，并且其中所述的至少一個HLA等位基因的不存在表示所述受試者中不存在或減少的預(yù)測肝臟毒性或減少的肝臟毒性發(fā)生風(fēng)險。優(yōu)選地，該HLA 等位基因選自由 DQAl * 0102,DRBl * 150UDQB1 * 0602 和 DRB5 * 0101組成的組。本公開的其它目的、特征、優(yōu)勢和方面將因以下描述和所附權(quán)利要求書而對本領(lǐng)域技術(shù)人員變得顯而易見。但是，應(yīng)當(dāng)理解盡管以下描述、所附權(quán)利要求書和具體實(shí)施例表示本公開的優(yōu)選實(shí)施方案，然而僅以說明的方式給出它們。所公開主題物的精神和范圍內(nèi)的多種改變和修改將因閱讀以下內(nèi)容而對本領(lǐng)域技術(shù)人員變得輕易顯見。附圖描述

圖1全部SNP的全基因組關(guān)聯(lián)結(jié)果(P值由基因組位置圖示)。圖2來自全基因組關(guān)聯(lián)研究的觀察分布和期望分布的-IoglO (ρ值)。圖3DQA1女0102攜帶者和非攜帶者的病例的平均峰ULN ALT/AST水平。圖4對大于3xULN的DQAl * 0102攜帶者和非攜帶者所計(jì)算的Kaplan-Meier發(fā)生率估值(Kaplan-Meier incidence estimates)。圖5對大于5xULN的DQAl * 0102攜帶者和非攜帶者所計(jì)算的Kaplan-Meier發(fā)生率估值。本公開詳述 下文列出用來描述本公開遺傳標(biāo)記物的多個術(shù)語的定義。這些定義應(yīng)用于說明書中通篇使用的所述術(shù)語，除非另外在具體情況下單獨(dú)地或作為更大群體的部分限制這些定義。如本文中所用的術(shù)語“羅美昔布”指選擇性C0X-2抑制劑2-[(2_氯_6_氟苯基) 氨基]-5-甲基-苯乙酸MC15H13NO2ClF)并且根據(jù)需要包括其可藥用鹽及酯。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到羅美昔布可以作為藥物組合物、藥物或其他合適劑型施用至患者。“遺傳標(biāo)記物”和“生物標(biāo)記物”在本公開的上下文中指存在于取自受試者的樣品中的 HLA 等位基因 DQAl * 0102,DRBl * 150UDQB1 * 0602 或 DRB5 * 0101 及其相關(guān)的基因產(chǎn)物(即蛋白質(zhì)或多肽、mRNA)，其中所述的受試者具有應(yīng)答于選擇性C0X-2抑制劑羅美昔布時發(fā)生肝臟毒性的風(fēng)險。所構(gòu)思的本公開的“蛋白質(zhì)或多肽”包括其任意片段，尤其是免疫可檢測片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到受損的蛋白質(zhì)可以被降解或切割成片段。此外，某些蛋白質(zhì)或多肽以無活性形式合成，它們隨后可以因蛋白水解激活。特定蛋白質(zhì)的此類片段可以作為該蛋白質(zhì)本身的替代物被檢測。如本文中所用的術(shù)語“樣品”指為鑒定、診斷、預(yù)測或監(jiān)測目的從受試者獲得的樣品。在本公開的某些方面，可以出于預(yù)測患者在施用選擇性C0X-2抑制劑羅美昔布后發(fā)生肝臟毒性風(fēng)險的目的而獲得這種樣品。優(yōu)選的試樣包括血液、血液衍生產(chǎn)物(如血沉棕黃層、血清和血漿)、淋巴液、尿、淚、唾液、腦脊液、口腔拭子、痰或組織樣品。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到在分級分離或純化方法(例如從全血分離DNA)后將更輕易地分析一些試樣。如本文中所用短語“發(fā)生肝臟毒性的幾率”指熟練技術(shù)人員可以借以預(yù)測受試者應(yīng)答于選擇性C0X-2抑制劑羅美昔布時發(fā)生肝臟毒性風(fēng)險的方法。它不指以100%準(zhǔn)確度預(yù)測肝臟毒性發(fā)生的能力。相反，熟練技術(shù)人員會理解它指肝臟毒性會發(fā)生的增加的幾率。如果患者發(fā)生肝臟毒性的幾率高于一般群體發(fā)生肝臟毒性的幾率，則患者在施用 C0X-2抑制劑羅美昔布后具有發(fā)生肝臟毒性的“風(fēng)險”或“素質(zhì)”?；颊邞?yīng)答于施用羅美昔布后發(fā)生肝臟毒性的幾率至少約1.5倍、更優(yōu)選地至少約2倍、仍更優(yōu)選地至少約3、4、5、6、7、 8或9倍并且最優(yōu)選地至少約10倍高于一般群體應(yīng)答于羅美昔布時發(fā)生肝臟毒性的幾率。 可以通過本領(lǐng)域已知的任意方法確定該幾率。本公開的遺傳標(biāo)記物的“靈敏度”這一術(shù)語是擁有該遺傳標(biāo)記物的受治療患者具有肝臟毒性和/或ALT和/或AST升高的百分?jǐn)?shù)。風(fēng)險因素的靈敏度優(yōu)選地是至少約40%， 更優(yōu)選地是至少約50 %、60 %、70 %、80 %、85 %或90 %。最優(yōu)選地，該靈敏度是至少95 %或更高?；加凶鳛橛昧_美昔布治療的直接結(jié)果并且測定法檢測不到的肝臟毒性的個體是“假陰性”。沒有肝臟毒性并且在測定法中測試呈陰性的受試者稱作“真陰性”。診斷測定法的 “特異性”是1減去假陽性率，其中“假陽性率”定義為測試呈陽性的無治療相關(guān)性肝臟毒性的那些受試者的比例。盡管特定診斷方法可能不提供對某疾病的確切診斷，但是如果該方法提供輔助診斷的陽性指示，則它是足夠的。目的等位基因的“等同遺傳標(biāo)記物”指與目的等位基因相關(guān)的遺傳標(biāo)記物，即，它顯示與該目的等位基因的連鎖不平衡。
本文中使用的術(shù)語“探針”指任意物質(zhì)，其用于特異性檢測與HLA等位基因DQAl女 0102、DRBl * 1501、DQBl * 0602或DRB5 * 0101相關(guān)的另一種物質(zhì)。探針可以是與HLA 等位基因DQAl * 0102,DRBl * 150UDQB1 * 0602或DRB5 * 0101內(nèi)部特定區(qū)域特異性雜交的寡核苷酸或綴合的寡核苷酸。綴合的寡核苷酸指與生色團(tuán)或含有配體(例如，抗原) 的分子共價結(jié)合的寡核苷酸，所述的配體對受體分子(例如，對該抗原特異的抗體)是高度特異的。該探針也可以是與另一種引物一起用于擴(kuò)增HLA等位基因DQAl * 0102、DRBl * 150UDQB1 * 0602或DRB5 * 0101內(nèi)部特定區(qū)域的PCR引物。此外，所述探針可以是特異性識別 HLA 等位基因 DQAl * 0102,DRBl * 150UDQB1 * 0602 和 DRB5 * 0101 至少之一或所述等位基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的抗體。如上文中所述，本公開涉及鑒定或預(yù)測用羅美昔布治療的受試者中肝臟毒性的素質(zhì)或肝臟毒性發(fā)生風(fēng)險和/或升高的ALT或AST的方法，包括對獲自受試者(例如，人)的生物樣品分析至少一個HLA等位基因的存在，其中所述的至少一個HLA等位基因的存在表示所述受試者中存在或增加的預(yù)測肝臟毒性和/或升高的ALT或AST或增加的肝臟毒性發(fā)生風(fēng)險，并且其中所述的至少一個HLA等位基因的不存在表示所述受試者中不存在或減少的預(yù)測肝臟毒性或減少的肝臟毒性發(fā)生風(fēng)險。優(yōu)選地，該HLA等位基因選自由DQAl ★ 0102、 DRBl * 1501, DQBl * 0602 和 DRB5 * 0101 組成的組。此外，本公開也涉及用于預(yù)測施用羅美昔布后海氏規(guī)律病例(Hy’ s law cases) O 3x ULN ALT/AST和彡2x ULN血清膽紅素)的方法，包括對獲自受試者的生物樣品分析所述受試者中至少一個HLA等位基因的存在，所述的至少一個HLA等位基因選自DQAl 0102、DRBl * 1501、DRB5 * 0101 和 DQBl * 06 的組。生物樣品選自以下組血液、血清、血漿、尿、淚、唾液、腦脊液、白細(xì)胞樣品或組織樣品或其組合。用于檢測的最優(yōu)選HLA等位基因是DQAl女0102。相關(guān)的HLA等位基因包括但不限于i)HLA 等位基因 DQAl * 0102，其包含 DQAl * 010201 (序列 ID No. 1), DQAl * 010202 (序列 ID No. 2)、DQAl * 010203 (序列 ID No. 3)、DQAl * 010204 (序列 ID No 4)。 DQAl * 0102的氨基酸序列作為序列ID No. 5公開。ii) HLA 等位基因 DRBl * 1501，其包含 DRBl * 15010101、DRBl * 15010102 (序列 ID No. 6)、DRBl * 150102 (序列 ID No. 7)、DRBl * 150103 (序列 ID No. 8)、DRBl * 150104 (序列 ID No. 9)、DRB1 * 150105(序列 ID No. 10)和 DRBl * 150106 (序列 ID No. 11)。 DRBl * 150101 (DRB1 * 15010101、* 15010102)的氨基酸序列作為序列 ID No. 12 公開。iii)HLA 等位基因 DQBl * 0602，其包含 DQBl * 060201 (序列 ID No. 13)和 DQBl
*060202 (序列ID No. 14)。DQBl * 060201的氨基酸序列作為序列ID No. 15公開。iv)HLA 等位基因 DRB5 * 0101，其包含 DRB5 * 010101 (序列 ID No. 16)和 DRB5
*010102 (序列ID No. 17)。DRB5 * 010101的氨基酸序列作為序列ID No. 18公開。關(guān)于HLA等位基因的核酸序列和氨基酸序列的相關(guān)信息是本領(lǐng)域技術(shù)人員在熟知數(shù)據(jù)庫如IMGT/HLA數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站http://Ww. ebi. ac. uk/imRt/hla/中可獲得的。隨著發(fā)現(xiàn)新等位基因，本公開也包括額外的DQAl * 0102、DRBl * 1501、DQBl * 0602和DRB5 * 0101。此外，本公開也描述了用于預(yù)測施用羅美昔布后海氏規(guī)律病例(> 3xULN ALT/AST和ULN血清膽紅素)的方法，包括 對獲自受試者的生物樣品測試所述受試者中至少一個HLA等位基因的存在，所述的至少一個HLA等位基因選自由DQAl女0102、DRBl女 1501、DRB5 * 0101 禾口 DQBl * 0602 組成的組。除了特定的HLA等位基因本身之外，與任意的特定HLA等位基因相關(guān)的遺傳標(biāo)記物可以用來預(yù)測患者應(yīng)答于施用羅美昔布后發(fā)生肝臟毒性的風(fēng)險。因而，相關(guān)即歸因于連鎖不平衡或遺傳連鎖的遺傳標(biāo)記物可以用來指示目的HLA的存在。因而，這些標(biāo)記物 (等同遺傳標(biāo)記物)的存在表示存在目的HLA等位基因，這接下來表示肝臟毒性風(fēng)險。HLA DQAl女0102和DRBl女1501單倍型例如通過等同遺傳標(biāo)記物(如被NCBI數(shù)據(jù)庫鑒定為 rs3131294、rs3129868、rs9270986、rs3129900 和 rs3135365 的單核苷酸多態(tài)性)的存在來指示。等同遺傳標(biāo)記物可以是任意標(biāo)記物，包括HLA等位基因、微衛(wèi)星標(biāo)記物和SNP標(biāo)記物。優(yōu)選地，有用的等同遺傳標(biāo)記物距離目的HLA等位基因約200kb或更少。更優(yōu)選地，等同遺傳標(biāo)記物距離目的HLA等位基因IOOkb或更少。熟練技術(shù)人員熟知檢測本公開特定遺傳標(biāo)記物存在的眾多方法和裝置?？梢酝ㄟ^直接檢測某HLA等位基因遺傳標(biāo)記物或其內(nèi)部的特定區(qū)域確定該標(biāo)記物的存在。用于等位基因檢測的基因組DNA可以通過本領(lǐng)域熟知的方法例如來自Gentra Systems (Qiagen,CA) 的PUREGENEDNA 純化系統(tǒng)從患者生物樣品制備。檢測目的遺傳標(biāo)記物內(nèi)部的區(qū)域包括檢驗(yàn)位于該區(qū)域內(nèi)部有義鏈或反義鏈的核苷酸。本領(lǐng)域已知的方法，例如序列特異性引物PCR(SSP)分型法、序列特異性寡核苷酸 (SSO)分型法或基于序列的分型法(SBT)，可以用來檢測特定區(qū)域。術(shù)語“遺傳標(biāo)記物的存在”指特定基因的存在或量，包括但不限于特定基因的mRNA、cDNA或多肽表達(dá)產(chǎn)物。類似地，可以通過本領(lǐng)域已知的方法檢測等同遺傳標(biāo)記物。此外，可以使用序列特異性探針(例如，來自Taqman、Beacons、Scorpions的水解探針；或雜交探針)從自PCR獲得的基因組DNA中檢測選自由DQAl * 0102,DRBl * 1501、 DQBl ± 0602和DRB5 ± 0101組成的組中的至少一個HLA等位基因的存在。對于檢測，如此設(shè)計(jì)序列特異性探針，從而它們與目的HLA等位基因的基因組DNA特異性結(jié)合。這些探針可以為直接檢測進(jìn)行標(biāo)記或與特異性結(jié)合于探針的第二種可檢測分子接觸。PCR產(chǎn)物也可以通過DNA結(jié)合物檢測。所述的PCR產(chǎn)物隨后可以由本領(lǐng)域可用的任意DNA測序方法測序。備選地，可以通過使用任意測序方法(如，但不限于，基于Sanger的測序法、直接測序法或新的或下一代測序法)的測序檢測所述HLA等位基因的存在(Shendure J.和Ji， H.，Nature Biotechnology (1998)，第 26 卷，第 10 期，第 1135-1145 頁)。在一個實(shí)施方案中，使用雜交測定法檢測選自由DQAl女0102,DRBl女150UDQB1 女0602和DRB5女0101組成的組中的至少一個HLA等位基因的存在。在雜交測定法中，基于來自樣品的核酸與互補(bǔ)性核酸分子(例如寡核苷酸探針)雜交的能力確定該遺傳標(biāo)記物的存在或不存在。多種雜交測定法是可獲得的。在一些情況下，通過觀察結(jié)合的探針檢測探針與目的序列的雜交，例如，Northern或Southern測定法。在這些測定法中，分離了 DNA(Southern)或RNA(Northern)。隨后用一系列在基因組中罕有切割或在正被分析的任意標(biāo)記物附近不切割的限制酶切割該DNA或RNA0將DNA或RNA隨后分離，例如在瓊脂糖凝膠上，并轉(zhuǎn)移至膜。使得例如通過摻入放射性核苷酸或結(jié)合物(例如，SYBR Green)標(biāo)記的一個探針或多個探針在低、中或高嚴(yán)格性條件下接觸該膜。除去未結(jié)合的探針并且通過觀察標(biāo)記的探針來檢測結(jié)合作用的存在。測試、檢測、測量、鑒定和/或確定等位基因的多種方法是本領(lǐng)域已知的。此類方法包括但不限于例如DNA擴(kuò)增技術(shù)，如PCR及其變體，直接測序法、序列特異性寡核苷酸雜交(SSO)、序列特異性引物分型法(SSP)、或基于序列的分型法(SBT)。序列特異 性寡核苷酸(SSO)分型法使用PCR靶擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物與珠子上一組固定的序列特異性寡核苷酸雜交、通過顏色形成檢測結(jié)合探針的擴(kuò)增產(chǎn)物，隨后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解可以使用多種市售試劑盒如One Lambda, Inc. (Canoga Park, CA)提供的LABType SSO dqai/dqbi分型檢驗(yàn)試劑盒或與Luminex 技術(shù) (Luminex, Corporation, TX)配合的 LifecodesHLA-DQA分型試劑盒(Tepnel Life Sciences Corp.)進(jìn)行所述的序列特異性寡核苷酸(SSO)雜交。LABType sso是一種使用序列特異性寡核苷酸(SSO)探針和顏色代碼微球來鑒定HLA等位基因的逆向SS0(rSS0)DNA分型方案。靶DNA由聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增并隨后與珠探針陣列雜交。在96孔PCR平板的單孔內(nèi)進(jìn)行測試；因而，可以一次處理96份樣品。序列特異性引物(SSP)分型法是一項(xiàng)基于PCR的技術(shù)，其使用針對基于DNA的HLA 分型的序列特異性引物。SSP方法基于以下原理僅序列與靶序列完全匹配的引物在受控的PCR條件下產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。將等位基因序列特異性引物對設(shè)計(jì)成選擇性地?cái)U(kuò)增對單個等位基因或成組等位基因特異的靶序列。可以在瓊脂糖凝膠上觀察到PCR產(chǎn)物。匹配全部樣品中存在的非等位基因序列的對照引物對充當(dāng)PCR內(nèi)對照以驗(yàn)證PCR擴(kuò)增的效率。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解采用所述序列特異性引物分型法的高分辨率基因分型可以使用多種市售試劑盒如 Olerup SSP 試劑盒(Qiagen, CA)或(Invitrogen)或 Allset 和 Gold DQAl 低分辨率 SSP(Invitrogen)進(jìn)行。基于序列的分型法是基于PCR靶擴(kuò)增，隨后是對PCR產(chǎn)物測序和數(shù)據(jù)分析。在另一個實(shí)施方案中，通過測量RNA水平確定選自由DQAl * 0102,DRBl * 1501、 DQBl ± 0602和DRB5 ± 0101組成的組中的至少一個HLA等位基因的存在?？梢允褂没?PCR的測定法或逆轉(zhuǎn)錄酶PCR (RT-PCR)檢測目的HLA等位基因。在RT-PCR中，使用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA以酶促方式轉(zhuǎn)換成cDNA。該cDNA隨后用作PCR反應(yīng)的模板。PCR產(chǎn)物可以由任意的適用方法檢測，所述的適用方法包括但不限于凝膠電泳并用DNA特異性著色劑染色或與標(biāo)記的探針雜交。在又一個方面，可以使用帶有競爭性模板的標(biāo)準(zhǔn)化混合物的定量RT-PCR。在另一個實(shí)施方案中，通過測量多肽基因表達(dá)產(chǎn)物確定DQAl女0102、DRBl女 1501、DQBl * 0602或DRB5 * 0101中至少一個HLA等位基因的存在。在本公開的優(yōu)選方面，通過鑒定由所述基因之一編碼的一種或多種多肽的量測量基因表達(dá)。本發(fā)明主題不受檢測或測量基因表達(dá)的方法限制。在又一個實(shí)施方案中，通過使用本領(lǐng)域已知的任意方法檢測由所述基因之一編碼的蛋白質(zhì)或多肽表達(dá)產(chǎn)物，確定DQAl * 0102、DRBl * 1501、DQBl * 0602或DRB5 * 0101
中至少一個HLA等位基因的存在。就樣品中的多肽或蛋白質(zhì)而言，經(jīng)常使用免疫測定裝置和方法。這些裝置和方法可以使用標(biāo)記的分子在多種夾心、競爭性或非競爭性測試模式下來產(chǎn)生與目的分析物的存在或量相關(guān)的信號。此外，某些方法和裝置如生物傳感器和光學(xué)免疫測定法可以用來確定分析物的存在或量，無需標(biāo)記的分子。蛋白質(zhì) 或多肽的存在或量一般使用特異性抗體并檢測特異性結(jié)合作用來確定?？梢允褂萌魏魏线m的免疫測定法，例如，酶聯(lián)免疫測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、競爭性結(jié)合測定法等?？梢灾苯踊蜷g接地檢測抗體對蛋白質(zhì)或多肽的特異性免疫結(jié)合作用。直接標(biāo)記物包括與抗體連接的熒光或發(fā)光標(biāo)簽、金屬、染料、放射性核素等。間接標(biāo)記物包括本領(lǐng)域熟知的多種酶，如堿性磷酸酶、過氧化氫酶等。本公開也構(gòu)思了使用特異于蛋白質(zhì)或多肽的固定化抗體?？贵w可以固定到多種固體支持物上，如磁性或色譜基質(zhì)顆粒、測定平板的表面(如微滴定孔)、固體基底材料(如塑料、尼龍、紙)的塊等?？梢酝ㄟ^將一種抗體或多種抗體以陣列方式涂布于固體支持物上制備測試條。這種條可以隨后浸入試樣并隨后通過洗滌和檢測步驟迅速處理以產(chǎn)生可測量的信號，如顯色的點(diǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到在分析其他遺傳序列的同時，可以分別地或同時地實(shí)施本發(fā)明方法的基因分析。在本公開的另一個方面，提供了陣列，其可以與依次對應(yīng)于基因產(chǎn)物例如cDNA、mRNA、cRNA、多肽及其片段的探針在已知位置處特異性雜交或結(jié)合。在另一個方面，本公開提供了使用含有至少一種用于檢測受試者中HLA等位基因 DQAl * 0102,DRBl * 150UDQB1 * 0602和/或DRB5 * 0101的探針的試劑盒來確定該受試者施用羅美昔布是否易于發(fā)生肝臟毒性的方法。這些探針可以是與HLA等位基因遺傳標(biāo)記物(DQA1 * 0102,DRBl * 150UDQB1 * 0602或DRB5 * 0101)內(nèi)部特定區(qū)域特異性雜交的寡核苷酸或綴合的寡核苷酸；與另一種引物一起用于擴(kuò)增所述HLA等位基因遺傳標(biāo)記物內(nèi)部特定區(qū)域的PCR引物；識別HLA等位基因遺傳標(biāo)記物和/或所述HLA等位基因遺傳標(biāo)記物之蛋白質(zhì)產(chǎn)物的抗體。任選地，該試劑盒可以含有靶向內(nèi)對照等位基因的探針，所述的內(nèi)對照等位基因可以是一般群體中存在的任意等位基因。設(shè)計(jì)對內(nèi)對照等位基因的檢測以確保該試劑盒的性能。在本公開的另一個方面提供了治療受試者中環(huán)加氧酶_2依賴性疾病的方法，包括步驟(i)接收關(guān)于獲自所述受試者的生物樣品中存在至少一種HLA等位基因的數(shù)據(jù)， 所述的HLA等位基因表示存在或預(yù)測到肝臟毒性，(ii)如果所述接收的數(shù)據(jù)表示該受試者不是所述HLA等位基因的攜帶者，則施用羅美昔布至該受試者。在一個備選的實(shí)施方案中，本公開也提供了治療受試者中環(huán)加氧酶_2依賴性疾病的方法，包括步驟(i)驗(yàn)定在獲自所述受試者的生物樣品中存在表示存在或預(yù)測到肝臟毒性的至少一種HLA等位基因，(ii)如果該受試者不是一個或多個所述HLA等位基因的攜帶者，則施用羅美昔布至該受試者。優(yōu)選地，該受試者是人，并且該生物樣品選自由正常組織、體液及其組合組成的組。此外，所述HLA等位基因的一個或多個選自由DQAl * 0102,DRBl * 150UDQB1 * 0602和DRB5 * 0101組成的組。優(yōu)選地，該HLA等位基因是DQAl * 0102。
本公開也提供了通過施用羅美昔布至具有應(yīng)答于羅美昔布時降低的肝臟毒性發(fā)生素質(zhì)或風(fēng)險的受試者治療環(huán)加氧酶-2依賴性疾病的方法，其中所述降低的素質(zhì)或風(fēng)險通過本文以上所述的方法鑒定。備選地，用于治療受試者中C0X-2依賴性疾病的方法也可以通過以下方式進(jìn)行i)驗(yàn)定或接收關(guān)于獲自所述受試者的生物樣品中存在至少一個等同遺傳標(biāo)記物的數(shù)據(jù)，所述的等同遺傳標(biāo)記物表示存在指示存在或預(yù)測到肝臟毒性的HLA等位基因，和ii)如果該受試者不是所述等同遺傳標(biāo)記物的攜帶者，則施用羅美昔布至該受試
者ο 本公開也提供了通過施用羅美昔布至具有應(yīng)答于羅美昔布時降低的肝臟毒性發(fā)生素質(zhì)或風(fēng)險的受試者治療環(huán)加氧酶-2依賴性疾病的方法，其中所述降低的素質(zhì)或風(fēng)險通過本文以上所述的方法鑒定。羅美昔布是令人驚訝地抑制C0X-2而不顯著抑制C0X-1的5_烷基取代的2_芳基氨基苯乙酸類及衍生物的化合物。此類非類固醇抗炎藥令人驚訝地沒有通常與經(jīng)典的非類固醇抗炎藥相關(guān)的不受歡迎的副作用，如胃腸的和腎臟的副作用，并且在1999年3月11日公布的國際專利申請
發(fā)明者C·波爾丁, J·B·辛格, J·邁耶, S·萊威特茲凱 申請人:諾瓦提斯公司