專利名稱：細(xì)胞保存方法和細(xì)胞運輸方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及保存活細(xì)胞的細(xì)胞保存方法和細(xì)胞運輸方法。
背景技術(shù)：
將從組織分離出的細(xì)胞用于試驗、檢驗的方法，是生物技術(shù)相關(guān)領(lǐng)域中不可欠缺的方法。其廣泛用于疾病、病情的診斷、新藥的探索和藥效的判定、或者動物檢驗、植物檢驗、環(huán)境污染物質(zhì)的試驗等。因此，在生物技術(shù)領(lǐng)域中使用的細(xì)胞類別極其多樣化。分離得到的細(xì)胞也有直接用于試驗的情況，但多數(shù)情況下是在培養(yǎng)皿或試管中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。使用該培養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)行各種檢驗。對于用于細(xì)胞培養(yǎng)試驗的細(xì)胞培養(yǎng)株，要求其表現(xiàn)與在生物體內(nèi)的試驗、即所謂體內(nèi)(in vivo)試驗同樣的藥物感受性、毒性反應(yīng)。即， 需要在細(xì)胞培養(yǎng)容器的表面能夠構(gòu)筑有規(guī)則性地排列的細(xì)胞間的網(wǎng)絡(luò)。另外，由于在細(xì)胞培養(yǎng)試驗中使用的細(xì)胞培養(yǎng)株極為昂貴，因此期望提高細(xì)胞的生存率和增殖速度。上述細(xì)胞培養(yǎng)試驗是在同一條件下，以將評價的藥物等的量、濃度等為變量，測定其效果。因此，細(xì)胞培養(yǎng)容器的材質(zhì)、形狀等也需要相同。作為該細(xì)胞培養(yǎng)容器，一般使用塑料制平皿、玻璃制平皿、固定在容器內(nèi)的玻璃板、孔板等。孔板有6孔、12孔、48孔、96孔的各板或平皿。它們一般與整個板的大小幾乎相同，孔數(shù)越大，1個孔的尺寸越小。該1個孔相當(dāng)于1個培養(yǎng)皿。另外，由于最近的微量化的趨勢，因此也開始使用包含更小口徑且多量的培養(yǎng)皿的384孔板。這些培養(yǎng)皿的底部是平坦的平板狀，使用該底面作為培養(yǎng)面。但是，在組織細(xì)胞的培養(yǎng)中，如果使用現(xiàn)有的細(xì)胞培養(yǎng)容器，則細(xì)胞薄薄地鋪展， 形成沒有方向性的形態(tài)。另外，由于在細(xì)胞培養(yǎng)容器的表面無規(guī)則地配置，因此細(xì)胞間的網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜地交織而形成。因此，存在不能重現(xiàn)在生物體內(nèi)的細(xì)胞功能的問題。例如，不能形成在肝細(xì)胞中維持肝功能的已知的球體狀的肝細(xì)胞團(tuán)。為了解決上述問題，公開了在平板狀的培養(yǎng)面將特殊的高分子固定化的方法(參考專利文獻(xiàn)1)、使用特殊的裝置的方法(參考專利文獻(xiàn)2)、在高分子凝膠中進(jìn)行培養(yǎng)的方法(參考專利文獻(xiàn)3)等。但是，在專利文獻(xiàn)1記載的方法中，存在固定化方法繁雜、不能穩(wěn)定地制造、且成本高的問題。另外，在專利文獻(xiàn)2記載的方法中，無論培養(yǎng)方法的復(fù)雜，仍存在細(xì)胞團(tuán)的形成效率差，成本高等的問題。在專利文獻(xiàn)3的方法中，有不能控制細(xì)胞團(tuán)的大小、另外基板的操作性繁雜等的問題。這樣，這些方法都繁雜，不能穩(wěn)定地制造，且成本高。專利文獻(xiàn)1:日本專利第3177610號公報專利文獻(xiàn)2:日本特開平7-79772號公報
專利文獻(xiàn)3:日本特開平8-308562號公報。

發(fā)明內(nèi)容
從生物體分離的活細(xì)胞期望在與生物體同樣的環(huán)境下保存。例如，當(dāng)保存非冷凍的肝細(xì)胞時，在平面狀的培養(yǎng)板粘附肝細(xì)胞，裝滿培養(yǎng)基，置于保溫(例如25 37°C )狀態(tài)下進(jìn)行保存。但是，當(dāng)在平面上培養(yǎng)細(xì)胞時，與生物體內(nèi)的環(huán)境大為不同，因此存在使細(xì)胞具有的原本的功能喪失的問題。另外，由于培養(yǎng)中或保存中的環(huán)境要素、例如振動、溫度、CO2 濃度(培養(yǎng)基的PH的變化)等，有細(xì)胞的功能進(jìn)一步降低這樣的問題。另外，如果用專利文獻(xiàn)1或?qū)＠墨I(xiàn)2公開的方法保存培養(yǎng)的細(xì)胞，則在發(fā)生振動等時，有由細(xì)胞的剝離或凝膠的損壞導(dǎo)致細(xì)胞凋亡等的擔(dān)心。因此，難以在維持活細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)體的狀態(tài)下直接保存而運輸，難以在離開分離位置的位置利用。另一方面，從組織分離細(xì)胞的機制與進(jìn)行試驗、檢驗的機制有許多不同，因而期望在不降低分離的細(xì)胞 的功能的情況下進(jìn)行保存、運輸。本發(fā)明是為了解決這種問題而作出的發(fā)明，其目的在于提供在維持細(xì)胞功能的狀態(tài)下保存活細(xì)胞的細(xì)胞保存方法和細(xì)胞運輸方法。本發(fā)明的細(xì)胞保存方法的一種方式是使用具有多個微空間的細(xì)胞培養(yǎng)容器來保存活細(xì)胞的細(xì)胞保存方法，使活細(xì)胞粘附在上述多個微空間的表面來進(jìn)行培養(yǎng)，在上述培養(yǎng)后，將培養(yǎng)基向上述細(xì)胞培養(yǎng)容器注入，以覆蓋上述多個微空間，將上述細(xì)胞培養(yǎng)容器密封，以使培養(yǎng)基不漏出，進(jìn)行保存。在微空間的表面粘附活細(xì)胞，使用適于培養(yǎng)的微空間進(jìn)行培養(yǎng)，在各微容器內(nèi)形成三維結(jié)構(gòu)體，利用微容器隔離三維結(jié)構(gòu)體后，進(jìn)行密封并保存， 由此能夠以維持功能的狀態(tài)保存活細(xì)胞。另外，上述細(xì)胞培養(yǎng)容器優(yōu)選保持在4°C以上且小于37°C的溫度、來保存上述活細(xì)胞。進(jìn)一步地，優(yōu)選進(jìn)行培養(yǎng)，以使粘附于上述表面、且在各微空間的空間內(nèi)形成的三維結(jié)構(gòu)體的細(xì)胞群體形成被隔離的細(xì)胞數(shù)。通過使用微空間，可以防止在各微空間培養(yǎng)的活細(xì)胞與其他微空間的活細(xì)胞接觸。上述多個微空間優(yōu)選底部面積為0. 0Γ0. 1mm2、深度為25 150 μ m,另外，上述活細(xì)胞是肝細(xì)胞、胰β細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、皮膚上皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、組織干細(xì)胞、ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞中的任一者，或者更優(yōu)選由組織干細(xì)胞、ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞中的任一者分化的、肝細(xì)胞、胰β細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、皮膚上皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、和骨細(xì)胞中
的任一者。更優(yōu)選在上述培養(yǎng)后，除去非粘附細(xì)胞后將上述培養(yǎng)基向上述細(xì)胞培養(yǎng)容器注入，上述活細(xì)胞的培養(yǎng)優(yōu)選在使活細(xì)胞粘附并培養(yǎng)后，可以進(jìn)一步進(jìn)行培養(yǎng)，使其增殖、鋪展或者聚集。更優(yōu)選以IX IiTlX IO6細(xì)胞/cm2的細(xì)胞接種密度將活細(xì)胞接種到上述多個微空間中，更優(yōu)選細(xì)胞接種密度為IX IiTlX IO6細(xì)胞/cm2。在上述多個微空間中，優(yōu)選形成活細(xì)胞集聚的細(xì)胞團(tuán)，更優(yōu)選上述細(xì)胞團(tuán)的直徑為3(Γ200μπι。上述培養(yǎng)基更優(yōu)選下述情況中的至少一種，S卩，含有血清、增殖因子和血中成分中的至少一種，和使用可透過氧或二氧化碳的膜來密封上述細(xì)胞培養(yǎng)容器。另外，本發(fā)明的細(xì)胞運輸方法的一種方式是將活細(xì)胞保存在具有多個微空間的細(xì)胞培養(yǎng)容器中并運輸?shù)募?xì)胞運輸方法。該運輸方法首先使活細(xì)胞粘附在上述多個微空間的表面來培養(yǎng)。上述培養(yǎng)后，將培養(yǎng)基向上述細(xì)胞培養(yǎng)容器注入，以覆蓋上述多個微空間。然后，將上述細(xì)胞培養(yǎng)容器密封，以使培養(yǎng)基不漏出。并且，使用車輛、船舶或者航空器中的任一種運輸裝置將密封的上述細(xì)胞培養(yǎng)容器進(jìn)行運輸。利用該細(xì)胞運輸方法，能夠以維持活細(xì)胞的功能的狀態(tài)進(jìn)行運輸。另外，上述細(xì)胞培養(yǎng)容器優(yōu)選保持在4°C以上且小于37°C的溫度。根據(jù)本發(fā)明，可以提供以維持細(xì)胞功能的狀態(tài)保存活細(xì)胞的細(xì)胞保存方法和細(xì)胞運輸方法。


圖1是表示實施方式的細(xì)胞培養(yǎng)容器的構(gòu)成的平面圖。圖2是表示實施方式的細(xì)胞培養(yǎng)容器的構(gòu)成的II-II截面圖。圖3是表示實施方式的細(xì)胞培養(yǎng)容器的其他的構(gòu)成的平面圖。圖4是表示實施方式的細(xì)胞培養(yǎng)容器的其他的構(gòu)成的IV-IV截面圖。圖5是表示實施方式的細(xì)胞培養(yǎng)容器的進(jìn)而其他的構(gòu)成的平面圖。圖6是表示實施方式的細(xì)胞培養(yǎng)容器的進(jìn)而其他的構(gòu)成的VI-VI截面圖。 圖7是表示使用圖5和圖6所示的細(xì)胞培養(yǎng)容器培養(yǎng)細(xì)胞并進(jìn)行密封的狀態(tài)例的圖。圖8A是表示實施例06的結(jié)果的照片。圖8B是表示實施例07的結(jié)果的照片。符號說明 10,20細(xì)胞培養(yǎng)容器 11微容器
12側(cè)壁 13開口部 23處所(7水° 7卜)
24處所的側(cè)壁 30密封裝置 40活細(xì)胞 50培養(yǎng)基。
具體實施例方式本發(fā)明的細(xì)胞保存方法的一種方式是，使用適于活細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)容器，使活細(xì)胞粘附于微容器進(jìn)行培養(yǎng)，在微容器內(nèi)形成三維結(jié)構(gòu)體，培養(yǎng)后在細(xì)胞培養(yǎng)容器中裝滿培養(yǎng)基進(jìn)行保存。微容器使活細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)體形成、另外維持其結(jié)構(gòu)。另外，微容器將在內(nèi)部形成的活細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)體與其他的活細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)體隔離。因此，培養(yǎng)活細(xì)胞的微容器需要使用合適的微容器。用于該保存的細(xì)胞培養(yǎng)容器例如可以使用以下的容器。在細(xì)胞培養(yǎng)容器中形成凹凸格局、即多個微容器。由此，可以進(jìn)行與生物體內(nèi)同樣的立體性的細(xì)胞生長，而且在各微容器內(nèi)，可無差異地使細(xì)胞以聚集的形態(tài)培養(yǎng)。另外，對于微容器，例如通過將使微容器分隔的側(cè)壁(凸部)的高度最優(yōu)化，可以將聚集的活細(xì)胞 (例如肝細(xì)胞團(tuán))僅在微容器內(nèi)培養(yǎng)。其中，微空間是通過微容器形成的空間，更具體地，是指通過在平面上形成的凹凸格局而形成的空間。在以下的說明中，微容器和微空間沒有特別地區(qū)分。由側(cè)壁圍住的微容器的尺寸需要是用于培養(yǎng)細(xì)胞的最佳范圍。如果微容器的底部面積過于大，則與在平板上的培養(yǎng)同樣，細(xì)胞淺淺地鋪展，不能形成立體結(jié)構(gòu)。另一方面，如果微容器的底部面積過小，則不能收納細(xì)胞。因此，空間的尺寸根據(jù)培養(yǎng)的細(xì)胞種類，優(yōu)選是可收納一個或多個的范圍。例如，當(dāng)形成多個細(xì)胞集聚的肝細(xì)胞團(tuán)時，優(yōu)選為可收納該肝細(xì)胞團(tuán)的范圍。為了不使在微容器中培養(yǎng)的細(xì)胞向相鄰的微容器轉(zhuǎn)移，側(cè)壁的高度需要為最佳的范圍。如果側(cè)壁的高度過低，則細(xì)胞越過側(cè)壁，不適于培養(yǎng)。如果側(cè)壁的高度過高，則難以制作，而且物質(zhì)擴散變難，培養(yǎng)環(huán)境惡化。因此，側(cè)壁的高度根據(jù)細(xì)胞種類，優(yōu)選是將配置在微容器內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞在該微容器內(nèi)穩(wěn)定地持續(xù)培養(yǎng)的范圍。另外，通過形成在側(cè)壁設(shè)置開口部、將多個微容器連通的結(jié)構(gòu)，可以高效地向細(xì)胞供給氧或營養(yǎng)成分以及從細(xì)胞中除去廢物。應(yīng)予說明，根據(jù)培養(yǎng)的細(xì)胞種類，適當(dāng)設(shè)定側(cè)壁的高度、微容器尺寸、開口部的寬度，由此也可以適用于多種的培養(yǎng)體系。另外，本說明書中，活細(xì)胞是指從生物體組織分離出的細(xì)胞(原代培養(yǎng)細(xì)胞)的未經(jīng)傳代的細(xì)胞。另外，活細(xì)胞含有冷凍細(xì)胞和新鮮細(xì)胞這2種。另外，含有所有的株化細(xì)胞、 其他的ES細(xì)胞(Enbryonic Stem Cells)等。新鮮細(xì)胞是指原代培養(yǎng)細(xì)胞未經(jīng)冷凍過的細(xì)胞。實施方式
以下，對于本發(fā)明的實施方式進(jìn)行說明。其中，本發(fā)明不應(yīng)限于以下實施方式。另外， 為了清楚地說明，以下的記載和圖適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行簡略化。首先對于在實施方式的細(xì)胞保存方法中使用的細(xì)胞培養(yǎng)容器進(jìn)行說明，接著對于細(xì)胞保存方法進(jìn)行說明。首先使用圖1、2說明細(xì)胞培養(yǎng)容器的構(gòu)成例。圖1是表示本實施方式的細(xì)胞培養(yǎng)容器的構(gòu)成的平面圖，圖2是圖1的II-II截面圖。如圖1所示，細(xì)胞培養(yǎng)容器10具備微容器11、側(cè)壁12、開口部13。在細(xì)胞培養(yǎng)容器10的培養(yǎng)面，多個側(cè)壁形成為網(wǎng)眼狀，被該側(cè)壁12包圍四周的空間形成了微容器11。另外，在各微容器11的四邊形成的側(cè)壁12的各邊的中央部，形成開口部13。圖1中，表示了微容器11的底部的寬度a、用于劃分微容器11的側(cè)壁12的寬度b、 高度c、用于使相鄰的微容器11相互連通的開口部13的寬度d。本發(fā)明的底部面積是指， 在與微容器開口水平面(與側(cè)壁12上面為同一面)垂直的方向上、從上方向容器底部照射平行光時的投影面積。例如，當(dāng)微容器的底部為U字形狀時，從與其開口面為垂直方向的上方射向底部的平行光所投影的形狀形成底部面積。對于投影底部的長徑和短徑，當(dāng)為圓和橢圓時，將通過其重心的長軸和短軸與圓周的交點在各軸上的距離作為長徑和短徑，當(dāng)為多角形時，是指與該多角形的面積之差最小且通過各頂點的外接圓或外接橢圓的長徑和短徑，當(dāng)不能描繪通過各頂點的外接圓或外接橢圓時，是指通過最多頂點的近似圓或橢圓的長徑和短徑。微容器11的底部形狀沒有特別地限定，除了正方形、圓、多角形以外還可以采用多種形狀。在再現(xiàn)在生物體內(nèi)的肝功能的細(xì)胞培養(yǎng)中，該底部面積優(yōu)選為0.01mm2 0.1mm2。另外，優(yōu)選底部的長徑為短徑的1 1.5倍。進(jìn)一步地，優(yōu)選為等方的形狀，如果是正方形，則例如形成當(dāng)量直徑為100 μ m的肝細(xì)胞團(tuán)時，優(yōu)選一邊的長度為100 μ m 300 μ Hlo微容器11的水平面與側(cè)壁12形成的角度必須是使細(xì)胞不越上(乗”上(f )的角度，因此優(yōu)選從側(cè)面的上部起50%以上的部分為80° 90°，特別優(yōu)選85° 90°。側(cè)壁12的高度c只要不使在微容器11中培養(yǎng)的細(xì)胞越上并向相鄰的微容器11 轉(zhuǎn)移即可，例如當(dāng)形成當(dāng)量直徑為100 μ m的肝細(xì)胞團(tuán)時，優(yōu)選為50 μ m 150 μ m。用于使相鄰的微容器11相互連通的開口部13的寬度d，只要是使培養(yǎng)細(xì)胞不能從最初接種的微容器11向相鄰的微容器11轉(zhuǎn)移的程度即可。例如，如果培養(yǎng)細(xì)胞的當(dāng)量直徑為20 μ m,則優(yōu)選為5 15 μ m。應(yīng)予說明，開口部13不是必須的，如圖3和圖4所示，微容器11的四邊也可以被側(cè)壁12完全地圍住。其中，圖3是表示本實施方式的其他的細(xì)胞培養(yǎng)容器的構(gòu)成的平面圖，圖4是圖3的IV-IV截面圖。另外，如圖5和圖6所示的那樣，本實施方式的細(xì)胞培養(yǎng)容器也可以具有包含預(yù)定數(shù)的多個微容器的、被劃分的處所。其中，圖5是表示本實施方式的進(jìn)而其他的細(xì)胞培養(yǎng)部的構(gòu)成的平面圖，圖6是圖5的VI-VI截面圖。在圖5和圖6中，表示使用圖3和圖4所示的微容器的結(jié)構(gòu)的例子。圖5中，表示劃分出多個微容器的側(cè)壁24和被劃分的處所23。 側(cè)壁24的高度d只要是可保持培養(yǎng)液或反應(yīng)液等的上清液不干燥的容量即可，可以適當(dāng)設(shè)定。通過具有側(cè)壁24，可在各處所23中使用不同的培養(yǎng)基。另外，在圖5和圖6中，表示具有側(cè)壁24的構(gòu)成例，但也可以是不具有側(cè)壁24的構(gòu)成。作為制作細(xì)胞培養(yǎng)容器上的凹凸格局的方法，沒有特別地限定，例如可以列舉使用了模子的轉(zhuǎn)印成型、3維光造形、精密機械切削、濕式蝕亥IJ、干式蝕亥IJ、激光加工、放電加工等的方法。優(yōu)選考慮細(xì)胞培養(yǎng)容器的用途、要求的加工精度、成本等來適當(dāng)選擇這些制造方法。作為使用模子進(jìn)行轉(zhuǎn)印成型方法的具體例子，可以列舉以金屬結(jié)構(gòu)體作為模具通過樹脂成型形成凹凸格局的方法。該方法可以以高的轉(zhuǎn)印率將金屬結(jié)構(gòu)體的形狀對樹脂再現(xiàn)凹凸格局，另外通過使用通用的樹脂材料，可以降低材料成本，因此是優(yōu)選的。使用這種金屬結(jié)構(gòu)體的模具的方法是低成本的，在可滿足高的尺寸精度這方面是優(yōu)異的。上述金屬結(jié)構(gòu)體的制造方法例如可以列舉對利用光刻法制作的抗蝕圖形或利用3 維光造形制作的樹脂圖案的鍍敷處理、精密機械切削、濕式蝕刻、干式蝕刻、激光加工、放電加工等。只要考慮用途、要求的加工精度、成本等進(jìn)行適當(dāng)選擇即可。作為使用上述得到的金屬結(jié)構(gòu)體作為模具來對樹脂進(jìn)行凹凸格局的成型的方法， 例如可以列舉注射成型、加壓成型、單體澆鑄成型、溶劑澆鑄成型、熱壓印〃卜工
成型、采用擠出成型的輥轉(zhuǎn)印等的方法。從生產(chǎn)性和模具轉(zhuǎn)印性的角度考慮，優(yōu)選采用注射成型。作為構(gòu)成細(xì)胞培養(yǎng)容器的材料，只要是具有自身支持性的材料即可，沒有特別地限定，例如可以列舉合成樹脂、硅、玻璃等。從成本方面或利用顯微鏡觀察時的細(xì)胞可見性的角度考慮，優(yōu)選以透明的合成樹脂作為材料。作為透明的合成樹脂，例如可以列舉聚甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯-苯乙烯共聚物等的丙烯酸系樹脂、聚苯乙烯等的苯乙烯系樹脂、環(huán)烯烴等的烯烴系樹脂、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚乳酸等的酯系樹脂、聚二甲基硅氧烷等的有機硅系樹脂、聚碳酸酯樹脂等。在不損害透明性的范圍內(nèi)，也可以在這種樹脂中含有著色劑、擴散劑、增稠劑等的各種添加劑。對于細(xì)胞培養(yǎng)容器，為了提高容器表面的親水性、生物體適應(yīng)性、細(xì)胞親和性等， 也可以在凹凸格局表面?zhèn)冗M(jìn)行表面處理，配置改性層和/或涂布層。作為設(shè)置上述改性層的方法，只要不是喪失自身支持性的方法或產(chǎn)生100 μ m以上的極端的表面粗糙的方法即可，沒有特別地限定，例如可以列舉藥物處理、溶劑處理、利用表面接枝聚合引入接枝聚合物等的化學(xué)性處理、電暈放電、臭氧處理、等離子體處理等的物理性處理等的方法。另外，作為設(shè)置涂布層的方法，沒有特別地限定，例如可以列舉濺射、蒸鍍等的干式涂布、無機材料涂布、聚合物涂布等的濕式涂布等的方法。為了在不混入氣泡地注入培養(yǎng)液，期望在凹凸格局上賦予親水性，作為形成均勻的親水性膜的方法，優(yōu)選無機蒸鍍。另外，當(dāng)考慮到細(xì)胞親和性時，更優(yōu)選涂布例如膠原、纖維結(jié)合素等的細(xì)胞親和性蛋白質(zhì)。為了均勻地涂布膠原水溶液等，優(yōu)選在形成上述親水性膜后進(jìn)行涂布。通常，在肝細(xì)胞培養(yǎng)中，期望模擬生物體內(nèi)環(huán)境在細(xì)胞外基質(zhì)表面進(jìn)行培養(yǎng)，因此特別優(yōu)選如上所述， 在配置了均勻的親水性無機膜后，再配置包含適合培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)的有機膜。另外，對于使用上述細(xì)胞培養(yǎng)容器的細(xì)胞培養(yǎng)方法，為了使細(xì)胞僅配置在培養(yǎng)細(xì)胞的微容器中，并在該空間內(nèi)表現(xiàn)類似于生物體內(nèi)的形態(tài)或功能，需要接種適當(dāng)?shù)募?xì)胞數(shù)， 優(yōu)選細(xì)胞接種密度為1.0 X IO2 1.0 X IO6細(xì)胞/cm2，更優(yōu)選細(xì)胞接種密度為1.0X IO4 1.0X IO6細(xì)胞/cm2。例如當(dāng)微容器為正方形、且一邊長為200 μ m時，優(yōu)選5. OX IO4 5. OX IO5細(xì)胞/cm2?；谶@種條件，可以得到直徑達(dá)到30 200 μ m的肝細(xì)胞團(tuán)。接著，對于本實施方式的細(xì)胞保存方法進(jìn)行說明。細(xì)胞保存方法是使用上述具有多個微容器的細(xì)胞培養(yǎng)容器來培養(yǎng)活細(xì)胞，并進(jìn)行保存的方法。具體來說，首先進(jìn)行使活細(xì)胞粘附于細(xì)胞培養(yǎng)容器的多個微容器的表面并進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)工序。接著，向細(xì)胞培養(yǎng)容器注入培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)以覆蓋多個微容器、進(jìn)行保存的準(zhǔn)備的保存準(zhǔn)備工序。保存這樣制成的細(xì)胞培養(yǎng)容器(保存工序)。以下更詳細(xì)地說明各工序。首先，對于培養(yǎng)工序進(jìn)行說明?；罴?xì)胞使用粘附性的細(xì)胞。通過使活細(xì)胞粘附在微容器表面，可以防止保存、運輸中活細(xì)胞沖撞微容器的表面等、防止從微容器流出。由此， 抑制培養(yǎng)的活細(xì)胞的功能損失，或者防止由于活細(xì)胞從培養(yǎng)基露出而導(dǎo)致的干燥、由此導(dǎo)致的細(xì)胞功能的降低等。培養(yǎng)的活細(xì)胞可以使用實質(zhì)細(xì)胞。具體來說，可以使用肝細(xì)胞、胰β細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、皮膚上皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、組織干細(xì)胞、ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞(induced pluripotent stem cells)中的任一者?；蛘呤褂糜山M織干細(xì)胞、ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞中的任一者分化的肝細(xì)胞、胰β細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、皮膚上皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中的任一者。培養(yǎng)工序中，包括⑴使細(xì)胞粘附的工序，(2)除去非粘附細(xì)胞的工序，(3)進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞、使其增殖、鋪展或聚集的工序。通過除去非粘附細(xì)胞，可以除去廢物，能夠防止培養(yǎng)基被污染。另外，通過進(jìn)一步培養(yǎng)增殖等，將活細(xì)胞培養(yǎng)至期望的細(xì)胞團(tuán)的大小。例如， 進(jìn)行增殖、鋪展、聚集，直至使細(xì)胞聚集塊的直徑為3(Γ200μπι。各微容器設(shè)計成可放入期望的細(xì)胞團(tuán)的大小。這樣，進(jìn)行活細(xì)胞的培養(yǎng)，以使活細(xì)胞粘附(接種)在多個微容器的表面、且在各微容器的空間內(nèi)形成的三維結(jié)構(gòu)體的細(xì)胞群體形成被隔離的細(xì)胞數(shù)。通過上述工序，在微容器內(nèi)形成相當(dāng)于1個三維結(jié)構(gòu)體份的細(xì)胞數(shù)的細(xì)胞群體， 并隔離。其中，將在微容器內(nèi)形成的細(xì)胞群體(細(xì)胞團(tuán))作為1份。利用微容器活細(xì)胞根據(jù)活細(xì)胞的大小而用高的壁隔離，且活細(xì)胞粘附于微容器。因此，與相鄰的三維結(jié)構(gòu)體不相接。由此，即使在非靜置環(huán)境(運輸狀態(tài)等)下，活細(xì)胞也可以形成或維持均勻的三維結(jié)構(gòu)體。接著，對于保存準(zhǔn)備工序進(jìn)行說明。培養(yǎng)基以不使培養(yǎng)的活細(xì)胞干燥、還不與外部空氣接觸的量來注入。保存中使用的培養(yǎng)基是含有營養(yǎng)成分的介質(zhì)，例如含有血清或增殖因子等的血中成分。培養(yǎng)基所含的成分根據(jù)保存的活細(xì)胞來確定。另外，細(xì)胞培養(yǎng)容器利用密封裝置密封，以使培養(yǎng)基不漏出。細(xì)胞培養(yǎng)容器是例如在具有開口部分的平皿或板、燒瓶中形成多個微容器的容器。在密封時，用膜或帽等的密封裝置覆蓋細(xì)胞培養(yǎng)容器的上面的開口部分，以使活細(xì)胞與外部隔離的狀態(tài)保存。密封裝置可以使用可阻斷液體或氣體的流入的材質(zhì)的裝置，也可以使用可使二氧化碳或氧透過的裝置。其根據(jù)保存的活細(xì)胞或培養(yǎng)狀態(tài)進(jìn)行選擇即可。另外，當(dāng)運輸活細(xì)胞時，必須密封，以使培養(yǎng)基不漏出，但在靜置狀態(tài)下進(jìn)行保存期間，可以是加上蓋子的狀態(tài)，以達(dá)到能夠防止培養(yǎng)基干燥的程度，也可以是以開口部分的狀態(tài)進(jìn)行保存的情況。根據(jù)活細(xì)胞的保存狀態(tài)， 細(xì)胞培養(yǎng)容器也可以是不密封的狀態(tài)。最后對于保存工序進(jìn)行說明。保存時，細(xì)胞培養(yǎng)容器優(yōu)選調(diào)節(jié)至在4°C以上且小于 37°C的溫度范圍的任意溫度，更優(yōu)選6°C以上且小于25°C，進(jìn)一步優(yōu)選10°C以上且20°C以下。另外，保存工序還含有將在保存準(zhǔn)備工序制作的密封的細(xì)胞培養(yǎng)容器進(jìn)行運輸?shù)钠陂g。 優(yōu)選在運輸期間也實施溫度調(diào)節(jié)。這里，保存準(zhǔn)備工序結(jié)束后的細(xì)胞培養(yǎng)容器的狀態(tài)例示于圖7。圖7中，表示使用如圖5和圖6所示的細(xì)胞培養(yǎng)容器，進(jìn)行培養(yǎng)工序和保存準(zhǔn)備工序的一個例子，在圖6所示的截面圖中補加了活細(xì)胞40和密封裝置30。具體來說，在細(xì)胞培養(yǎng)容器20內(nèi)的各微容器 11中粘附活細(xì)胞40，并進(jìn)行培養(yǎng)。圖7中，活細(xì)胞40用涂黑的圓簡略地表示，培養(yǎng)基50表示放入至雙點劃線的位置。密封裝置30將細(xì)胞培養(yǎng)容器20密封。圖7所示的培養(yǎng)基的量作為一個例子，例如有注入容器的三分之一容積的培養(yǎng)基的情況，也有注入培養(yǎng)基，直至與密封裝置30之間沒有空氣層的狀態(tài)的情況。培養(yǎng)基的容量根據(jù)活細(xì)胞的種類、培養(yǎng)狀態(tài)等來適當(dāng)?shù)剡x擇。如以上說明的那樣，根據(jù)上述實施方式的一種方式，可以不使用特殊的高分子，而使活細(xì)胞以與硬塑料狀的培養(yǎng)基板粘附的狀態(tài)形成三維結(jié)構(gòu)來進(jìn)行保存。已知活細(xì)胞在形成三維結(jié)構(gòu)體時，可以提高細(xì)胞的功能。因此，在培養(yǎng)活細(xì)胞后，能夠以維持功能的狀態(tài)進(jìn)行保存。進(jìn)一步地，當(dāng)使用車輛、船舶、航空器等的運輸裝置運輸細(xì)胞時，由于運輸中的環(huán)境要素、例如振動、溫度、CO2濃度(培養(yǎng)基的PH的變化)等，有細(xì)胞的功能進(jìn)一步降低的擔(dān)心，或者由于運輸中產(chǎn)生的振動，有由于細(xì)胞的剝離或凝膠的損壞導(dǎo)致細(xì)胞凋亡等的擔(dān)心。 對于這些問題，通過使用本發(fā)明實施方式的一個方式，可以維持活細(xì)胞的功能進(jìn)行運輸。例如當(dāng)將從生物體分離的新鮮肝細(xì)胞運輸?shù)狡渌胤綍r，可以應(yīng)用本發(fā)明。特別地，從生物體分離的新鮮肝細(xì)胞僅可生存規(guī)定的時間(60小時)。這種情況下，可以期待能夠以維持新鮮肝細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)、維持功能的狀態(tài)運輸細(xì)胞。另外，當(dāng)將從生物體分離的新鮮肝細(xì)胞以冷凍的狀態(tài)運輸時，也可以應(yīng)用本發(fā)明的一種方式，通過在將冷凍細(xì)胞融化后使用本發(fā)明的方法，可以期待能夠以非冷凍狀態(tài)保存或運輸。進(jìn)一步地，當(dāng)使用凝膠等的高分子運輸活細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)時，有凝膠從活細(xì)胞剝落，或者凝膠的形狀變形，由此破壞活細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)的情況，但通過應(yīng)用本發(fā)明的一個方式，可期待能夠以維持三維結(jié)構(gòu)、維持功能的狀態(tài)運輸活細(xì)胞。 實施例接著，對于本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方法的實施例進(jìn)行說明，但本發(fā)明不限于這些實施例。[實施例01]
用具有多個微空間的細(xì)胞培養(yǎng)容器保存的情況和用平板保存的情況的實施例 (培養(yǎng)容器) <實施例01>
利用光刻來制作作為圖3、4所示的凹凸格局形狀的、a=200 μ m、b=20 μ m、c=50 μ m的格局，進(jìn)行Μ電鍍，得到具有相應(yīng)的凹凸形狀的模具。使用該模具，利用熱壓印成型在聚苯乙烯上進(jìn)行凹凸格局形狀的轉(zhuǎn)印，制作上述尺寸的樹脂基材。制作在該樹脂基材表面利用真空蒸鍍形成了 IOOnm 二氧化硅膜的膜，利用激光熔接法在聚苯乙烯制的沒有培養(yǎng)底面的M 孔板上貼合膜后，進(jìn)行Y射線滅菌，制作M孔的具有多個微空間的培養(yǎng)容器，用于保存試驗。
權(quán)利要求
1.細(xì)胞保存方法，其是使用具有多個微空間的細(xì)胞培養(yǎng)容器來保存活細(xì)胞的細(xì)胞保存方法，其中，使活細(xì)胞粘附于上述多個微空間的表面進(jìn)行培養(yǎng)，在上述培養(yǎng)后，將培養(yǎng)基向上述細(xì)胞培養(yǎng)容器注入，以覆蓋上述多個微空間，將上述細(xì)胞培養(yǎng)容器密封，以使培養(yǎng)基不漏出，保存上述活細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞保存方法，其特征在于，上述細(xì)胞培養(yǎng)容器保持在4°C以上且小于37°C的溫度來保存上述活細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞保存方法，其特征在于，進(jìn)行上述培養(yǎng)，以使粘附于上述表面、且在各微空間的空間內(nèi)形成的三維結(jié)構(gòu)體的細(xì)胞群體形成被隔離的細(xì)胞數(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求廣3中任一項所述的細(xì)胞保存方法，其特征在于，上述多個微空間的底部面積為0. ΟΓΟ. 1mm2，深度為25 150 μ m。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、中任一項所述的細(xì)胞保存方法，其特征在于，上述活細(xì)胞是肝細(xì)胞、胰β細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、皮膚上皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、組織干細(xì)胞、ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞中的任一者。
6.根據(jù)權(quán)利要求廣4中任一項所述的細(xì)胞保存方法，其特征在于，上述活細(xì)胞是由組織干細(xì)胞、ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞中的任一者分化的、肝細(xì)胞、胰β細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、 皮膚上皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中的任一者。
7.根據(jù)權(quán)利要求廣6中任一項所述的細(xì)胞保存方法，其特征在于，在上述培養(yǎng)后，除去非粘附細(xì)胞后將上述培養(yǎng)基向上述細(xì)胞培養(yǎng)容器注入。
8.根據(jù)權(quán)利要求廣7中任一項所述的細(xì)胞保存方法，其特征在于，上述活細(xì)胞的培養(yǎng)為，在使活細(xì)胞粘附并進(jìn)行培養(yǎng)后，進(jìn)一步進(jìn)行培養(yǎng)，使其增殖、鋪展或者聚集。
9.根據(jù)權(quán)利要求廣8中任一項所述的細(xì)胞保存方法，其中，以IXIiTlX IO6細(xì)胞/cm2 的細(xì)胞接種密度將活細(xì)胞接種在上述多個微空間中。
10.根據(jù)權(quán)利要求廣9中任一項所述的細(xì)胞保存方法，其特征在于，在上述多個微空間中形成有活細(xì)胞集聚的細(xì)胞團(tuán)。
11.根據(jù)權(quán)利要求廣10中任一項所述的細(xì)胞保存方法，其特征在于，上述細(xì)胞團(tuán)的直徑為30 200 μ m。
12.根據(jù)權(quán)利要求廣11中任一項所述的細(xì)胞保存方法，其特征在于，上述培養(yǎng)基含有血清、增殖因子和血中成分中的至少一種。
13.根據(jù)權(quán)利要求廣12中任一項所述的細(xì)胞保存方法，其特征在于，使用使氧或二氧化碳透過的膜來密封上述細(xì)胞培養(yǎng)容器。
14.細(xì)胞運輸方法，其是將活細(xì)胞保存于具有多個微空間的細(xì)胞培養(yǎng)容器并運輸?shù)募?xì)胞運輸方法，其中，使活細(xì)胞粘附于上述多個微空間的表面進(jìn)行培養(yǎng)，上述培養(yǎng)后，將培養(yǎng)基向上述細(xì)胞培養(yǎng)容器注入，以覆蓋上述多個微空間，將上述細(xì)胞培養(yǎng)容器密封，以使培養(yǎng)基不漏出，使用車輛、船舶或者航空器中的任一種運輸裝置將密封的上述細(xì)胞培養(yǎng)容器進(jìn)行運輸。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的細(xì)胞運輸方法，其特征在于，上述細(xì)胞培養(yǎng)容器保持在4°C以上且小于37°C的溫度 。
全文摘要
本發(fā)明提供以維持活細(xì)胞的功能的狀態(tài)保存活細(xì)胞的細(xì)胞保存方法。細(xì)胞保存方法的一個方式是使用具有多個微容器(11)的細(xì)胞培養(yǎng)容器(20)來保存活細(xì)胞(40)的方法，其中，使活細(xì)胞粘附于多個微空間的表面來進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)后，將培養(yǎng)基(50)向細(xì)胞培養(yǎng)容器(20)注入，以覆蓋多個微容器(11)。在適當(dāng)大小的細(xì)胞培養(yǎng)容器中粘附活細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，形成三維結(jié)構(gòu)體，由此可以以維持活細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)體、且維持功能的狀態(tài)保存活細(xì)胞。
文檔編號C12N5/071GK102203241SQ20098014221
公開日2011年9月28日 申請日期2009年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日
發(fā)明者一丁田洋子, 田崎剛, 福田始弘, 谷口英樹, 鶴田仁志 申請人:公立大學(xué)法人橫浜市立大學(xué), 可樂麗股份有限公司