專利名稱：用于dmd的多外顯子跳躍組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及適合促進(jìn)人肌營養(yǎng)不良蛋白基因的外顯子跳躍的新反義化合物和組合物。還提供了使用適合用于本發(fā)明方法的反義組合物誘導(dǎo)外顯子跳躍的方法。
背景技術(shù)：
使用多種化學(xué)制劑在不同水平上(轉(zhuǎn)錄、剪接、穩(wěn)定性、翻譯)影響基因表達(dá)，發(fā)展了反義技術(shù)。這類研究中有許多在指征的寬泛范圍內(nèi)專注于使用反義化合物校正或補(bǔ)償異常或疾病相關(guān)基因。反義分子能夠特異性地抑制基因表達(dá)，因此，許多研究，其致力于作為基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑的寡核苷酸，已關(guān)注于抑制靶向基因(targeted gene)的表達(dá)或順式作用元件的功能。在一些病毒RNA靶標(biāo)的情況下，反義寡核苷酸通常針對(duì)RNA，或正義鏈(如 mRNA)或是負(fù)鏈。為了實(shí)現(xiàn)特定基因減量調(diào)節(jié)的期望效果，寡核苷酸通常促進(jìn)靶向mRNA的降解，阻斷mRNA的翻譯或阻斷順式作用RNA元件的功能，由此有效地防止靶蛋白的從頭合成或病毒RNA的復(fù)制。然而，如果目的是上調(diào)天然蛋白的產(chǎn)生或補(bǔ)償誘導(dǎo)翻譯的提前終止的突變，例如無義或移碼突變，則這些技術(shù)不起作用。在這些情況中，缺陷型基因轉(zhuǎn)錄物不會(huì)進(jìn)行靶向降解(targeted degration)或空間抑制，所以反義寡核苷酸化學(xué)制劑不會(huì)促進(jìn)靶mRNA降解或阻斷翻譯。在許多遺傳疾病中，突變對(duì)基因最終表達(dá)的影響可通過剪接過程中靶向外顯子跳躍的過程進(jìn)行調(diào)節(jié)。該剪接過程受復(fù)雜多成分機(jī)制的指導(dǎo)，該機(jī)制使mRNA前體(pre-mRNA) 中的相鄰?fù)怙@子-內(nèi)含子連接緊密相連并切割內(nèi)含子末端的磷酸二酯鍵，伴隨著它們?cè)谝艚釉谝黄鸬耐怙@子之間的后續(xù)改造。這個(gè)復(fù)雜且高度精確過程是通過mRNA前體中的序列基元介導(dǎo)的，所述序列基元是相對(duì)半保守的RNA片段，參與之后剪接反應(yīng)的許多核剪接因子都與其結(jié)合。通過改變剪接機(jī)制讀取或識(shí)別參與mRNA前體加工的基元的方式，可以產(chǎn)生差異化的剪接mRNA分子。現(xiàn)在已認(rèn)識(shí)到大部分人基因在正?；虮磉_(dá)過程中可選地剪接，盡管仍未鑒定出相關(guān)機(jī)制。在正常功能蛋白因突變而提前終止的情況中，通過反義技術(shù)恢復(fù)一些功能蛋白產(chǎn)生的方式已經(jīng)表明，在剪接過程通過干擾是可能的，并且如果與致病突變相關(guān)的外顯子可被從一些基因中特異性地缺失，則有時(shí)會(huì)產(chǎn)生縮短的蛋白產(chǎn)物，其具有與天然蛋白相似的生物特性或具有足以改善由與外顯子相關(guān)的突變導(dǎo)致的疾病的生物活性(Sierakowska，Sambade et al. 1996 ；Wilton, Lloyd et al. 1999 ；van Deutekom, Bremmer-Bout et al. 2001 ；Lu, Mann et al. 2003 ；Aartsma-Rus, Janson et al. 2004)。Kole 等(美國專利第5，627，274號(hào)、第5，916，808號(hào)、第5，976，879號(hào)以及第5，665，593號(hào))公開了使用不會(huì)促進(jìn)靶向mRNA前體降解的修飾的反義寡核苷酸類似物與異常剪接斗爭的方法。Bennett 等(美國專利第6，210，892號(hào))描述了野生型細(xì)胞mRNA加工的反義調(diào)控也使用不會(huì)誘導(dǎo) RNAse H-介導(dǎo)的靶RNA切割的反義寡核苷酸類似物。靶向外顯子跳躍的過程可能特別可用于長基因，在所述長基因中，有許多外顯子和內(nèi)含子，有多余的外顯子的基因組成或蛋白無需一個(gè)或多個(gè)特定外顯子就能夠發(fā)揮功能。使基因加工重定向用于治療與各種基因中的突變所導(dǎo)致的截短相關(guān)的遺傳疾病的努力，致力于使用以下反義寡核苷酸其(1)與參與剪接過程的元件完全或部分重疊；或(2) 在足夠接近元件位置上與mRNA前體結(jié)合以阻止正常介導(dǎo)在該元件中發(fā)生的特定剪接反應(yīng)的剪接因子的結(jié)合和功能。杜興肌營養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是由于肌營養(yǎng)不良蛋白表達(dá)上的缺陷導(dǎo)致的。編碼該蛋白的基因含有遍布于超過2百萬個(gè)核苷酸的DNA中的79個(gè)外顯子。任何外顯子突變，會(huì)改變外顯子讀碼框(reading frame)，或引入終止密碼子，或特征在于去除完整的框外外顯子或多個(gè)外顯子或一個(gè)或多個(gè)外顯子的副本，因此都可有潛力干擾功能性肌營養(yǎng)不良蛋白的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致DMD。肌營養(yǎng)不良不太嚴(yán)重的形式是貝克肌營養(yǎng)不良(Becker muscular dystrophy, BMD)，據(jù)發(fā)現(xiàn)，其發(fā)生的原因在于，突變通常是一個(gè)或多個(gè)外顯子的缺失導(dǎo)致沿著整個(gè)肌營養(yǎng)不良蛋白轉(zhuǎn)錄物的正確讀碼框，使得mRNA翻譯為蛋白不會(huì)提前終止。如果在突變的肌營養(yǎng)不良蛋白mRNA前體加工中，上游和下游外顯子的連接保持了基因的正確讀碼框，則結(jié)果是編碼具有短的內(nèi)部缺失的蛋白的mRNA，所述蛋白保留了導(dǎo)致貝克表型的一些活性。一個(gè)外顯子或多個(gè)外顯子的缺失不會(huì)改變肌營養(yǎng)不良蛋白的讀碼框，但會(huì)引起 BMD表型，而導(dǎo)致移碼的外顯子缺失將引起DMD(Monaco，Bertelson et al. 1988)。通常，肌營養(yǎng)不良蛋白突變包括改變讀碼框從而阻斷正常蛋白翻譯的點(diǎn)突變和外顯子缺失，因而導(dǎo)致DMD。還應(yīng)該指出，一些BMD和DMD患者具有覆蓋多個(gè)外顯子的外顯子缺失。盡管反義分子可以為治療杜興肌營養(yǎng)不良(DMD)提供工具，使用反義分子誘導(dǎo)外顯子跳躍的嘗試成效不一。使用定向于外顯子內(nèi)的側(cè)翼接剪接位點(diǎn)或基元的多種反義分子成功實(shí)現(xiàn)了肌營養(yǎng)不良蛋白外顯子19從肌營養(yǎng)不良蛋白mRNA前體的跳躍，所述外顯子包含在如Errington等(Errington, Mann et al. 2003)所述的外顯子定義中。Wilton等(Wilton, Lloyd et al. 1999)首次報(bào)道了在mdx小鼠模型中特異性的可重復(fù)的外顯子跳躍的實(shí)例。通過使反義分子定向于供體剪接位點(diǎn)，在將培養(yǎng)的細(xì)胞處理6 小時(shí)之內(nèi)，在肌營養(yǎng)不良蛋白mRNA中誘導(dǎo)了外顯子23跳躍。Wilton等還描述了用更長的反義寡核苷酸靶向小鼠肌營養(yǎng)不良蛋白mRNA前體的受體區(qū)域。盡管定向于內(nèi)含子23供體剪接位點(diǎn)的第一反義寡核苷酸誘導(dǎo)了原代培養(yǎng)的成肌細(xì)胞(primary cultured myoblast) 中的外顯子跳躍，但是發(fā)現(xiàn)該化合物在表達(dá)更高水平的肌營養(yǎng)不良蛋白的永生細(xì)胞培養(yǎng)物中效力低得多。盡管有這些努力，仍需要用于DMD治療應(yīng)用的靶向多個(gè)肌營養(yǎng)不良蛋白外顯子的改善的反義寡聚體和改善的肌送遞組合物和方法。
發(fā)明概述本發(fā)明的實(shí)施方案通常涉及能夠結(jié)合選定的靶標(biāo)以誘導(dǎo)外顯子跳躍的反義化合物，和使用所述反義化合物誘導(dǎo)外顯子跳躍的方法。在某些實(shí)施方案中，可以將本發(fā)明的兩個(gè)或多個(gè)反義寡核苷酸組合在一起，來誘導(dǎo)單個(gè)或多個(gè)外顯子跳躍。在某些實(shí)施方案中，可以通過將兩個(gè)或多個(gè)反義寡核苷酸分子共價(jià)連接在一起， 改善單個(gè)或多個(gè)外顯子的外顯子跳躍(參見例如Aartsma-Rus，Janson et al. 2004)。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義化合物誘導(dǎo)了人肌營養(yǎng)不良蛋白基因中的外顯子跳躍，由此使得肌肉細(xì)胞產(chǎn)生功能性肌營養(yǎng)不良蛋白。本發(fā)明的反義寡核苷酸化合物(在本文中也稱為寡聚體)通常(i)包含嗎啉代亞基和將一個(gè)亞基的嗎啉代氮與相鄰亞基的5’環(huán)外碳連接的含磷亞基間連接，(ii)含有 10-40個(gè)堿基，優(yōu)選20-35個(gè)堿基，(iii)包含可有效地與肌營養(yǎng)不良蛋白mRNA前體中靶序列的至少12個(gè)連續(xù)堿基交雜并誘導(dǎo)外顯子跳躍的堿基序列。在某些實(shí)施方案中，根據(jù)下述結(jié)構(gòu)(I)，本發(fā)明的反義化合物可包含含磷亞基間連接，所述連接將一個(gè)亞基的嗎啉代氮與相鄰亞基的5’環(huán)外碳連接其中Y1 是-0-、-S-、-NH-或-CH2-；Z 是 0 或 S ；Pj是通過堿基特異性氫鍵合有效地與多核苷酸堿基結(jié)合的嘌呤或嘧啶堿基對(duì)部分；和X是氟，任選地取代的烷基，任選地取代的烷氧基，任選地取代的硫代烷氧基，氨基，任選地取代的烷氨基，或任選地取代的雜環(huán)基。在某些實(shí)施方案中，不帶電的上述亞基間連接可以散布著在生理pH中帶正電荷的連接，其中正電荷的連接的總數(shù)在2和不大于連接總數(shù)一半之間。例如，帶正電荷的連接可具有上述結(jié)構(gòu)，其中X是任選地取代的1-哌嗪基。在其他實(shí)施方案中，帶正電荷連接可具有上述結(jié)構(gòu)，其中X是取代的1-哌嗪基，其中1-哌嗪基是在4位上被任選地取代的烷基胍基部分取代。如果給予的反義化合物可有效地靶向預(yù)加工的人肌營養(yǎng)不良蛋白的剪接位點(diǎn)，則它可具有與含有預(yù)加工的信使RNA(mRNA)人肌營養(yǎng)不良蛋白轉(zhuǎn)錄物中的至少12個(gè)連續(xù)堿基的靶區(qū)域互補(bǔ)的堿基序列。示例性反義序列包括SEQ ID NOS :1-569和612-633所確定的那些序列。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義序列包含于(a) SEQ ID NOS 1-20，優(yōu)選地 SEQ ID NOS :4、8、11 和 12，和更優(yōu)選地 SEQ IDNO 12所確定的任何序列，用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預(yù)加工的mRNA的加工中產(chǎn)生外顯子44跳躍；(b)SEQ ID NOS :21-76 和 612-624，優(yōu)選地 SEQ ID NOS :27、四、34 和 39，和更優(yōu)選地SEQ IDNO :34所確定的任何序列，用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預(yù)加工的mRNA的加工中產(chǎn)生外顯子45跳躍；(c)SEQ ID NOS :77_125，優(yōu)選地 SEQ ID NOS :21_53，和更優(yōu)選地 SEQ IDNO :82、 84-87、90、96、98、99和101所確定的任何序列，用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預(yù)加工的mRNA的加工中產(chǎn)生外顯子46跳躍；(d)SEQ ID NOS 1洸_169，優(yōu)選地 SEQ ID NOS 1洸_149，和更優(yōu)選地 SEQ IDNO 126、128-130、132、144和146-149所確定的任何序列，用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預(yù)加工的 mRNA的加工中產(chǎn)生外顯子47跳躍；(e)SEQ ID NOS 170-224 和 634，優(yōu)選地 SEQ ID NOS :170-201 和 634，和更優(yōu)選地 SEQ IDNO 176、178、181-183、194和198-201所確定的任何序列，用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預(yù)加工的mRNA的加工中產(chǎn)生外顯子48跳躍；(f) SEQ ID NOS :225-266，優(yōu)選地 SEQ ID NOS :225_248，和更優(yōu)選地 SEQ IDNO 227、229、234、236、237和244-248所確定的任何序列，用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預(yù)加工的 mRNA的加工中產(chǎn)生外顯子49跳躍；(g)SEQ ID NOS :267-308，優(yōu)選地 SEQ ID NOS :277、287 和四0，和更優(yōu)選地 SEQ IDNO 287所確定的任何序列，用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預(yù)加工的mRNA的加工中產(chǎn)生外顯子50跳躍；QOSEQ ID NOS :309-371，優(yōu)選地 SEQ ID NOS :324、326 和 327，和更優(yōu)選地 SEQ IDNO 327所確定的任何序列，用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預(yù)加工的mRNA的加工中產(chǎn)生外顯子51跳躍；(i)SEQ ID NOS :372-415,優(yōu)選地 SEQ ID NOS :372_397，和更優(yōu)選地 SEQ IDNO 379-382,384,390和392-395所確定的任何序列，用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預(yù)加工的mRNA 的加工中產(chǎn)生外顯子52跳躍；(j) SEQ ID NOS :416-475 和 625-633，優(yōu)選地 SEQ ID NOS 似8、似9 和 431，和更優(yōu)選地SEQ IDNO 429所確定的任何序列，用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預(yù)加工的mRNA的加工中產(chǎn)生外顯子53跳躍；(k)SEQ ID NOS :476_519，優(yōu)選地 SEQ ID NOS :476_499，和更優(yōu)選地 SEQ IDNO 479-482、484、489和491-493所確定的任何序列，用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預(yù)加工的mRNA 的加工中產(chǎn)生外顯子M跳躍；(I)SEQ ID NOS :520-569 和 635，優(yōu)選地 SEQ ID NOS :520-546 和 635，和更優(yōu)選地 SEQ IDNO :5對(duì)-5觀、537、539、540、542和544所確定的任何序列，用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預(yù)加工的mRNA的加工中產(chǎn)生外顯子55跳躍；在某些實(shí)施方案中，化合物可與能有效促進(jìn)細(xì)胞吸收化合物的富含精氨酸的多肽偶聯(lián)。示例性肽，除了本文所述的其他肽外，還包括SEQ ID NOS :570-578所確定的肽。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，富含精氨酸的多肽在其N末端或C末端殘基與反義化合物的3’或5’端共價(jià)偶聯(lián)。還在示例性實(shí)施方案中，反義化合物由嗎啉代亞基和將一個(gè)亞基的嗎啉代氮與相鄰亞基的5’環(huán)外碳連接的含磷亞基間連接組成。通常，肽-寡聚體偶聯(lián)物還可包含對(duì)選定的哺乳動(dòng)物組織即與細(xì)胞穿透肽所靶向的相同組織具有選擇性的導(dǎo)向肽(homing peptide) 0該偶聯(lián)物可以是以下形式細(xì)胞穿透肽-導(dǎo)向肽-反義寡聚體，或更優(yōu)選以下形式導(dǎo)向肽-細(xì)胞穿透肽-反義寡寡聚體。例如如上所述用于治療杜興肌營養(yǎng)不良的肽偶聯(lián)化合物還可包含對(duì)肌肉組織具有選擇性的導(dǎo)向肽，例如具有SEQ ID NO :579所確定的序列的肽，其與細(xì)胞穿透肽偶聯(lián)。這種類型的示例性偶聯(lián)物包括本文中表示為CP06062-MSP-PM0 (細(xì)胞穿透肽-導(dǎo)向肽-反義寡聚體)和表示為MSP-CP06062-PM0(導(dǎo)向肽-細(xì)胞穿透肽-反義寡聚體)(參見SEQ ID NOs =580-583) 的那些偶聯(lián)物。在一些實(shí)施方案中，肽通過連接體部分與寡聚體偶聯(lián)。在某些實(shí)施方案中，連接體部分可包含任選地取代的哌嗪部分。在其他實(shí)施方案中，連接體部分還可包含β丙氨酸和 /或6-氨基己酸亞基。仍然在其他實(shí)施方案中，肽直接與寡聚體偶聯(lián)，而無需連接體部分。肽與寡聚體的偶聯(lián)可以位于任何適合在肽和寡聚體之間或在連接體部分和寡聚體之間形成共價(jià)鍵的位置。例如，在一些實(shí)施方案中，肽的偶聯(lián)可以位于寡聚體的3’端。在其他實(shí)施方案中，肽與寡聚體的偶聯(lián)可以位于寡聚體的5’端。仍然在其他實(shí)施方案中，肽可以通過任何亞基間連接與寡聚體偶聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，肽在寡聚體的5’端與寡聚體偶聯(lián)。在包含含磷亞基間連接的實(shí)施方案中，肽可以通過與末端連接基團(tuán)的磷的共價(jià)鍵與寡聚體偶聯(lián)。這種方式的偶聯(lián)可能需要或不需要上述連接體部分。仍然在其他實(shí)施方案中，肽在寡聚體的3’端與寡聚體偶聯(lián)。在一些其他實(shí)施方案中，肽與寡聚體3’末端嗎啉代基團(tuán)的氮原子偶聯(lián)。在這方面，肽可以直接或通過上述連接體部分與寡聚體偶聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，寡聚體可以與能增強(qiáng)寡聚體在水性介質(zhì)中溶解度的部分偶聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，能增強(qiáng)寡聚體在水性介質(zhì)中溶解度的部分是聚乙二醇。仍然在其他實(shí)施方案中，能增強(qiáng)寡聚體在水性介質(zhì)中溶解度的部分是三乙二醇(triethylene glycol)。例如，在一些實(shí)施方案中，能增強(qiáng)在水性介質(zhì)中溶解度的部分可以在寡聚體的5’ 端與寡聚體偶聯(lián)。能增強(qiáng)寡聚體在水性介質(zhì)中溶解度的部分與寡聚體的偶聯(lián)可以是直接的或通過上述連接體部分。本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供了選定和/或適合輔助遺傳疾病的預(yù)防性治療或治療性治療的反義分子，其包含至少一個(gè)具有適合送遞至患者形式的反義分子。本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供了治療患有遺傳疾病的患者的方法，其中，在編碼特定蛋白的基因中存在突變且突變的影響可通過外顯子跳躍消除，其包括以下步驟(a)按照本文所述方法選擇反義分子；和(b)將分子給予需要這種治療的患者。本發(fā)明也包括純化和分離的本發(fā)明反義寡核苷酸在制備用于治療遺傳疾病的藥物中的用途。某些實(shí)施方案提供了治療肌營養(yǎng)不良例如特征為杜興肌營養(yǎng)不良的疾病狀況的方法，該方法包括給予需要治療的患者有效量的如本文所述的適當(dāng)設(shè)計(jì)的反義寡核苷酸， 該反義寡核苷酸與該患者中的具體基因病變相關(guān)。而且，某些實(shí)施方案提供了預(yù)防性治療患者以便預(yù)防或至少最小化包括杜興肌營養(yǎng)不良在內(nèi)的肌營養(yǎng)不良的方法，其包括以下步驟給予患者有效量的反義寡核苷酸或包含一種或多種這些生物分子的藥物組合物。
某些實(shí)施方案涉及治療個(gè)體的肌營養(yǎng)不良的方法，其包括給予患者有效量的基本不帶電的反義化合物，該反義化合物含有20-35個(gè)通過含磷亞基間連接而連接的嗎啉代亞基，該連接將一個(gè)亞基的嗎啉代氮與相鄰亞基的5’環(huán)外碳連接，該反義化合物包含選自SEQ ID NOS 1-569和612-635且能夠與肌營養(yǎng)不良蛋白基因外顯子中的互補(bǔ)mRNA序列在所述化合物和mRNA之間形成Tm為至少45°C的異源雙鏈體的序列，其中該外顯子選自外顯子 44-55。在某些實(shí)施方案中，肌營養(yǎng)不良是杜興肌營養(yǎng)不良(DMD)。在某些實(shí)施方案中，肌營養(yǎng)不良是貝克肌營養(yǎng)不良(BMD)。在某些實(shí)施方案中，序列選自SEQ ID NOS 1-20,且外顯子是外顯子44。在某些實(shí)施方案中，序列選自SEQ ID NOS :21-76和612-624，且外顯子是外顯子45。在某些實(shí)施方案中，序列選自SEQ ID NOS :77_125，且外顯子是外顯子46。在某些實(shí)施方案中，序列選自SEQ ID NOS 126-169，且外顯子是外顯子47。在某些實(shí)施方案中，序列選自下組SEQ ID NOS :170-2 和634，且外顯子是外顯子48。在某些實(shí)施方案中，序列選自SEQ ID NOS :225力66，且外顯子是外顯子49。在某些實(shí)施方案中，序列選自SEQ ID NOS J67-308，且外顯子是外顯子50。在某些實(shí)施方案中，序列選自下組SEQ ID NOS :309-371，且外顯子是外顯子51。在某些實(shí)施方案中，序列選自下組SEQ ID NOS :372_415，且外顯子是外顯子52。 在某些實(shí)施方案中，序列選自SEQ ID NOS :416-475和625-633，且外顯子是外顯子53。在某些實(shí)施方案中，序列選自SEQ ID NOS :476-519，且外顯子是外顯子M。在某些實(shí)施方案中，序列選自SEQ ID NOS :520-569和635，且外顯子是外顯子55。在某些實(shí)施方案中，序列包含SEQ ID NOS 287或基本上由其組成。某些實(shí)施方案提供了治療遺傳疾病的試劑盒，該試劑盒包含被包裝在適宜容器中的至少一種本發(fā)明的反義寡核苷酸，及其使用說明。結(jié)合附圖
閱讀以下本發(fā)明的詳細(xì)說明將會(huì)更深入地理解這些和其他目的和特征。附圖簡要說明圖IA顯示了具有磷酸二氨酯連接的示例性嗎啉代寡聚體結(jié)構(gòu)。圖IB顯示了本發(fā)明實(shí)施方案的富含精氨酸的肽與反義寡聚體的偶聯(lián)物。圖IC顯示了如圖IB的偶聯(lián)物，其中主鏈連接含有一個(gè)或多個(gè)帶正電荷的基團(tuán)。圖ID-G顯示了示例性嗎啉代寡核苷酸的重復(fù)亞基片段，其稱為D-G。圖2A顯示了經(jīng)設(shè)計(jì)誘導(dǎo)人肌營養(yǎng)不良蛋白外顯子51跳躍的反義寡聚體外顯子51 掃描的相對(duì)位置和結(jié)果。圖2B-C顯示了相對(duì)于可有效誘導(dǎo)外顯子51跳躍的的序列(AVI-5658 ；SEQ ID NO 588和h51 AONl ；SEQ ID NO :594)，選自外顯子51掃描的三個(gè)最佳寡聚體(SEQ ID NOs 324、3沈和327)在培養(yǎng)的人橫紋肌肉瘤(RD)細(xì)胞和人原代骨骼肌細(xì)胞中的相對(duì)活性。圖 2D顯示了與某些序列相比，三個(gè)選定的寡聚體在外顯子51內(nèi)的相對(duì)位置。圖3A顯示了與誘導(dǎo)外顯子50跳躍的其他序列相比，經(jīng)設(shè)計(jì)誘導(dǎo)人肌營養(yǎng)不良蛋白外顯子50跳躍的反義寡聚體外顯子50掃描的相對(duì)位置和結(jié)果。圖:3B顯示了與其他序列(SEQ ID NOS :584和585)相比，選自外顯子50掃描的反義序列(SEQ ID NOS :277、287、290和291)的相對(duì)位置和活性。
圖4A顯示了經(jīng)設(shè)計(jì)誘導(dǎo)人肌營養(yǎng)不良蛋白外顯子53跳躍的反義寡聚體外顯子53 掃描的相對(duì)位置和結(jié)果。圖4B顯示了用于比較選定為在外顯子53掃描中最有活性的那些寡聚體的外顯子跳躍活性的某些序列的相對(duì)位置。圖4C-F顯示了使用選定為在外顯子53掃描中最有效的寡聚體(SEQ ID NOS :422、 428,429和431)的劑量范圍研究結(jié)果，其總結(jié)在圖4G中。圖4H和41顯示了與在RD細(xì)胞和人原代骨骼肌細(xì)胞中最有活性的外顯子53跳躍寡聚體(SEQ ID NO 429)的活性相比，某些序列(SEQ ID NOS =608-611)的相對(duì)活性。圖5A顯示了經(jīng)設(shè)計(jì)誘導(dǎo)人肌營養(yǎng)不良蛋白外顯子44跳躍的反義寡聚體外顯子44 掃描的相對(duì)位置和結(jié)果。圖5B顯示了用于比較選定為在外顯子44掃描中最有活性的那些寡聚體的外顯子跳躍活性的某些序列在外顯子44內(nèi)的相對(duì)位置。圖5C-G顯示了使用選定為在外顯子44掃描中最有效的寡聚體(SEQ ID NOS :4、 8、11、12和13)的劑量范圍研究結(jié)果，其總結(jié)在圖5H中。圖51和5J顯示了與在RD細(xì)胞和人原代骨骼肌細(xì)胞中最有活性的外顯子53跳躍寡聚體(SEQ ID NO: 12)的活性相比，某些序列(SEQ ID NOS =600-603)的相對(duì)活性。圖6A顯示了經(jīng)設(shè)計(jì)誘導(dǎo)人肌營養(yǎng)不良蛋白外顯子45跳躍的反義寡聚體外顯子45 掃描的相對(duì)位置和結(jié)果。圖6B顯示了用于比較選定為在外顯子45掃描中最有活性的那些寡聚體的外顯子跳躍活性的某些序列在外顯子45內(nèi)的相對(duì)位置。圖6C-F顯示了使用選定為在外顯子45掃描中最有效的寡聚體(SEQ ID NOS ,21, 四，34和39)的劑量范圍研究結(jié)果，其總結(jié)在圖6H中。圖6G使用相對(duì)非活性的寡聚體(SEQ ID NO 49)作為陰性對(duì)照。圖61和6J顯示了與在RD細(xì)胞和人原代骨骼肌細(xì)胞中最有活性的外顯子53跳躍寡聚體(SEQ ID NO 34)的活性相比，某些序列(SEQ ID NOS =604-607)的相對(duì)活性。發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施方案通常涉及經(jīng)特別設(shè)計(jì)誘導(dǎo)肌營養(yǎng)不良蛋白基因中的外顯子跳躍的改善的反義化合物，及其使用方法。肌營養(yǎng)不良蛋白蛋白在肌肉功能中發(fā)揮極其重要的作用，并且各種肌肉相關(guān)疾病特征都在于這個(gè)基因的突變形式。因此，在某些實(shí)施方案中，本文所述的改善的反義化合物誘導(dǎo)突變形式的人肌營養(yǎng)不良蛋白基因中的外顯子跳躍。例如在杜興肌營養(yǎng)不良(DMD)和貝克肌營養(yǎng)不良(BMD)中發(fā)現(xiàn)的突變的肌營養(yǎng)不良蛋白基因。由于突變所導(dǎo)致異常mRNA剪接事件，這些突變的人肌營養(yǎng)不良蛋白基因或表達(dá)缺陷型肌營養(yǎng)不良蛋白或表達(dá)幾乎測量不到的肌營養(yǎng)不良蛋白，這是導(dǎo)致多種形式的肌營養(yǎng)不良的疾病狀況。為了治療這種疾病狀況，本發(fā)明的反義化合物通常與突變的人肌營養(yǎng)不良蛋白基因的預(yù)加工RNA的選定區(qū)域雜交，在以別的方式異常剪接的該肌營養(yǎng)不良蛋白 mRNA中誘導(dǎo)外顯子跳躍和差異化剪接，由此使肌細(xì)胞產(chǎn)生編碼功能性肌營養(yǎng)不良蛋白的 mRNA轉(zhuǎn)錄物。在某些實(shí)施方案中，得到的肌營養(yǎng)不良蛋白不一定是“野生型”形式的肌營養(yǎng)不良蛋白，而是截短的，然而是功能性或半功能性形式的肌營養(yǎng)不良蛋白。通過提高肌細(xì)胞中功能性肌營養(yǎng)不良蛋白的水平，這些及相關(guān)實(shí)施方案可用于預(yù)防和治療肌營養(yǎng)不良，特別是，諸如DMD和BMD的這些形式的肌營養(yǎng)不良，它們的特征在于由于異常的mRNA剪接表達(dá)缺陷型肌營養(yǎng)不良蛋白。本文所述的具體寡聚體還提供了超過其他在用的寡聚體的改善的肌營養(yǎng)不良蛋白外顯子特異性靶向，由此提供了優(yōu)于治療肌營養(yǎng)不良相關(guān)形式的可選方法的明顯的實(shí)際優(yōu)勢。除非另有規(guī)定，本文所用的所有技術(shù)和科技術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的具有相同的含義。盡管類似于或等同于本文所述的方法和材料的任何方法和材料都可用于實(shí)踐或檢驗(yàn)本發(fā)明，仍描述了優(yōu)選的方法和材料。出于本發(fā)明的目的，下文定義了以下術(shù)語。定義本文所用的冠詞“a (—個(gè))”和“an (—個(gè))”是指一個(gè)或多于一個(gè)(即至少一個(gè)) 的該冠詞的語法對(duì)象。通過舉例的方式，“一個(gè)元件”表示一個(gè)元件或多于一個(gè)元件?！凹s”表示變動(dòng)范圍高達(dá)參考數(shù)量、水平、值、數(shù)量、頻率、百分比、維數(shù)、大小、量、重量或長度的30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1 %的數(shù)量、水平、值、數(shù)量、頻率、百分比、維數(shù)、大小、量、重量或長度?！熬幋a序列”表示促進(jìn)基因的多肽產(chǎn)物編碼的任何核苷酸序列。相對(duì)而言，術(shù)語“非編碼序列”是指不促進(jìn)基因的多肽產(chǎn)物編碼的任何核苷酸序列。在本說明書全文中，除非上下文另有要求，詞語“包含(comprise)”、“包含 (comprises) ”和“包含(comprising) ”都應(yīng)理解為表示包括所述步驟或元件或步驟或元件組，但是不排除任何其他步驟或元件或步驟或元件組?！坝?.....組成”表示包括并限于短語“由......組成”之內(nèi)的任何事物。因
此，短語”由......組成”表示所列元件是必需的或強(qiáng)制的，且不存在其他元件。“基本
由......組成”表示包括短語內(nèi)所列的任何元件，并限于不會(huì)干擾或促進(jìn)所列元件在公開
中指定的活性或作用的其他元件。因此，短語“基本由......組成”表示所列元件是必需
的或強(qiáng)制的，但其他元件是任選的且可以存在或不存在，這取決于它們本質(zhì)上是否影響所列元件的活性或作用。術(shù)語“互補(bǔ)”和”互補(bǔ)性”是指通過堿基配對(duì)規(guī)律而相關(guān)聯(lián)的多核苷酸(即核苷酸的序列)。例如，序列“A-G-T”與序列“T-C-A”互補(bǔ)?；パa(bǔ)性可以是“部分的”，其中僅一些核酸堿基按照堿基配對(duì)規(guī)律匹配?；?，在核酸之間可以存在“完全”或“全部”的互補(bǔ)性。核酸鏈之間互補(bǔ)性程度對(duì)核酸鏈之間的雜交效能和強(qiáng)度有明顯影響。盡管通常期望完美的互補(bǔ)性，但是一些實(shí)施方案可以包括一個(gè)或多個(gè)但是優(yōu)選6、5、4、3、2或1個(gè)與靶RNA的錯(cuò)配。 包括在寡聚體內(nèi)任何位置的變異。在某些實(shí)施方案中，接近寡聚體末端的序列上的變異通常比內(nèi)部變異更可取，并且如果存在，通常處于5’和/或3’末端約6、5、4、3、2或1個(gè)核苷酸之內(nèi)。術(shù)語“細(xì)胞穿透肽”或“CPP”可交替使用，是指陽離子細(xì)胞穿透肽，也稱為運(yùn)輸肽、 載體肽或肽轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。本文所示的該肽能在30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或 100%的給定的細(xì)胞培養(yǎng)群中誘導(dǎo)細(xì)胞穿透，包括之間的所有整數(shù)，并允許大分子在全身給藥后在體內(nèi)多個(gè)組織內(nèi)遷移。術(shù)語“反義寡聚體”或“反義化合物”可交替使用，是指通過亞基間連接而連接的環(huán)狀亞基序列，每個(gè)亞基都攜帶堿基配對(duì)部分，該亞基連接使堿基配對(duì)部分與核酸(通常是RNA)中的靶序列通過沃森-克里克堿基配對(duì)交雜，在靶序列內(nèi)形成核酸寡聚體異源雙鏈體。環(huán)狀亞基是基于核糖或其他戊糖，或在優(yōu)選實(shí)施方案中，基于嗎啉代基團(tuán)(參見以下的嗎啉代寡聚體的說明)。這種反義寡聚體可以設(shè)計(jì)為阻斷或抑制mRNA的翻譯或抑制天然mRNA前體的剪接加工，可以認(rèn)為是“定向”或“靶向”與其雜交的靶序列。在某些實(shí)施方案中，靶序列包括含有mRNA的AUG起始密碼子、預(yù)加工的mRNA的3’或5’剪接位點(diǎn)或分支點(diǎn)的區(qū)域。靶序列可以位于外顯子或內(nèi)含子內(nèi)。剪接位點(diǎn)的靶序列可包括在其5’端具有位于預(yù)加工的mRNA 的正常剪接位點(diǎn)受體聯(lián)結(jié)處下游的1到約25個(gè)堿基對(duì)的mRNA序列。用于剪接的優(yōu)選靶序列是包括剪接位點(diǎn)或被整體包含在外顯子編碼序列之內(nèi)或橫跨剪接受體或供體位點(diǎn)的預(yù)加工的mRNA的任何區(qū)域。當(dāng)寡聚體以上述方式靶向靶標(biāo)的核酸時(shí)，所述寡聚體更常被稱為 “靶向”生物相關(guān)靶標(biāo)，例如蛋白、病毒或細(xì)菌。所包括的反義寡聚體包含SEQ ID NOS 1-569 和612-635中的一個(gè)或多個(gè)，或基本由SEQ ID NOS :1-569和612-635中的一個(gè)或多個(gè)組成，或由SEQ ID NOS :1-569和612-635中的一個(gè)或多個(gè)組成。還包括這些反義寡聚體的變體，包括與 SEQ ID NOS :1-569 和 612-6；35 中任一個(gè)具有 80%、85%、90%、95%、97%、98% 或99% (包括之間的所有整數(shù))序列同一性或序列同源性的變異的寡聚體，和/或與這些序列差異為約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)核苷酸的變體，優(yōu)選誘導(dǎo)一個(gè)或多個(gè)選定的人肌營養(yǎng)不良蛋白外顯子外顯子跳躍的那些變體。還包括SEQ ID NOS =584-611和634-635的中任一個(gè)或多個(gè)的寡聚體，如本文所述，其包含適宜數(shù)量的帶電連接，例如每2-5個(gè)不帶電連接高達(dá)約1個(gè)，例如每10個(gè)不帶電連接約4-5個(gè)，和/或如本文所述，其包含與其連接的富含Arg的肽。術(shù)語“嗎啉代寡聚體”或“ΡΜ0” (氨基磷酸酯(phosphoramidate)或磷酸二氨酯嗎啉代寡聚體)是指由嗎啉代亞基結(jié)構(gòu)組成的寡核苷酸類似物，其中(i)所述結(jié)構(gòu)通過含磷的連接而連接，所述含磷的連接，其長度為1-3個(gè)原子，優(yōu)選2個(gè)原子，優(yōu)選不帶電或是陽離子，將一個(gè)亞基的嗎啉代氮與相鄰亞基的5’環(huán)外碳連接，和(ii)每個(gè)嗎啉代環(huán)攜帶通過堿基特異性氫鍵合有效地與多核苷酸上的堿基結(jié)合的嘌呤或嘧啶堿基配對(duì)部分。參見例如圖IA的結(jié)構(gòu)，其顯示了優(yōu)選的磷酸二氨酯連接類型。這個(gè)連接可以進(jìn)行變化只要不會(huì)干擾結(jié)合或活性。例如，連接于磷上的氧可被硫取代(硫代磷酸二氨酯 (thiophosphorodiamidate)). 5’氧可被氨基或低級(jí)烷基取代的氨基取代。連接于磷上的懸掛氮(pendant nitrogen)可以是非取代的或被低級(jí)烷基單取代或雙取代(任選取代) 的。參見以下陽離子連接的討論。嗎啉代寡聚體的合成、結(jié)構(gòu)和結(jié)合特征詳述于美國專利第 5，698，685 號(hào)、第 5，217，866 號(hào)、第 5，142，047 號(hào)、第 5，034，506 號(hào)、第 5，166，315 號(hào)、第 5，521，063號(hào)和第5，506，337號(hào)以及PCT申請(qǐng)第PCT/US07/11435 (陽離子連接體)號(hào)中，所有上述專利文獻(xiàn)通過引用并入本文。嘌呤或嘧啶堿基配對(duì)部分通常是腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶或次黃嘌呤。也包括以下堿基諸如4-吡啶酮、2-吡啶酮、苯基、假尿嘧啶、2，4，6_三甲氧基苯(trimell5 thoxy benzene)、3_甲基尿嘧啶、二氫尿苷、萘基、氨苯基、5-烷基胞苷(如 5-甲基胞苷)、5_烷基尿苷(如核糖胸腺嘧啶核苷)、5_鹵代尿苷尿苷(如5-溴代尿苷) 或6-氮雜嘧啶或6-烷基嘧啶(如6-甲基尿苷)、丙炔、Q核苷(queS0Sine)、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、懷丁苷、懷丁氧苷(wybutoxosine),4-乙酰胞苷(acetyltidine)、5_ (羧基羥基甲基)尿苷、5'-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿苷、 β -D-半乳糖苷Q核苷(queosine)、1_甲基腺苷、1_甲基肌苷，2，2_ 二甲基鳥苷、3_甲基胞苷、2-甲基腺苷、2-甲基鳥苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鳥苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲基羰基乙基尿苷(5-methylcarbonyhnethyluridine)、5_甲基氧代尿苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-甲基硫代-N6-異戊烯基腺苷、β -D-甘露糖基Q核苷 (queosine)、尿苷-5-氧代乙酸、2-硫代胞嘧啶、蘇氨酸衍生物以及其它(Burgin et al., 1996, Biochemistry, 35,14090 ；Uhlman & Peyman，同上)。在這方面，“修飾堿基”表示除了腺嘌呤㈧、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶⑴和尿嘧啶⑶之外的核苷酸堿基，如上所述的；這些堿基可用在反義分子的任何位置。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，根據(jù)所用的寡聚體，Ts和Us是可以互換的。例如，更像RNA的其他反義化學(xué)制劑，例如2’ -0-甲基反義寡核苷酸，T堿基可表示為U (參見例如序ID列表Sequence IDlisting，標(biāo)識(shí)符列表))?！鞍被醽喕被颉鞍被釟埢笔侵甫?-氨基酸殘基(如-C0-CHR-NH-)或β -或其他氨基酸殘基(如-CO-(CH2)nCHR-NH-),其中R是側(cè)鏈(其可包括氫)且η是1_6，優(yōu)選 1-4。術(shù)語“天然存在的氨基酸”是指天然發(fā)現(xiàn)的蛋白中存在的氨基酸，例如在蛋白生物合成期間所用的20種(L)-氨基酸以及諸如4-羥脯氨酸、羥賴氨酸、鎖鏈賴氨酸、異鎖鏈賴氨酸、高半胱氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸的前體氨基酸。術(shù)語“非天然氨基酸”是指天然發(fā)現(xiàn)的蛋白中不存在的氨基酸，實(shí)例包括β-丙氨酸(β-Ala ；或B)、6_氨基己酸(Ahx)和6-氨基戊酸。” “非天然氨基酸”的其他實(shí)例包括但不限于(D)-氨基酸、正亮氨酸、正纈氨酸、ρ-氟苯丙氨酸、乙硫氨酸等等，這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的?！坝行Я俊被颉坝行е委熈俊笔侵缸鳛閱未蝿┝炕蛳盗袆┝康囊徊糠纸o予哺乳動(dòng)物個(gè)體的諸如反義寡聚體的治療化合物的量，該量可有效地在所述個(gè)體中產(chǎn)生期望的生理反應(yīng)或治療效果。期望的生理反應(yīng)的一個(gè)實(shí)例包括與反義寡聚體或?qū)φ展丫垠w相比，相對(duì)功能性或生物活性形式的肌營養(yǎng)不良蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，其主要是在含有缺陷型肌營養(yǎng)不良蛋白或沒有肌營養(yǎng)不良蛋白的肌肉組織或細(xì)胞中。期望的治療效果的實(shí)例包括但不限于肌營養(yǎng)不良癥狀或病狀的改善、減輕肌營養(yǎng)不良癥狀或病狀的發(fā)展和減緩肌營養(yǎng)不良癥狀或病狀的發(fā)作，以及其他。這種癥狀的實(shí)例包括疲勞、智力低下、肌無力、運(yùn)動(dòng)技能困難(如奔跑、彈跳、跳躍)、頻繁摔倒和步行困難。肌營養(yǎng)不良病理特征在于，例如肌纖維損傷和膜滲漏。對(duì)于反義寡聚體，這種效果通常通過改變選定靶序列(如肌營養(yǎng)不良蛋白)的剪接加工例如誘導(dǎo)外顯子跳躍所帶來的。“外顯子”是指編碼蛋白的核酸的限定部分，或在通過剪接去除預(yù)加工的RNA(前體)任一部分之后以成熟形式的RNA分子為代表的核酸序列。成熟RNA分子可以是信使 RNA (mRNA)或功能性形式的非編碼RNA，例如rRNA或tRNA。人肌營養(yǎng)不良蛋白基因具有約 75個(gè)外顯子。“內(nèi)含子”是指不被翻譯成蛋白的核酸區(qū)域(基因內(nèi))。內(nèi)含子是轉(zhuǎn)錄成前體 mRNA (mRNA前體)之后在形成成熟RNA期間通過剪接而去除的非編碼部分?！巴怙@子跳躍”通常是這樣一個(gè)過程通過該過程，整個(gè)外顯子或其部分從給定的預(yù)加工的RNA中去除，由此被排除在成熟RNA例如被翻譯成蛋白的成熟mRNA之外。因此， 由跳躍的外顯子編碼的蛋白部分不存在于蛋白的表達(dá)形式中，通常形成改變的但仍是功能性形式的蛋白。在某些實(shí)施方案中，被跳躍的外顯子是來自人肌營養(yǎng)不良蛋白基因的異常外顯子，在其序列上可含有以其他方式導(dǎo)致異常剪接的突變或其他改變。在某些實(shí)施方案中，被跳躍的外顯子是肌營養(yǎng)不良蛋白基因外顯子1-75中的任一個(gè)或多個(gè)，盡管優(yōu)選人肌營養(yǎng)不良蛋白基因外顯子44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、討和/或55中的任一個(gè)或多個(gè)。“肌營養(yǎng)不良蛋白”是桿狀細(xì)胞質(zhì)蛋白，并且是通過細(xì)胞膜將肌纖維的細(xì)胞主鏈與周圍胞外基質(zhì)連接的蛋白復(fù)合物的重要部分。肌營養(yǎng)不良蛋白含有多個(gè)功能性結(jié)構(gòu)域。例如，肌營養(yǎng)不良蛋白含有在約氨基酸14-240處的肌動(dòng)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域和在氨基酸 253-3040處的中心桿狀結(jié)構(gòu)域。這個(gè)大的中心結(jié)構(gòu)域是由約109個(gè)氨基酸的M個(gè)膜收縮蛋白樣三螺旋元件形成的，它們與α肌動(dòng)蛋白和膜收縮蛋白具有同源性。這些重復(fù)通常被四個(gè)富含脯氨酸的非重復(fù)片段間斷，該非重復(fù)片段也稱為鉸鏈區(qū)。重復(fù)15和16被18個(gè)氨基酸一段序列隔離，該序列看起來為肌營養(yǎng)不良蛋白的蛋白水解切割提供主要位點(diǎn)。大部分重復(fù)之間的序列同一性范圍為10-25%。一個(gè)重復(fù)含有三個(gè)α螺旋1、2和3。α螺旋 1和3每個(gè)都由7個(gè)螺旋轉(zhuǎn)角形成，該螺旋轉(zhuǎn)角可能通過疏水界面作為卷曲螺旋相互作用。 α螺旋2具有更為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，并且由被甘氨酸或脯氨酸殘基隔離的四個(gè)和三個(gè)螺旋轉(zhuǎn)角的片段形成。兩個(gè)外顯子編碼一個(gè)重復(fù)，所述外顯子通常被在α螺旋2的第一部分中的氨基酸47和48之間的內(nèi)含子所間斷。在重復(fù)的其他位置發(fā)現(xiàn)其他內(nèi)含子，通常分散在螺旋3 中。肌營養(yǎng)不良蛋白也含有在約氨基酸3080-3360處的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，其包括顯示出與粘液菌(盤基網(wǎng)柄菌(Dictyostelium discoideum)) α肌動(dòng)蛋白的C末端結(jié)構(gòu)域具有同源性的富含半胱氨酸的片段(即在280個(gè)氨基酸的15個(gè)半胱氨酸)。羧基末端結(jié)構(gòu)域位于約氨基酸3361-3685處。肌營養(yǎng)不良蛋白的氨基末端與F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合而羧基末端與肌膜上的肌營養(yǎng)不良蛋白相關(guān)蛋白復(fù)合物(dystrophin-associated protein complex,DAPC)結(jié)合。DAPC 包括肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖、肌膜聚糖、整聯(lián)蛋白和小窩蛋白，并且這些成分中任何成分內(nèi)的突變導(dǎo)致常染色體遺傳的肌營養(yǎng)不良。若缺乏肌營養(yǎng)不良蛋白則DAPC是不穩(wěn)定的，這會(huì)引起膜蛋白水平降低，然后導(dǎo)致漸進(jìn)性纖維損傷和膜滲漏。在多種形式的肌營養(yǎng)不良中，例如在杜興肌營養(yǎng)不良(DMD)和貝克肌營養(yǎng)不良(BMD)中，肌肉細(xì)胞產(chǎn)生改變的和功能性缺陷型形式的肌營養(yǎng)不良蛋白，或根本不產(chǎn)生肌營養(yǎng)不良蛋白，主要是由于導(dǎo)致非正確剪接的基因序列突變?cè)斐傻摹Ｈ毕菪图I養(yǎng)不良蛋白的優(yōu)勢表達(dá)，或肌營養(yǎng)不良蛋白或肌營養(yǎng)不良樣蛋白的完全缺乏，導(dǎo)致肌肉變性的快速發(fā)展，如上所述。在這方面，“缺陷型”肌營養(yǎng)不良蛋白特征在于，在本領(lǐng)域已知的某些DMD或BMD個(gè)體中產(chǎn)生的肌營養(yǎng)不良形式或特征在于缺乏可檢測的肌營養(yǎng)不良蛋白。表A提供多種肌營養(yǎng)不良蛋白結(jié)構(gòu)域、包含這些結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基以及編碼它們的外顯子的說明。表 A
權(quán)利要求
1.用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預(yù)加工的mRNA的加工中產(chǎn)生外顯子44跳躍的組合物，包含含有20-35個(gè)通過含磷亞基間連接而連接的嗎啉代亞基的基本不帶電的反義化合物， 所述連接將一個(gè)亞基的嗎啉代氮與相鄰亞基的5’環(huán)外碳連接，所述反義化合物包含選自 SEQ ID NOS 1-20且能夠與肌營養(yǎng)不良蛋白基因外顯子44中的互補(bǔ)mRNA序列在所述化合物和mRNA之間形成Tm為至少45 °C的異源雙鏈體的序列。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述化合物含有選自SEQID NOS :8、11和12的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述化合物與具有選自SEQID NOS :570-578的序列的富含精氨酸的肽偶聯(lián)。
4.用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預(yù)加工的mRNA的加工中產(chǎn)生外顯子45跳躍的組合物，包含含有20-35個(gè)通過含磷亞基間連接而連接的嗎啉代亞基的基本不帶電的反義化合物， 所述連接將一個(gè)亞基的嗎啉代氮與相鄰亞基的5’環(huán)外碳連接，所述反義化合物包含選自 SEQ ID NOS :21-76和612-6 且能夠與肌營養(yǎng)不良蛋白基因外顯子45中的互補(bǔ)mRNA序列在所述化合物和mRNA之間形成Tm為至少45°C的異源雙鏈體結(jié)構(gòu)的序列。
5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述化合物含有選自SEQID N0S:27、29、34和39 的序列。
6.如權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述化合物含有選自SEQID NOS 29和34的序列。
7.如權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述化合物與具有選自SEQID NOS :570-578的序列的富含精氨酸的肽偶聯(lián)。
8.用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預(yù)加工的mRNA的加工中產(chǎn)生外顯子46跳躍的組合物，包含含有20-35個(gè)通過含磷亞基間連接而連接的嗎啉代亞基的基本不帶電的反義化合物， 所述連接將一個(gè)亞基的嗎啉代氮與相鄰亞基的5’環(huán)外碳連接，所述反義化合物包含選自 SEQ ID NOS :77-125且能夠與肌營養(yǎng)不良蛋白基因外顯子46中的互補(bǔ)mRNA序列在所述化合物和mRNA之間形成Tm為至少45°C的異源雙鏈體結(jié)構(gòu)的序列。
9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述化合物含有選自SEQID NOS :77-105的序列。
10.如權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述化合物含有選自SEQID NOS :82、84_87、90、 96、98、99和101的序列。
11.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述化合物與具有選自SEQID NOS :570-578的序列的富含精氨酸的肽偶聯(lián)。
12.用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預(yù)加工的mRNA的加工中產(chǎn)生外顯子47跳躍的組合物，包含含有20-35個(gè)通過含磷亞基間連接而連接的嗎啉代亞基的基本不帶電的反義化合物， 所述連接將一個(gè)亞基的嗎啉代氮與相鄰亞基的5’環(huán)外碳連接，所述反義化合物包含選自 SEQ ID NOS =126-169且能夠與肌營養(yǎng)不良蛋白基因外顯子47中的互補(bǔ)mRNA序列在所述化合物和mRNA之間形成Tm為至少45 °C的異源雙鏈體結(jié)構(gòu)的序列。
13.如權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述化合物含有選自SEQID NOS :126-149的序列。
14.如權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述化合物含有選自SEQID NOS 126、 128-130、132、144 和 146-149 的序列。
15.如權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述化合物與具有選自SEQID NOS :570-578的序列的富含精氨酸的肽偶聯(lián)。
16.用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預(yù)加工的mRNA的加工中產(chǎn)生外顯子48跳躍的組合物，包含含有20-35個(gè)通過含磷亞基間連接而連接的嗎啉代亞基的基本不帶電的反義化合物， 所述連接將一個(gè)亞基的嗎啉代氮與相鄰亞基的5’環(huán)外碳連接，所述反義化合物包含選自 SEQ ID NOS =170-224和634且能夠與肌營養(yǎng)不良蛋白基因外顯子48中的互補(bǔ)mRNA序列在所述化合物和mRNA之間形成Tm為至少45°C的異源雙鏈體結(jié)構(gòu)的序列。
17.如權(quán)利要求16所述的組合物，其中化合物含有選自SEQID NOS :170-201和634的序列。
18.如權(quán)利要求17的組合物，其中所述化合物含有選自SEQID NOS :176,178, 181-183、194 和 198-201 的序列。
19.如權(quán)利要求16所述的組合物，其中所述化合物與具有選自SEQID NOS :570-578的序列的富含精氨酸的肽偶聯(lián)。
20.用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預(yù)加工的mRNA的加工中產(chǎn)生外顯子49跳躍的組合物，包含含有20-35個(gè)通過含磷亞基間連接而連接的嗎啉代亞基的基本不帶電的反義化合物， 所述連接將一個(gè)亞基的嗎啉代氮與相鄰亞基的5’環(huán)外碳連接，所述反義化合物包含選自 SEQ ID NOS =225-266且能夠與肌營養(yǎng)不良蛋白基因外顯子49中的互補(bǔ)mRNA序列在所述化合物和mRNA之間形成Tm為至少45 °C的異源雙鏈體結(jié)構(gòu)的序列。
21.如權(quán)利要求20所述的組合物，其中所述化合物含有選自SEQID NOS :225-248的序列。
22.如權(quán)利要求21所述的組合物，其中所述化合物含有選自SEQID NOS :227、229、 234、236、237 和 244-248 的序列。
23.如權(quán)利要求20所述的組合物，其中所述化合物與具有選自SEQID NOS :570-578的序列的富含精氨酸的肽偶聯(lián)。
24.用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預(yù)加工的mRNA的加工中產(chǎn)生外顯子50跳躍的組合物，包含含有20-35個(gè)通過含磷亞基間連接而連接的嗎啉代亞基的基本不帶電的反義化合物， 所述連接將一個(gè)亞基的嗎啉代氮與相鄰亞基的5’環(huán)外碳連接，所述反義化合物包含選自 SEQ ID NOS =267-308且能夠與肌營養(yǎng)不良蛋白基因外顯子50中的互補(bǔ)mRNA序列在所述化合物和mRNA之間形成Tm為至少45 °C的異源雙鏈體結(jié)構(gòu)的序列。
25.如權(quán)利要求M所述的組合物，其中所述化合物含有選自SEQID NOS :277,287,290 和291的序列。
26.如權(quán)利要求25所述的組合物，其中所述化合物含有由SEQID NOS :287組成的序列。
27.如權(quán)利要求對(duì)所述的組合物，其中所述化合物與具有選自SEQID NOS :570-578的序列的富含精氨酸的肽偶聯(lián)。
28.用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預(yù)加工的mRNA的加工中產(chǎn)生外顯子51跳躍的組合物，包含含有20-35個(gè)通過含磷亞基間連接而連接的嗎啉代亞基的基本不帶電的反義化合物， 所述連接將一個(gè)亞基的嗎啉代氮與相鄰亞基的5’環(huán)外碳連接，所述反義化合物包含選自 SEQ ID NOS =309-371且能夠與肌營養(yǎng)不良蛋白基因外顯子51中的互補(bǔ)mRNA序列在所述化合物和mRNA之間形成Tm為至少45 °C的異源雙鏈體結(jié)構(gòu)的序列。
29.如權(quán)利要求觀所述的組合物，其中所述化合物含有選自SEQID N0S:324、3^和 327的序列。
30.如權(quán)利要求四所述的組合物，其中所述化合物含有由SEQID NOS :327組成的序列。
31.如權(quán)利要求觀所述的組合物，其中所述化合物與具有選自SEQID NOS :570-578的序列的富含精氨酸的肽偶聯(lián)。
32.用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預(yù)加工的mRNA的加工中產(chǎn)生外顯子52跳躍的組合物，包含含有20-35個(gè)通過含磷亞基間連接而連接的嗎啉代亞基的基本不帶電的反義化合物， 所述連接將一個(gè)亞基的嗎啉代氮與相鄰亞基的5’環(huán)外碳連接，所述反義化合物包含選自 SEQ ID NOS =372-415且能夠與肌營養(yǎng)不良蛋白基因外顯子52中的互補(bǔ)mRNA序列在所述化合物和mRNA之間形成Tm為至少45 °C的異源雙鏈體結(jié)構(gòu)的序列。
33.如權(quán)利要求32所述的組合物，其中所述化合物含有選自SEQID NOS :372-397的序列。
34.如權(quán)利要求33所述的組合物，其中所述化合物含有選自SEQID NOS :379-382, 384、390 和 392-395 的序列。
35.如權(quán)利要求32所述的組合物，其中所述化合物與具有選自SEQID NOS :570-578的序列的富含精氨酸的肽偶聯(lián)。
36.用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預(yù)加工的mRNA的加工中產(chǎn)生外顯子53跳躍的組合物，包含含有20-35個(gè)通過含磷亞基間連接而連接的嗎啉代亞基的基本不帶電的反義化合物， 所述連接將一個(gè)亞基的嗎啉代氮與相鄰亞基的5’環(huán)外碳連接，所述反義化合物包含選自 SEQ ID NOS :416-475和625-633且能夠與肌營養(yǎng)不良蛋白基因外顯子53中的互補(bǔ)mRNA序列在所述化合物和mRNA之間形成Tm為至少45°C的異源雙鏈體結(jié)構(gòu)的序列。
37.如權(quán)利要求36所述的組合物，其中所述化合物含有選自SEQID NOS :428、4四和 431的序列。
38.如權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述化合物含有由SEQID NOS :4 組成的序列。
39.如權(quán)利要求36所述的組合物，其中所述化合物與具有選自SEQID NOS :570-578的序列的富含精氨酸的肽偶聯(lián)。
40.用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預(yù)加工的mRNA的加工中產(chǎn)生外顯子M跳躍的組合物，包含含有20-35個(gè)通過含磷亞基間連接而連接的嗎啉代亞基的基本不帶電的反義化合物， 所述連接將一個(gè)亞基的嗎啉代氮與相鄰亞基的5’環(huán)外碳連接，所述反義化合物包含選自 SEQ ID NOS =476-519且能夠與肌營養(yǎng)不良蛋白基因外顯子M中的互補(bǔ)mRNA序列在所述化合物和mRNA之間形成Tm為至少45 °C的異源雙鏈體結(jié)構(gòu)的序列。
41.如權(quán)利要求40所述的組合物，其中所述化合物含有選自SEQID NOS :476-499的序列。
42.如權(quán)利要求41所述的組合物，其中所述化合物含有選自SEQID NOS =479-482, 484,489 和 491-493 的序列。
43.如權(quán)利要求40所述的組合物，其中化合物與具有選自SEQID NOS :570-578的序列的富含精氨酸的肽偶聯(lián)。
44.用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預(yù)加工的mRNA的加工中產(chǎn)生外顯子55跳躍的組合物，包含含有20-35個(gè)通過含磷亞基間連接而連接的嗎啉代亞基的基本不帶電的反義化合物， 所述連接將一個(gè)亞基的嗎啉代氮與相鄰亞基的5’環(huán)外碳連接，所述反義化合物包含選自 SEQ ID NOS =520-569和635且能夠與肌營養(yǎng)不良蛋白基因外顯子55中的互補(bǔ)mRNA序列在所述化合物和mRNA之間形成Tm為至少45°C的異源雙鏈體結(jié)構(gòu)的序列。
45.如權(quán)利要求44所述的組合物，其中所述化合物含有選自SEQID NOS :520-546和 635的序列。
46.如權(quán)利要求45所述的組合物，其中所述化合物含有選自SEQID NOS =524-528, 537、539、540、542 和 544 的序列。
47.如權(quán)利要求44所述的組合物，其中所述化合物與具有選自SEQID NOS :570-578的序列的富含精氨酸的肽偶聯(lián)。
48.治療個(gè)體肌營養(yǎng)不良的方法，包括給予個(gè)體有效量的含有20-35個(gè)通過含磷亞基間連接而連接的嗎啉代亞基的基本不帶電的反義化合物，所述連接將一個(gè)亞基的嗎啉代氮與相鄰亞基的5，環(huán)外碳連接，所述反義化合物包含選自SEQ ID NOS 1-569和612-635且能夠與肌營養(yǎng)不良蛋白基因外顯子中的互補(bǔ)mRNA序列在所述化合物和mRNA之間形成Tm 為至少45°C的異源雙鏈體結(jié)構(gòu)的序列，其中所述外顯子選自外顯子44-55。
49.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述肌營養(yǎng)不良是杜興肌營養(yǎng)不良(DMD)。
50.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述肌營養(yǎng)不良是貝克肌營養(yǎng)不良(BMD)。
51.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述序列選自SEQID NOS 1_20，且所述外顯子是外顯子44。
52.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述序列選自SEQID NOS :21-76和612-624，且所述外顯子是外顯子45。
53.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述序列選自SEQID NOS :77_125，且所述外顯子是外顯子46。
54.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述序列選自SEQID NOS 126-169，且所述外顯子是外顯子47。
55.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述序列選自SEQID NOS 170-224和634，且所述外顯子是外顯子48。
56.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述序列選自SEQID NOS :225力66，且所述外顯子是外顯子49。
57.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述序列選自SEQID NOS J67-308，且所述外顯子是外顯子50。
58.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述序列選自SEQID NOS :309-371，且所述外顯子是外顯子51。
59.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述序列選自SEQID NOS :372_415，且所述外顯子是外顯子52。
60.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述序列選自SEQID NOS :416-475和625-633， 且所述外顯子是外顯子53。
61.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述序列選自SEQID NOS :476_519，且所述外顯子是外顯子M。
62.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述序列選自SEQID NOS :520-569和635，且所述外顯子是外顯子55。
63.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述序列包含SEQID NOS 2870
64.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述化合物與富含精氨酸的肽偶聯(lián)。
65.如權(quán)利要求64所述的方法，其中所述富含精氨酸的肽包含選自SEQID NOS 570-578的序列。
全文摘要
提供了能夠結(jié)合人肌營養(yǎng)不良蛋白基因中選定的靶位點(diǎn)以便誘導(dǎo)外顯子跳躍的反義分子，和使用其治療肌營養(yǎng)不良的方法。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102203253SQ200980142321
公開日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2009年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日
發(fā)明者彼得·薩扎尼, 瑞斯扎德·科勒 申請(qǐng)人:Avi生物制藥公司