生產(chǎn)異丁醇的重組微生物及方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)異丁醇的重組大腸桿菌以及其在生產(chǎn)異丁醇中的應(yīng)用，其中所述重組大腸桿菌中吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶和NAD激酶同時(shí)被激活。
【專利說(shuō)明】生產(chǎn)異丁醇的重組微生物及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生產(chǎn)異丁醇的重組微生物，具體是重組大腸桿菌，以及使用所述重組大腸桿菌生產(chǎn)異丁醇的方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]目前全球的運(yùn)輸燃料主要是從石油中提煉的汽油和柴油。然而石油是一種不可再生的資源，現(xiàn)有的全球石油儲(chǔ)備預(yù)計(jì)還可以再維持三十至五十年。隨著全球石油儲(chǔ)備的逐漸減少，石油價(jià)格在最近幾年飛速增長(zhǎng)，直接導(dǎo)致全球能源緊張。另外，石油大量使用造成了溫室氣體的大量排放，使全球氣候變暖，造成非常嚴(yán)重的環(huán)境危機(jī)。
[0003]生物質(zhì)是一種可再生的清潔資源。通過生物制造法，生物質(zhì)可以被轉(zhuǎn)化為可再生的代替能源(Werpy et al., 2004 ；Perlack et al., 2005)。近幾十年來(lái),生物能源的研究開發(fā)主要集中在乙醇，丁醇，沼氣，氫氣，生物柴油(Ingram et al., 1999 ；Lee et al., 2008 ；Vasudevan and Briggs, 2008)等。其中，乙醇被認(rèn)為是目前最有可能代替汽油運(yùn)輸燃料的可再生能源。巴西自上世紀(jì)七十年代起就大力發(fā)展乙醇生物制造技術(shù)，由于其國(guó)內(nèi)豐富的甘蔗產(chǎn)量，目前其國(guó)內(nèi)汽車運(yùn)輸燃料已經(jīng)以乙醇為主(Macedo et al.，2008)。
[0004]異丁醇與乙醇相比，更適合作為汽油的替代品，原因是:能量密度接近于汽油；蒸氣壓低，容易與汽油混合；與乙醇相比，可以和汽油高濃度混合，而不需要特殊的適應(yīng)裝置；可以使用現(xiàn)有石油管道進(jìn)行運(yùn)輸?shù)?Connor and Liao, 2009) 0另外，異丁醇在化工市場(chǎng)上也有很多用途，目前主要用于生產(chǎn)潤(rùn)滑油添加劑、表面涂料、粘合劑等復(fù)合溶劑，同時(shí)還可以用于生產(chǎn)鄰苯二甲酸酯類增塑劑(Connor and Liao, 2009) 0目前異丁醇每年的市場(chǎng)需求有50萬(wàn)噸左右。
[0005]某些天然微生物能夠生產(chǎn)異丁醇，但其產(chǎn)量很低(Chen et al., 2011) ? Dupont公司最早開展了構(gòu)建重組大腸桿菌生產(chǎn)`異丁醇的研究(PCT/US2006/041602)。隨后，美國(guó)加州大學(xué)洛杉磯分校James Liao課題組以及美國(guó)Gevo公司也進(jìn)行了相關(guān)的研究(Atsumi et al.2008 ；Atsumi et al.,2009 ；Baez et al.,2011 ；PCT/US2008/053514 ；PCT/US2008/082159)。通過在大腸桿菌中引入外源的酮酸脫羧酶和醇脫氫酶，能夠?qū)被岽x的中間物2-酮基異戊酸轉(zhuǎn)化為異丁醇(圖1)。Liao課題組通過在大腸桿菌中過表達(dá)乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)的酮酸脫羧酶基因(KivD)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的醇脫氫酶基因(adh)來(lái)生產(chǎn)異丁醇；過表達(dá)芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的乙酰乳酸合成酶基因(alsS)、大腸桿菌自身的乙酰輕酸還原異構(gòu)酶基因(ilvC)和二羥酸脫水酶基因(ilvD)能提高異丁醇的產(chǎn)量；敲除醇脫氫酶基因(adhE)、乳酸脫氫酶基因(IdhA)、富馬酸還原酶基因(frd)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(fnr)、磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(Pta)和丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)能進(jìn)一步提高異丁醇的產(chǎn)量。最終構(gòu)建的重組大腸桿菌使用豐富培養(yǎng)基在24小時(shí)內(nèi)能生產(chǎn)7.7g/L的異丁醇(Smithet al.,2011)。當(dāng)前，本領(lǐng)域還需要能夠以高產(chǎn)量生產(chǎn)異丁醇的重組微生物。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)同時(shí)增強(qiáng)大腸桿菌中的吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶和NAD激酶，能夠提高大腸桿菌生產(chǎn)異丁醇的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率。
[0007]在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)異丁醇的重組大腸桿菌，其包含2-酮酸脫羧酶、醇脫氫酶、乙酰乳酸合成酶、乙酰羥酸還原異構(gòu)酶和二羥酸脫水酶，其特征在于所述大腸桿菌中吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶的活性同時(shí)被增強(qiáng)，并且任選地，選自所述2-酮酸脫羧酶、醇脫氫酶、乙酰乳酸合成酶、乙酰羥酸還原異構(gòu)酶和二羥酸脫水酶中的1、2、3、4或5種酶的活性被增強(qiáng)。
[0008]不希望受任何理論約束，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)是異丁醇合成途徑中的關(guān)鍵輔因子，NADPH的來(lái)源有三種:磷酸戊糖途徑，三羧酸循環(huán)和吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶。好氧條件下大腸桿菌生物合成所需要的35-45%的NADPH來(lái)源于磷酸戊糖途徑，20-25%的NADPH來(lái)源于參與到三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))的異檸檬酸脫氫酶，另外的35%-45%的NADPH來(lái)源于吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶(Sauer et al.，2004)。磷酸戊糖途徑和三羧酸循環(huán)在厭氧條件下通常是沒有活性的(Bastian et al.，2011)，因此能提供NADPH的只有吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶。厭氧條件下細(xì)胞產(chǎn)生的還原力類型大部分是NADH。為了高效生產(chǎn)異丁醇，必須要解決輔因子不平衡(cofactor imbalance)的問題。吡唳核苷酸轉(zhuǎn)氫酶有兩種類型:一種是膜結(jié)合蛋白PntAB，它在將質(zhì)子轉(zhuǎn)入胞內(nèi)的過程中可以將NADP+還原為NADPH，也同時(shí)將NADH氧化為NAD+ ;另一種是可溶性蛋白UdhA，它的功能主要是將過多的NADPH轉(zhuǎn)化為NADH。為了使吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶能持續(xù)地工作，NAD+需要被再次轉(zhuǎn)化為NADP+。NAD激酶是細(xì)胞內(nèi)唯一的生產(chǎn)NADP庫(kù)的酶，在維持胞內(nèi)的還原力平衡中起到重要作用(Shi etal.,2009 ；Kawai et al.,2001)?
[0009]在本文中，酶的活性“增強(qiáng)”是指提高微生物中由相應(yīng)DNA編碼的一或多種酶的胞內(nèi)活性，增強(qiáng)活性可以通過 本領(lǐng)域已知的任何合適方法實(shí)現(xiàn)，例如過表達(dá)，包括但不限于提高所述基因或等位基因的拷貝數(shù)，修飾指導(dǎo)或控制基因表達(dá)的核苷酸序列，使用強(qiáng)啟動(dòng)子或使用編碼具有高活性相應(yīng)酶的基因或等位基因，及任選地組合這些措施。通過增強(qiáng)措施，相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性或濃度一般比起始微生物水平提高至少10%，20，30%，40%, 50%,60 %，70 %，80 %，90 %，100 %，150 %，200 %，300 %，400 % 或 500 %，或者直至 1000 %，2000 %，3000 %，4000 %、10000 % 或者 20000 %。
[0010]過表達(dá)通常是指與起始菌株(親代菌株)或者野生型菌株(如果其是起始菌株)相比核糖核酸、蛋白質(zhì)(多肽)或酶的胞內(nèi)濃度或活性增加。起始菌株(親代菌株)是指對(duì)其進(jìn)行導(dǎo)致過表達(dá)處理的菌株。
[0011]拷貝數(shù)可以通過在微生物的胞質(zhì)中復(fù)制的質(zhì)粒而增加。迄今為止，現(xiàn)有技術(shù)對(duì)于不同的微生物描述了大量質(zhì)粒，所述質(zhì)?？捎糜谠O(shè)定基因拷貝數(shù)的希望的增加量。適于埃希氏菌屬的質(zhì)粒在例如 Molecular Biology, Labfax (Ed.:T.A.Brown, Bios Scientific,Oxford,UK, 1991)中描述。拷貝數(shù)也可通過將所需基因的額外一或多個(gè)拷貝整合入微生物的染色體中而增加。
[0012]基因表達(dá)可進(jìn)一步通過使用強(qiáng)啟動(dòng)子增加，所述啟動(dòng)子與被表達(dá)的基因功能性連接。優(yōu)選使用比天然啟動(dòng)子更強(qiáng)的啟動(dòng)子，所述天然啟動(dòng)子是存在于野生型或者親代菌株中的啟動(dòng)子。迄今為止，本領(lǐng)域具有許多可利用的方法。長(zhǎng)期以來(lái)已知適于埃希氏菌屬的啟動(dòng)子。其包括傳統(tǒng)啟動(dòng)子Iac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、雜種啟動(dòng)子tac和trc、噬菌體λ的匕和Pk啟動(dòng)子。也可以將多個(gè)啟動(dòng)子放置在希望的基因的上游或者與被表達(dá)的基因功能性連接，以此實(shí)現(xiàn)表達(dá)增加。
[0013]過表達(dá)也可以通過增加激活物蛋白的表達(dá)或者降低或關(guān)閉阻抑物蛋白的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。
[0014]所提及的過表達(dá)措施可以適當(dāng)方式相互組合。因此，可以例如組合使用合適的啟動(dòng)子及增加拷貝數(shù)。關(guān)于DNA的操縱、DNA的消化和連接、轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)化和選擇的指導(dǎo)可見于已知 Sambrook 等編著的手冊(cè)“Molecular Cloning:A Laboratory Manual，，，SecondEdition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。表達(dá)或者過表達(dá)的程度可以通過測(cè)量從基因中轉(zhuǎn)錄的mRNA的量、通過確定多肽的量以及通過確定酶活性而確定。
[0015]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明重組大腸桿菌中編碼所述2-酮酸脫羧酶和乙酰乳酸合成酶的基因?qū)τ谒鲋亟M大腸桿菌是外源的。所述外源2-酮酸脫羧酶基因和乙酰乳酸合成酶基因可以是來(lái)自任何微生物例如乳球菌、芽孢桿菌等的相應(yīng)基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述2-酮酸脫羧酶選自乳酸乳球菌2-酮酸脫羧酶、鼠傷寒沙門氏菌2-酮酸脫羧酶和乙酰丁酸梭菌2-酮酸脫羧酶，優(yōu)選乳酸乳球菌2-酮酸脫羧酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述乙酰乳酸合成酶選自枯草芽孢桿菌乙酰乳酸合成酶、肺炎克雷伯氏菌乙酰乳酸合成酶和乳酸乳球菌乙酰乳酸合成酶，優(yōu)選枯草芽孢桿菌乙酰乳酸合成酶。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組大腸桿菌中所述2-酮酸脫羧酶和乙酰乳酸合成酶之一或二者的活性被增強(qiáng)。
[0016]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組大腸桿菌中可以存在外源醇脫氫酶編碼基因，例如乳酸乳球菌的醇脫氫酶編碼基因(例如adhA)。
[0017]所述外源2-酮酸脫羧酶基因、醇脫氫酶基因和/或乙酰乳酸合成酶基因可以本領(lǐng)域已知的任何合適方式例如以質(zhì)粒形式、或者整合入基因組中的形式存在于所述大腸桿菌中。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述外源基因整合入所述重組大腸桿菌的基因組中。在一個(gè)實(shí)例中，所述外源2-酮酸脫羧酶基因`(例如kivD)被整合到所述大腸桿菌染色體的丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因PflB位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)例中，所述外源醇脫氫酶基因被整合到所述大腸桿菌染色體的富馬酸還原酶編碼基因frd位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)例中，所述外源乙酰乳酸合成酶基因(例如alsS)被整合到所述大腸桿菌染色體的丙酸激酶編碼基因tdcD位點(diǎn)和乳酸脫氫酶編碼基因IdhA位點(diǎn)。
[0018]本發(fā)明所述“整合”可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法實(shí)現(xiàn)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，將酶編碼基因通過同源重組方法(Court et al.,2002 ；Thomason et al.，2003)整合入大腸桿菌的基因組中。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述整合入基因組中的酶編碼基因置于合適的啟動(dòng)子例如上述強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下。
[0019]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述外源基因可以置于合適的啟動(dòng)子控制之下，例如任何適用于在大腸桿菌中表達(dá)的啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是具有SEQ ID NO:
1、2、3、4、5或75所示序列的啟動(dòng)子。例如，將所述2-酮酸脫羧酶編碼基因置于SEQID NO:1所示的啟動(dòng)子控制之下，將醇脫氫酶編碼基因置于SEQ ID NO:75所示的啟動(dòng)子控制之下和/或?qū)⒁阴Ｈ樗岷铣擅妇幋a基因置于SEQ ID NO:1或5所示的啟動(dòng)子控制之下。
[0020]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組大腸桿菌中乙酰羥酸還原異構(gòu)酶和二羥酸脫水酶的活性也被增強(qiáng)。[0021]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述酶的活性增強(qiáng)是通過過表達(dá)酶編碼基因?qū)崿F(xiàn)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述過表達(dá)可以通過增加基因拷貝數(shù)、使用強(qiáng)啟動(dòng)子等實(shí)現(xiàn)，例如將所述酶的編碼基因序列置于強(qiáng)啟動(dòng)子的控制之下和/或增加所述酶編碼基因的一或多個(gè)拷貝。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述酶編碼基因的一或多個(gè)拷貝和任選存在的啟動(dòng)子核苷酸序列整合入所述重組大腸桿菌的基因組中，或者將包含所述酶編碼基因的質(zhì)粒導(dǎo)入所述重組大腸桿菌中。
[0022]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述強(qiáng)啟動(dòng)子選自SEQ ID NO:1-5任一所示的啟動(dòng)子。例如，在本發(fā)明的重組大腸桿菌中:(a)乙酰羥酸還原異構(gòu)酶基因(例如ilvC)編碼序列置于SEQ ID NO:3所示啟動(dòng)子的控制之下；和/或(b) 二羥酸脫水酶基因(例如ilvD)編碼序列置于SEQ ID NO:1所示啟動(dòng)子的控制下；和/或(c)吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶基因(例如pntAB)編碼序列置于SEQ ID NO:1、3、4或5所示啟動(dòng)子的控制下；和/或(d)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶基因(例如yfjB)編碼序列置于SEQ ID N0:2、3或4所示啟動(dòng)子的控制下。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的所述吡唳核苷酸轉(zhuǎn)氫酶是PntAB蛋白。
[0023]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種重組大腸桿菌，其包含:
[0024](a)活性增強(qiáng)的乙酰羥酸還原異構(gòu)酶(例如其編碼基因如ilvC)；
[0025](b)活性增強(qiáng)的二羥酸脫水酶(例如其編碼基因如ilvD)；
[0026](c)來(lái)自乳酸乳球菌的2-酮酸脫羧酶(例如其編碼基因如kivD)；
[0027](d)來(lái)自枯草芽孢桿菌的乙酰乳酸合成酶(例如其編碼基因如alsS);并且所述重組大腸桿菌的吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶編碼基因pntAB基因置于SEQ ID NO:5所示的啟動(dòng)子控制之下以及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶編碼基因yfjB置于SEQ ID NO:4所示的啟動(dòng)子控制之下。
[0028]在一個(gè)的實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組大腸桿菌中選自如下的一或多種內(nèi)源性酶的活性被降低、例如被失活:乳酸脫氫酶`、丙酮酸甲酸裂解酶、富馬酸還原酶、磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、乙酸激酶、乙醇脫氫酶、丙酸激酶、甲酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶和甲基乙二醛合酶。
[0029]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組大腸桿菌中編碼內(nèi)源性乳酸脫氫酶(例如IdhA)、丙酮酸甲酸裂解酶(例如pflB)、富馬酸還原酶(例如frd)、磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(例如pta)、乙酸激酶(例如ackA)、乙醇脫氫酶(例如adhE)、丙酸激酶(例如tdcD)、甲酸乙?；D(zhuǎn)移酶(例如tdcE)和/或甲基乙二醛合酶(例如mgsA)的基因的一或多個(gè)(例如全部)被弱化，例如被敲除。
[0030]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種重組大腸桿菌，其包含:
[0031](a)大腸桿菌的乙酰羥酸還原異構(gòu)酶編碼基因ilvC，其被整合到所述重組大腸桿菌染色體的甲基乙二醛合酶編碼基因mgsA位點(diǎn)并且置于SEQ ID NO:3所示的啟動(dòng)子的控制下；
[0032](b)大腸桿菌的二羥酸脫水酶編碼基因ilvD，其被整合到所述重組大腸桿菌染色體的丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因PflB位點(diǎn)并且置于SEQ ID NO:1所示的啟動(dòng)子的控制下；
[0033](c)乳酸乳球菌的2-酮酸脫羧酶編碼基因kivD，其被整合到所述重組大腸桿菌染色體的丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因PflB位點(diǎn)并且置于SEQ ID NO:1所示的啟動(dòng)子控制之下；
[0034](d)乳酸乳球菌的醇脫氫酶編碼基因adhA，其被整合到所述重組大腸桿菌染色體的富馬酸還原酶編碼基因frd位點(diǎn)并且置于SEQ ID NO:75所示的啟動(dòng)子控制之下；
[0035](e)枯草芽孢桿菌的乙酰乳酸合成酶編碼基因alsS，其被分別整合到所述重組大腸桿菌染色體的丙酸激酶編碼基因tdcD位點(diǎn)和乳酸脫氫酶編碼基因IdhA位點(diǎn)(即一個(gè)拷貝的乙酰乳酸合成酶編碼基因alsS被整合到tdcD位點(diǎn)，同時(shí)一個(gè)拷貝的乙酰乳酸合成酶編碼基因alsS被整合到IdhA位點(diǎn))并且分別置于SEQ ID NO:1和5所示的啟動(dòng)子控制之下；
[0036]并且所述重組大腸桿菌的吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶編碼基因pntAB基因的原始啟動(dòng)子被替換為SEQ ID NO:1、3、4或5所示的啟動(dòng)子；以及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶編碼基因yfjB基因的原始啟動(dòng)子被替換為SEQ ID NO:2、3或4所示的啟動(dòng)子；以及
[0037]所述重組大腸桿菌的甲基乙二醛合酶編碼基因mgsA、丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因pflB、富馬酸還原酶編碼基因frd、丙酸激酶編碼基因tdcD、甲酸乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因tdcE、乳酸脫氫酶編碼基因ldhA、磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因pta、乙酸激酶編碼基因ackA和乙醇脫氫酶編碼基因adhE被敲除。
[0038]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明所述重組大腸桿菌在生產(chǎn)異丁醇中的應(yīng)用。
[0039]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明所述重組大腸桿菌生產(chǎn)異丁醇的方法，所述方法包括:發(fā)酵培養(yǎng)本發(fā)明的重組大腸桿菌，分離并收獲異丁醇。
[0040]重組大腸桿菌產(chǎn)生異丁醇的條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何培養(yǎng)大腸桿菌以及生產(chǎn)異丁醇所需的發(fā)酵條件。本發(fā)明所述發(fā)酵可以是厭氧發(fā)酵或有氧發(fā)酵。
[0041 ] 所述發(fā)酵可以 在有氧條件下例如在空氣中進(jìn)行。為了保持這些條件，氧氣或含氧混合氣例如空氣可充入培養(yǎng)物。
[0042]所述發(fā)酵可以在厭氧例如無(wú)氧或者微氧條件下進(jìn)行，例如通過通入氮?dú)饣蚱渌线m氣體進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的無(wú)氧或者微氧發(fā)酵使用厭氧小瓶進(jìn)行。
[0043]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述好氧發(fā)酵的空氣通氣量為0.1-3.0L/min.L,例如0.1L/min.L、0.2L/min.L、0.3L/min.L、0.4L/min.L、0.5L/min.L、0.6L/min.L、0.7L/min.L、0.8L/min.L、0.9L/min.L、1.0L/min.L、1.5L/min.L、2.0L/min.L、2.5L/min.L 或 3.0L/min.L。
[0044]所述大腸桿菌的發(fā)酵溫度可以是本領(lǐng)域已知的任何合適溫度。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述大腸桿菌的發(fā)酵在25°C -39°C，例如25°C、30°C、37°C或39°C下進(jìn)行。
[0045]為了調(diào)節(jié)培養(yǎng)基或者培養(yǎng)物的pH值，可以適當(dāng)方式加入堿性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或者酸性化合物如磷酸或硫酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于所述大腸桿菌的發(fā)酵系統(tǒng)的 pH 值為 6.0-8.0，例如 6.0,6.5,7.0,7.5 或 8.0。
[0046]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述大腸桿菌的發(fā)酵時(shí)間為24小時(shí)-144小時(shí),例如24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、120小時(shí)或144小時(shí)。
[0047]本發(fā)明所述重組大腸桿菌還可以使用簡(jiǎn)單無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)異丁醇，從而降低生產(chǎn)成本和下游分離提取成本。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明所述大腸桿菌的培養(yǎng)基可以是本領(lǐng)域已知的任何適合的培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基是由溶于水的以下成分組成的培養(yǎng)基:葡萄糖、KH2PO4' K2HPO4' (NH4)2HPO4' MgSO4.7H20 和 CaCl2.2H20 ；FeCl3.6H20、CoCl2.6H20、CuCl2.2H20, ZnCl2, Na2MoO4.2H20 和 MnCl2.4H20。
[0048]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基成分的含量為:[0049]葡萄糖為50g/L_150g/L，例如 50g/L、100g/L 或 150g/L ；
[0050]KH2PO4 為 0.5g/L-5g/L，例如 0.5g/L、I g/L 或 5g/L ；
[0051]K2HPO4 為 0.5g/L-10g/L，例如 0.5g/L、lg/L、5g/L 或 lOg/L ；
[0052](NH4)2HPO4 為 lg/L-lOg/L，例如 lg/L、3g/L 或 lOg/L ；
[0053]MgSO4.7H20 為 0.lg/L_5g/L，例如 0.1 g/L, I g/L 或 5g/L ；
[0054]CaCl2.2H20 為 0.lg/L_5g/L，例如 0.1 g/L, I g/L 或 5g/L ；
[0055]FeCl3.6H20 為 0.2 μ g/L-5 μ g/L,例如 0.2 μ g/L、1.5 μ g/L 或 5 μ g/L ；
[0056]CoCl2.6Η20 為 0.05 μ g/L-5 μ g/L,例如 0.05 μ g/L,0.1 μ g/L 或 5 μ g/L ;
[0057]CuCl2.2Η20 為 0.05 μ g/L-5 μ g/L,例如 0.05 μ g/L,0.1 μ g/L 或 5 μ g/L ;
[0058]ZnCl2 為 0.05 μ g/L-5 μ g/L,例如 0.05 μ g/L、0.1 μ g/L 或 5 μ g/L ；
[0059]Na2MoO4.2H20 為 0.05 μ g/L-5 μ g/L,例如 0.05 μ g/L,0.1 μ g/L 或 5 μ g/L ;和
[0060]MnCl2.4H20 為 0.05 μ g/L-5 μ g/L,例如 0.05 μ g/L、0.2 μ g/L 或 5 μ g/L。
[0061]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述重組大腸桿菌的發(fā)酵可以首先在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后將種子原液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中。所述種子培養(yǎng)基的成分組成可以與發(fā)酵培養(yǎng)基相同。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述種子原液接種發(fā)酵培養(yǎng)基的接種量的體積百分比為0.01% -10%，例如 0.01%,0.3%或 10%。
[0062]本發(fā)明重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的異丁醇可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行分離和純化。例如參見(Atsumi et al., 2008 ；Inokuma et al., 2010 ；Baez et al.,2011)。
[0063]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種制備用于生產(chǎn)異丁醇的重組大腸桿菌的方法，包括(a)將編碼2-酮酸脫羧酶和乙酰乳酸合成酶的核酸序列導(dǎo)入包含醇脫氫酶、乙酰羥酸還原異構(gòu)酶和二羥酸脫水酶的大腸桿菌中，并且(b)同時(shí)增強(qiáng)該大腸桿菌中吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶PntAB和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶的活性。
[0064]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶PntAB編碼基因的原始啟動(dòng)子和/或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶編碼基因(例如yfjB)的原始啟動(dòng)子被替換為SEQ IDNO:1、2、3、4或5所示的啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶PntAB編碼基因的原始啟動(dòng)子被替換為SEQ ID NO:1、3、4或5所示的啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述煙酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶編碼基因的原始啟動(dòng)子被替換為SEQ IDNO:2、3或4所示的啟動(dòng)子。所述替換可以通過同源重組進(jìn)行。
[0065]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述2-酮酸脫羧酶選自乳酸乳球菌2-酮酸脫羧酶、鼠傷寒沙門氏菌2-酮酸脫羧酶和乙酰丁酸梭菌2-酮酸脫羧酶，優(yōu)選乳酸乳球菌2-酮酸脫羧酶。
[0066]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述乙酰乳酸合成酶選自枯草芽孢桿菌乙酰乳酸合成酶、肺炎克雷伯氏菌乙酰乳酸合成酶和乳酸乳球菌乙酰乳酸合成酶，優(yōu)選枯草芽孢桿菌乙酰乳酸合成酶。
[0067]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括增強(qiáng)乙酰羥酸還原異構(gòu)酶和/或二羥酸脫水酶的活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述酶的活性增強(qiáng)是通過過表達(dá)酶編碼基因?qū)崿F(xiàn)的。
[0068]在一個(gè)實(shí)施方案中，將所述酶的基因編碼序列置于強(qiáng)啟動(dòng)子的控制之下和/或增加所述酶編碼基因的一或多個(gè)拷貝來(lái)進(jìn)行過表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將所述酶編碼基因的一或多個(gè)拷貝和任選存在的啟動(dòng)子核苷酸序列整合入所述重組大腸桿菌的基因組中，或者將包含所述酶編碼基因的質(zhì)粒導(dǎo)入所述重組大腸桿菌中。[0069]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述強(qiáng)啟動(dòng)子選自SEQ ID NO:1_5任一所示的啟動(dòng)子。
[0070]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種制備用于生產(chǎn)異丁醇的重組大腸桿菌的方法，包括:(a)將編碼乳酸乳球菌2-酮酸脫羧酶(例如kivD基因編碼序列)和枯草芽孢桿菌乙酰乳酸合成酶(例如alsS基因編碼序列)的核酸序列導(dǎo)入包含醇脫氫酶、乙酰羥酸還原異構(gòu)酶和二羥酸脫水酶的大腸桿菌中，(b)將額外拷貝的編碼大腸桿菌乙酰羥酸還原異構(gòu)酶(例如ilvC基因編碼序列)和二羥酸脫水酶(例如ilvD基因編碼序列)的核酸序列導(dǎo)入該大腸桿菌中；和(C)將該大腸桿菌中吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶編碼基因pntAB和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶編碼基因的啟動(dòng)子分別置換為SEQ ID NO:5和4所示的啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括將編碼外源醇脫氫酶例如乳酸乳球菌醇脫氫酶(例如adhA)的基因序列導(dǎo)入上述大腸桿菌中。
[0071]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括降低、例如失活所述大腸桿菌中選自如下的一或多種內(nèi)源性酶的活性:(i)乳酸脫氫酶；(ii)丙酮酸甲酸裂解酶；(iii)富馬酸還原酶；(iv)磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶；(V)乙酸激酶；(vi)乙醇脫氫酶；(vii)丙酸激酶；(viii)甲酸乙酰轉(zhuǎn)移酶；和(ix)甲基乙二醛合酶。
[0072]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括敲除所述大腸桿菌中選自如下的一或多種內(nèi)源性酶的編碼基因:(i)乳酸脫氫酶(例如ldhA) ；(ii)丙酮酸甲酸裂解酶(例如pflB)；(iii)富馬酸還原酶(例如frd) ； (iv)磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(例如pta) ； (v)乙酸激酶(例如ackA) ; (vi)乙醇脫氫酶(例如adhE) ； (vii)丙酸激酶(例如tdcD) ； (viii)甲酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(例如tdcE);和(ix)甲基乙二醒合酶(例如mgsA)。
[0073]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種制備用于生產(chǎn)異丁醇的重組大腸桿菌的方法，包括:(a)將大腸桿菌的乙酰羥酸還原異構(gòu)酶編碼基因ilvC整合到所述重組大腸桿菌染色體的甲基乙二醛合酶編碼基因mgsA位點(diǎn)并且置于SEQ ID NO:3所示的啟動(dòng)子的控制下；(b)將大腸桿菌的二羥酸脫水酶編碼基因ilvD整合到所述重組大腸桿菌染色體的丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因PflB位點(diǎn)并且置于SEQ ID NO:1所示的啟動(dòng)子的控制下；(c)將乳酸乳球菌的2-酮酸脫羧酶編碼基因kivD整合到所述重組大腸桿菌染色體的丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因PflB位點(diǎn)并且置于SEQ IDNO:1所示的啟動(dòng)子控制之下；(d)將乳酸乳球菌的醇脫氫酶編碼基因adhA整合到所述重組大腸桿菌染色體的富馬酸還原酶編碼基因frd位點(diǎn)并且置于SEQ ID NO:75所示的啟動(dòng)子控制之下；(e)將枯草芽孢桿菌的乙酰乳酸合成酶編碼基因alsS分別整合到所述重組大腸桿菌染色體的丙酸激酶編碼基因tdcD位點(diǎn)和乳酸脫氫酶編碼基因IdhA位點(diǎn)(即一個(gè)拷貝的乙酰乳酸合成酶編碼基因alsS被整合到tdcD位點(diǎn)，同時(shí)一個(gè)拷貝的乙酰乳酸合成酶編碼基因alsS被整合到IdhA位點(diǎn))，并且分別置于SEQ ID NO:1和5所示的啟動(dòng)子控制之下；并且將所述重組大腸桿菌的吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶編碼基因PntAB基因的原始啟動(dòng)子替換為SEQID NO:1、3、4或5所示的啟動(dòng)子以及將煙酰胺腺嘌呤二核 苷酸激酶編碼基因yfjB的原始啟動(dòng)子替換為SEQ ID NO:2、3或4所示的啟動(dòng)子；以及敲除重組大腸桿菌的甲基乙二醛合酶編碼基因mgsA、丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因PflB、富馬酸還原酶編碼基因frd、丙酸激酶編碼基因tdcD、甲酸乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因tdcE、乳酸脫氫酶編碼基因ldhA、磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因pta、乙酸激酶編碼基因ackA和乙醇脫氫酶編碼基因adhE。
[0074]本發(fā)明中所述2-酮酸脫羧酶是指催化a-酮異戊酸轉(zhuǎn)變?yōu)楫惗∪┖?)2的酶。優(yōu)選的 2-酮酸脫羧酶的 EC 編號(hào)是 4.1.1.72 (Enzyme Nomenclature 1992, AcademicPress, San Diego),可得自許多來(lái)源，包括但不限于乳酸乳球菌(GenBank No:AAS49166,AY548760)、鼠傷寒沙門氏菌(GenBank No:NP_461346)和乙酸丁酸梭菌(GenBank No:NP_149189, NCJDO1988)。
[0075]本發(fā)明中所述醇脫氫酶是指催化醛轉(zhuǎn)變?yōu)榇嫉拿?。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，所述醇脫氫酶是指催化異丁醛轉(zhuǎn)變?yōu)楫惗〈嫉拿?。本發(fā)明優(yōu)選的醇脫氫酶的EC編號(hào)是1.1.1.265 (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego),但是也可以是分類為其他的醇脫氫酶(特別地如EC 1.1.1.1或1.1.1.2)。
[0076]本發(fā)明中所述乙酰乳酸合成酶是指能夠催化丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴Ｈ樗岷虲O2的酶。優(yōu)選的乙酸乳酸合成酶的EC編號(hào)為2.2.1.69 (Enzyme Nomenclature 1992, AcademicPress, San Diego)。這些酶可以得自多種來(lái)源，包括但不限于枯草芽孢桿菌(GenBankNo:CAB15618, Z99122)、肺炎克雷伯氏菌(GenBank No:AAA25079, M73842)和乳酸乳球菌(GenBankNo:AAA25161, L16975)。
[0077]本發(fā)明中所述乙酰羥酸還原異構(gòu)酶是指能夠通過使用NADPH作為電子供體催化乙酰乳酸轉(zhuǎn)變?yōu)?，3_ 二羥基異戊酸的酶。優(yōu)選的乙酰羥酸還原異構(gòu)酶的EC編號(hào)是1.1.1.86 (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego),其可以得自大量微生物，包括但不限于大腸桿菌(GenBank No:NP_418222，NC_000913)、釀酒酵母(GenBank No:NP_013459，NC_001144)、Methanococcus maripaludis(GenBank No:CAF30210, BX957220)和枯草芽孢桿菌(GenBank No:CAB 14789，Z99118)。
[0078]本發(fā)明中所述二羥酸脫水酶是指催化2，3_ 二羥基異戊酸轉(zhuǎn)變?yōu)閍-酮異戍酸的酶。優(yōu)選的二輕酸脫水酶的EC編號(hào)為4.2.1.9 (Enzyme Nomenclature 1992,Academic Press, San Diego)。這種酶可以得自大量微生物，包括但不限于大腸桿菌(GenBank No:YP_026248, `NC_000913)、釀酒酵母(GenBank No:NP_012550, NC_001142)、M.maripaludis (GenBank No:CAF29874, BX957219)和枯草芽孢桿菌(GenBank No:CAB14105, Z99115)。
[0079]本發(fā)明中所述吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶是指催化NADH與NAD+之間相互轉(zhuǎn)換、同時(shí)實(shí)現(xiàn)NADP+與NADPH之間相互轉(zhuǎn)換的酶，反應(yīng)的同時(shí)將質(zhì)子從胞外泵入胞內(nèi)。優(yōu)選的吡啶核昔酸轉(zhuǎn)氫!酶的 EC 編號(hào)為 1.6.1.2 (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, SanDiego)。這種酶可以得自大量生物，包括但不限于大腸桿菌(GenBank No:NC_000913.2)、Rhodospirillum rubrum(GenBank No:NC_017584.1)、Entamoeba histolytica(GenBankNo:Nff_001914887.1)和 Caenorhabditis elegans(GenBank No:Chromosome:X ；NC_003284.8)。
[0080]本發(fā)明中所述煙酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶是指可以將NAD+磷酸化為NADP+的酶。優(yōu)選的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶的EC編號(hào)為2.7.1.23 (Enzyme Nomenclature1992, Academic Press, San Diego)。這種酶可以得自大量微生物,包括但不限于大腸桿菌(GenBank No:NC_000913.2)，釀酒酵母(GenBank No =Chromosome:V ；NC_001137.3)、Methanocaldococcus jannaschii (GenBank No:NC_000909.1)和枯草芽抱桿菌(GenBankNo:NC_004350.2)。
[0081]本發(fā)明所述酶編碼“基因”的核苷酸序列可以得自各種公開出版物、專利申請(qǐng)、專利、參考文獻(xiàn)、數(shù)據(jù)庫(kù)等，例如2-酮酸脫羧酶編碼基因kivD(GenBank No:AAS49166,AY548760)、醇脫氫酶編碼基因 adhA (GenBank No:NP_267964.1，NC_002662.1)、乙酰乳酸合成酶編碼基因alsS(GenBank No:CAB15618, Z99122)、乙酰羥酸還原異構(gòu)酶編碼基因 ilvC(GenBank No:NP_418222, NC_000913)、二羥酸脫水酶編碼基因 ilvD(GenBank No:YP_026248, NC_000913)、吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶編碼基因 pntAB(GenBank No:NC_000913.2)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶編碼基因yfjB (GenBank No:ACA76736.1)、乳酸脫氫酶編碼基因 IdhA(GenBank N0.:YP_001725238.1，NC_010468.1)、丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因 pflB (GenBank N0.:ACA78322.1)、富馬酸還原酶編碼基因 frd (frdA GenBank No:ACA79460.1，frdB GenBank No:ACA79461.1，frdC GenBank No:ACA79462.1，frdDGenBank No:ACA79463.1)、磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因 pta (GenBank No:ACA77021.1)、乙酸激酶編碼基因ackA(GenBank No:ACA77022.1)、乙醇脫氫酶編碼基因adhE(GenBank No:ACA78022.1)、丙酸激酶編碼基因tdcD (GenBank No:ACA76259.1)、甲酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶編碼基因 tdcE (GenBank No:ACA76260.1),以及甲基乙二醒合酶編碼基因 mgsA (GenBank No:ACA78263.1)。
[0082]本發(fā)明所述“任選地”或“任選存在的”是指可以存在或不存在。例如，所述“任選地，選自所述2-酮酸脫羧酶、醇脫氫酶、乙酰乳酸合成酶、乙酰羥酸還原異構(gòu)酶和二羥酸脫水酶中的1、2、3、4或5種酶的活性被增強(qiáng)”是指本發(fā)明所述大腸桿菌具有活性增強(qiáng)的吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶，而該重組大腸桿菌中的2-酮酸脫羧酶、醇脫氫酶、乙酰乳酸合成酶、乙酰羥酸還原異構(gòu)酶和二羥酸脫水酶中的1、2、3、4或5種酶的活性也可以被增強(qiáng)，或者也可以不被增強(qiáng)。
[0083]本文所述“外源”的基因是指在大腸桿菌中不是以天然狀態(tài)存在的基因，其通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)引入所述大腸桿菌中。
[0084]文中術(shù)語(yǔ)“弱化”是指降低或消除微生物中由相應(yīng)DNA編碼的一或多種酶(蛋白質(zhì))的胞內(nèi)活性，例如使用弱啟動(dòng)子，或使用編碼具有低活性的基因或等位基因，或失活相應(yīng)基因或酶(蛋白質(zhì))，及任選地組合這些措施。通過弱化措施，相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性或濃度一般降低至野生型蛋白質(zhì)活性或濃`度的0-50 %，0-25 %，0-10 %或0-5 %。
[0085]所述酶的失活可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適方法實(shí)現(xiàn)，例如敲除編碼基因、基因突變、使用抑制劑例如SiRNA等。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述酶的失活是通過同源重組敲除了編碼基因而實(shí)現(xiàn)的。
[0086]本發(fā)明的所述重組微生物可以連續(xù)培養(yǎng)，如在WO 05/021772中所述；或者非連續(xù)地分批進(jìn)行培養(yǎng)(分批培養(yǎng))或者補(bǔ)料分批培養(yǎng)或者重復(fù)補(bǔ)料分批培養(yǎng)，以產(chǎn)生希望的有機(jī)化合物例如異丁醇。關(guān)于用于大腸桿菌的培養(yǎng)基的描述可以見American Society forBacteriology的Manual of Methods for General Bacteriology(Washington D.C., USA,1981)所述。術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)基”、“發(fā)酵培養(yǎng)基”或者“種子培養(yǎng)基”可互換使用。
[0087]本發(fā)明所述的同時(shí)增強(qiáng)吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶和NAD激酶的重組大腸桿菌異丁醇好氧和厭氧發(fā)酵的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率均提高。此外，本發(fā)明可以將異丁醇代謝途徑中的關(guān)鍵基因整合到大腸桿菌基因組中，并使用組成型調(diào)控元件對(duì)這些基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而可以獲得遺傳穩(wěn)定的重組大腸桿菌?！緦＠綀D】

【附圖說(shuō)明】:
[0088]圖1:異丁醇合成途徑
[0089]圖2:吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶催化的生化反應(yīng)示意圖
[0090]圖3:大腸桿菌ATCC 8739到重組大腸桿菌AS108的構(gòu)建示意圖
[0091]圖4:敲除乳酸脫氫酶基因(IdhA)所需質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖
[0092]圖5:大腸桿菌XZ-TllO的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的突變啟動(dòng)子pck*(SEQIDNO:75)，乳酸乳球菌的2-酮酸脫羧酶基因和大腸桿菌的二羥酸脫水酶基因在菌株XZ-T010中的整合示意圖
[0093]圖6:乳酸乳球菌的2-酮酸脫羧酶基因和大腸桿菌的二羥酸脫水酶基因在菌株AS18中的表達(dá)調(diào)控不意圖
[0094]圖7:質(zhì)粒pXZ112和pXZ116的示意圖；
[0095]圖8:大腸桿菌ATCC 8739以及激活了 PntAB和YfjB的工程菌生產(chǎn)異丁醇的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率。
【具體實(shí)施方式】
[0096]本發(fā)明通過下述實(shí)施例進(jìn)一步闡明，但任何實(shí)施例或其組合不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的范圍或?qū)嵤┓绞降南拗啤１景l(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定，結(jié)合本說(shuō)明書和本領(lǐng)域一般常識(shí)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以清楚地明白權(quán)利要求書所限定的范圍。在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行任何修改或改變，這種修改和改變也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0097]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0098]實(shí)施例1、重組大腸桿菌AS18的構(gòu)建
[0099]重組大腸桿菌AS18的構(gòu)建，分為以下六個(gè)步驟(圖3):
[0100](1)乳酸脫氫酶基因IdhA的敲除
[0101]乳酸脫氫酶基因IdhA(GenBank No:YP_001725238.1，NC_010468.1)的敲除采用兩步同源重組的方法，共以下六步(圖4):
[0102]第一步，以大腸桿菌ATCC 8739 (來(lái)自ATCC)基因組DNA為模板，使用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down，擴(kuò)增大腸桿菌ATCC8739的乳酸脫氫酶編碼基因IdhA及其上下游各400個(gè)左右喊基。引物序列為:
[0103]XZ-ldhA-up:GATAACGGAGATCGGGAATG(SEQ ID NO:7),
[0104]XZ-ldhA-down:CTTTGGCTGTCAGTTCACCA(SEQ ID NO:8)。
[0105]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 U 1、dNTP (每種 dNTP各 IOmM) I ii 1、DNA 模板 20ng、引物(IOuM)各 2 y 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/iil)0.5iil、蒸餾水 33.5iil，總體積為 50u 10
[0106]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分鐘30秒(30個(gè)循環(huán));72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。
[0107]擴(kuò)增產(chǎn)物包含乳酸脫氫酶基因IdhA及其上下游各400個(gè)左右堿基，并將其克隆到pEASY-Blunt克隆載體(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)上?？寺◇w系為:lul PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、I μ I pEASY-Blunt克隆載體，輕輕混合、室溫反應(yīng)5分鐘后加入50 μ I Transl-Tl感受態(tài)細(xì)胞中(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)，冰浴30分鐘；42°C熱激30秒，立即置于冰上2分鐘。加入250 μ I LB培養(yǎng)基，200rpm, 37°C孵育I小時(shí)。取200 μ I菌液涂在含有卡那霉素(終濃度為15yg/ml)的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)陽(yáng)性單菌落，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明在載體PEASY-Blunt上插入了乳酸脫氫酶基因及其上下游各400個(gè)左右堿基，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將得到的重組質(zhì)粒命名為pXZOOl (圖4)。
[0108]第二步，以pXZOOl質(zhì)粒DNA為模板，使用引物XZ-ldhA-l/XZ-ldhA_2擴(kuò)增出一段DNA片段，引物序列為:
[0109]XZ-1dhA-1:TCTGGAAAAAGGCGAAACCT(SEQ ID NO:9),
[0110]XZ-ldhA-2:TTTGTGCTATAAACGGCGAGT(SEQ ID NO:10)。
[0111]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 μ 1、dNTP (每種 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(10 μ M)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸餾水 33.5 μ 1，總體積為 50 μ I。
[0112]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、60°C退火10秒、72°C延伸2分鐘(30個(gè)循環(huán));72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。
[0113]PCR擴(kuò)增產(chǎn)物包含pEASY-Blunt載體和乳酸脫氫酶編碼基因上下游各400個(gè)左右喊基。
[0114]第三步，將含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因(sacB)的DNA片段連接至第二步的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。以pBM002質(zhì)粒(來(lái)源于合肥百邁生物技術(shù)有限公司)為模板，使用引物cat-sacB-up/down PCR擴(kuò)增cat-sacB片段。引物序列為:
[0115]cat-sacB-up:GGAGAAAATACCGCATCAGG(SEQ ID NO:11)
[0116]cat-sacB-down:GCGTTGGCCGATTCATTA(SEQ ID NO:12)。
[0117]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 μ 1、dNTP (每種 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(10 μ Μ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸餾水 33.5 μ 1，總體積為 50 μ I。
[0118]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分鐘(30個(gè)循環(huán));72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。瓊脂糖凝膠電泳回收，獲得含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因(sacB)的DNA片段(3030bp)。
[0119]連接體系為:10ng的第二步PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，30ng的cat-sacB DNA片段，2 μ I10ΧΤ4 連接緩沖液(NEB 公司)，I μ I Τ4 連接酶(NEB 公司，400，OOOcohesive end units/ml)，補(bǔ)充蒸餾水至20 μ I。室溫連接2小時(shí)，取5μ I加入50μ I Transl-Tl感受態(tài)細(xì)胞中(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)，冰浴30分鐘。42°C熱激30秒，立即置于冰上2分鐘。加入250 μ I LB培養(yǎng)基，200rpm，37°C孵育I小時(shí)。取200 μ I菌液涂在含有氯霉素(終濃度為17yg/ml)的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)陽(yáng)性單菌落，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒(將cat-sacB DNA片段克隆到pXZOOl中的質(zhì)粒)進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果在上述第二步的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上連接了 cat-sacB DNA片段，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將得到的重組質(zhì)粒命名為pXZ002(圖4)。
[0120]第四步，以PXZ002質(zhì)粒DNA為模板，使用弓丨物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down擴(kuò)增出DNA片段I。
[0121]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 μ 1、dNTP (每種 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(10 μ Μ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸餾水 33.5 μ 1，總體積為 50 μ I。
[0122]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分鐘40秒(30個(gè)循環(huán));72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。
[0123]DNA片段I包含乳酸脫氫酶編碼基因IdhA上游400個(gè)左右堿基、cat-sacB DNA片段、乳酸脫氫酶編碼基因IdhA下游400個(gè)左右堿基。
[0124]將DNA片段I用于第一次同源重組。首先將pKD46質(zhì)粒(Datsenko and Wanner,2000)通過氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌ATCC8739 (Morrison, 1977)，然后將DNA片段I電轉(zhuǎn)至帶有PKD46的大腸桿菌ATCC8739。
[0125]電轉(zhuǎn)條件為:首先準(zhǔn)備帶有PKD46質(zhì)粒的大腸桿菌ATCC8739的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(Dower et al.，1988);將50 μ I感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，加入50ngDNA片段I，冰上放置2分鐘，轉(zhuǎn)移至0.2cm的Bio-Rad電擊杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)電穿孔儀，電擊參數(shù)為電壓2.5kv。電擊后迅速將Iml LB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至電擊杯中，吹打5次后轉(zhuǎn)移至試管中，75轉(zhuǎn)，30°C孵育2小時(shí)。取200 μ I菌液涂在含有氯霉素(終濃度為17 μ g/ml)的LB平板上，37°C過夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證(使用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down進(jìn)行驗(yàn)證，正確的菌落擴(kuò)增產(chǎn)物為3859bp的片段)。挑選一個(gè)正確的單菌落，將其命名為XZ-TOOI。
[0126]第五步，將第二步得到的pXZOOl質(zhì)粒的DNA擴(kuò)增片段進(jìn)行磷酸化處理，自連得到的質(zhì)粒用于第二次同源重組。
[0127]具體步驟如下:將第二步的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物首先用PCR純化試劑盒清洗(Gel/PCRExtration KU，購(gòu)自BioMIGA生物技術(shù)有限公司);取30ng純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入2 μ I 10ΧΤ4連接緩沖液(NEB公司)、1 μ I Τ4多核苷酸激酶(NEB公司)，補(bǔ)充蒸餾水至20μ 1，37°C 反應(yīng) 30 分鐘；加入 I μ I Τ4 連接酶(NEB 公司，400，OOOcohesive end units/ml)，室溫反應(yīng)2小時(shí)得到連接產(chǎn)物；取5 μ I連接產(chǎn)物加入50 μ I Transl-Tl感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)中，冰浴30分鐘。42°C熱激30秒，立即置于冰上2分鐘。加入250 μ I LB培養(yǎng)基，200rpm，37°C孵育I小時(shí)。取200 μ I菌液涂在含有卡那霉素(終濃度為15 μ g/ml)的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)陽(yáng)性單菌落，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果上述第二步的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了自連，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，得到質(zhì)粒pXZ003(圖4)。
[0128]第六步，以pXZ003質(zhì)粒DNA為模板，用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down擴(kuò)增出DNA片段II。
[0129]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 μ 1、dNTP (每種 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(10 μ M)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸餾水 33.5 μ 1，總體積為 50 μ I。
[0130]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸15秒(30個(gè)循環(huán));72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。
[0131]DNA片段II用于第二次同源重組。首先將PKD46質(zhì)粒通過氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至XZ-TOOl (Morrison, 1977)，然后將 DNA 片段 II 電轉(zhuǎn)至帶有 pKD46 質(zhì)粒的 XZ-T001。
[0132]電轉(zhuǎn)條件為:首先準(zhǔn)備帶有PKD46質(zhì)粒的XZ-T001的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(Doweretal.,1988);將50 感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，加入50ng DNA片段II，冰上放置2分鐘，轉(zhuǎn)移至0.2cm的Bio-Rad電擊杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)電穿孔儀，電擊參數(shù)為電壓2.5kv。電擊后迅速將Iml LB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至電擊杯中，吹打5次后轉(zhuǎn)移至試管中，75轉(zhuǎn)，30°C孵育4小時(shí)。將菌液轉(zhuǎn)移至含有10%蔗糖的沒有氯化鈉的LB液體培養(yǎng)基(250ml燒瓶中裝50ml培養(yǎng)基)，培養(yǎng)24小時(shí)后在含有6%蔗糖的沒有氯化鈉的LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。經(jīng)過PCR驗(yàn)證(使用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down進(jìn)行驗(yàn)證，正確的菌落擴(kuò)增產(chǎn)物為763bp的片段)，挑選一個(gè)正確的單菌落，將其命名為XZ-T002，得到菌株XZ-T002 (表I)。
[0133](2)丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因PflB的敲除
[0134]在菌株XZ-T002中敲除丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因pflB (GenBank No:ACA78322.1)，操作步驟共以下六步:
[0135]第一步，以大腸桿菌ATCC 8739基因組DNA為模板，使用引物XZ_pf lB_up/XZ-pf IB-down (SEQ ID NO:15/SEQ ID NO:16)，擴(kuò)增大腸桿菌 ATCC8739 的丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因PflB及其上下游各400個(gè)左右堿基。
[0136]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 U 1、dNTP (每種 dNTP各 IOmM) I ii 1、DNA 模板 20ng、引物(IOuM)各 2 y 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/iil)0.5iil、蒸餾水 33.5iil，總體積為 50u 10 [0137]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分鐘30秒(30個(gè)循環(huán));72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。
[0138]將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pEASY-Blunt克隆載體上?？寺◇w系為:1 U I PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、I U IpEASY-Blunt克隆載體，輕輕混合、室溫反應(yīng)5分鐘后加入50 u I Transl-Tl感受態(tài)細(xì)胞中(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)，冰浴30分鐘；42°C熱激30秒，立即置于冰上2分鐘。加入250 u I LB培養(yǎng)基，200rpm, 37°C孵育I小時(shí)。取200 yl菌液涂在含有卡那霉素(終濃度為15i!g/ml)的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)陽(yáng)性單菌落，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明在載體PEASY-Blunt上插入了丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因及其上下游各400個(gè)左右堿基，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將得到的重組質(zhì)粒命名為PXZ015。
[0139]第二步，以pXZ015 質(zhì)粒 DNA 為模板，使用引物 XZ_pflB-l/XZ-pf 1B-2 (SEQ ID NO:17/SEQ ID NO:18)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物包含pEASY-Blunt載體和丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因上下游各400個(gè)左右喊基。
[0140]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 U 1、dNTP (每種 dNTP各 IOmM) I ii 1、DNA 模板 20ng、引物(IOuM)各 2 y 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/iil)0.5iil、蒸餾水 33.5iil，總體積為 50u 10
[0141]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分鐘40秒(30個(gè)循環(huán));72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。
[0142]第三步，將含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因(sacB)DNA片段連接至第二步的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。以pBM002質(zhì)粒(來(lái)源于合肥百邁生物技術(shù)有限公司)為模板，使用引物cat-sacB-up/down PCR擴(kuò)增cat-sacB片段。引物序列為:
[0143]cat-sacB-up:GGAGAAAATACCGCATCAGG(SEQ ID NO:11)
[0144]cat-sacB-down:GCGTTGGCCGATTCATTA(SEQ ID NO:12)。
[0145]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 μ 1、dNTP (每種 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(10 μ Μ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸餾水 33.5 μ 1，總體積為 50 μ I。
[0146]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分鐘(30個(gè)循環(huán));72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。瓊脂糖凝膠電泳回收，獲得含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因(sacB)的DNA片段(3030bp)。
[0147]連接體系為:10ng的第二步PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，30ng的cat-sacB DNA片段，2μ I10ΧΤ4 連接緩沖液(NEB 公司)，I μ I Τ4 連接酶(NEB 公司，400，OOOcohesive end units/ml)，補(bǔ)充蒸餾水至20 μ I。室溫連接2小時(shí)，取5μ I加入50μ I Transl-Tl感受態(tài)細(xì)胞中(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)，冰浴30分鐘。42°C熱激30秒，立即置于冰上2分鐘。加入250 μ I LB培養(yǎng)基，200rpm，37°C孵育I小時(shí)。取200 μ I菌液涂在含有氯霉素(終濃度為17 μ g/ml)的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)陽(yáng)性單菌落，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒(將cat-sacB DNA片段克隆到pXZ015中的質(zhì)粒)進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果在上述第二步的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上連接了 cat-sacB DNA片段，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將得到的重組質(zhì)粒命名為pXZ016。
[0148]第四步，以pXZ016質(zhì)粒DNA為模板，使用引物XZ_pflB-up/XZ-pflB-down擴(kuò)增出DNA片段I。
[0149]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 μ 1、dNTP (每種 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(10 μ M)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸餾水 33.5 μ 1，總體積為 50 μ I。
[0150]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分鐘30秒(30個(gè)循環(huán));72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。
[0151]DNA片段I包含丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因pflB上游400個(gè)左右堿基、cat-sacBDNA片段、丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因pflB下游400個(gè)左右堿基。
[0152]將DNA片段I用于第一次同源重組。首先將PKD46質(zhì)粒通過氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至菌株XZ-T002 (Morrison，1977)，然后將DNA片段I電轉(zhuǎn)至帶有pKD46的菌株XZ-T002。
[0153]電轉(zhuǎn)條件為:首先準(zhǔn)備帶有PKD46質(zhì)粒的大腸桿菌XZ-T002的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(Dower et al.，1988);將50 μ I感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，加入50ngDNA片段I，冰上放置2分鐘，轉(zhuǎn)移至0.2cm的Bio-Rad電擊杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)電穿孔儀，電擊參數(shù)為電壓2.5kv。電擊后迅速將Iml LB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至電擊杯中，吹打5次后轉(zhuǎn)移至試管中，75轉(zhuǎn)，30°C孵育2小時(shí)。取200 μ I菌液涂在含有氯霉素(終濃度為17 μ g/ml)的LB平板上，37 °C過夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證(使用引物XZ-pf ΙΒ-up/XZ-pf IB-down進(jìn)行驗(yàn)證，正確的菌落擴(kuò)增產(chǎn)物為3909b p的片段)。挑選一個(gè)正確的單菌落，將其命名為XZ-T003。
[0154]第五步，將第二步得到的pXZ015質(zhì)粒的DNA擴(kuò)增片段進(jìn)行磷酸化處理，進(jìn)行自連，自連得到的質(zhì)粒用于第二次同源重組。[0155]具體步驟如下:將第二步的PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物首先用PCR純化試劑盒清洗(Gel/PCRExtration KU，購(gòu)自BioMIGA生物技術(shù)有限公司);取30ng純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加A2u I 10XT4連接緩沖液(NEB公司)、I yl T4多核苷酸激酶(NEB公司)，補(bǔ)充蒸餾水至20ii 1，37°C 反應(yīng) 30 分鐘；加入 I ii I T4 連接酶(NEB 公司，400，OOOcohesive end units/ml)，室溫反應(yīng)2小時(shí)得到連接產(chǎn)物；取5 ill連接產(chǎn)物加入50 u I Transl-Tl感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)中，冰浴30分鐘。42°C熱激30秒，立即置于冰上2分鐘。加入250 ill LB培養(yǎng)基，200rpm，37°C孵育I小時(shí)。取200 菌液涂在含有卡那霉素(終濃度為15i!g/ml)的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)陽(yáng)性單菌落，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果上述第二步的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了自連，得到質(zhì)粒PXZ017。
[0156]第六步，以pXZ017質(zhì)粒DNA為模板，用引物XZ-pflB-up/XZ-pflB-down擴(kuò)增出DNA片段II，DNA片段II用于第二次同源重組。 [0157]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 U 1、dNTP (每種 dNTP各 IOmM) I ii 1、DNA 模板 20ng、引物(IOuM)各 2 y 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/iil)0.5iil、蒸餾水 33.5iil，總體積為 50u 10
[0158]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸15秒(30個(gè)循環(huán));72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。
[0159]電轉(zhuǎn)條件為:首先準(zhǔn)備帶有PKD46質(zhì)粒的XZ-T003的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(Doweretal.,1988);將50 感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，加入50ng DNA片段II，冰上放置2分鐘，轉(zhuǎn)移至0.2cm的Bio-Rad電擊杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)電穿孔儀，電擊參數(shù)為電壓2.5kv。電擊后迅速將Iml LB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至電擊杯中，吹打5次后轉(zhuǎn)移至試管中，75轉(zhuǎn)，30°C孵育4小時(shí)。將菌液轉(zhuǎn)移至含有10%蔗糖的沒有氯化鈉的LB液體培養(yǎng)基(250ml燒瓶中裝50ml培養(yǎng)基)，培養(yǎng)24小時(shí)后在含有6%蔗糖的沒有氯化鈉的LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。經(jīng)過PCR驗(yàn)證(使用引物XZ-pf lB-up/XZ-pf IB-down進(jìn)行驗(yàn)證，正確的菌落擴(kuò)增產(chǎn)物為879bp的片段)，挑選一個(gè)正確的單菌落，將其命名為XZ-T004，得到菌株XZ-T004 (表I)。
[0160]敲除pflB基因所構(gòu)建的質(zhì)粒見表3,使用的引物序列見表2。
[0161](3)富馬酸還原酶編碼基因frd的敲除
[0162]在菌株XZ-T004中敲除富馬酸還原酶編碼基因frdABCD (frdA GenBank No:ACA79460.1，frdB GenBank No:ACA79461.1，frdC GenBank No:ACA79462.1，frdDGenBankNo:ACA79463.1)，操作步驟共以下六步:
[0163]第一步，以大腸桿菌ATCC 8739基因組DNA為模板，使用引物XZ-frdB_up/XZ-frdC-down (SEQ ID NO:27/SEQ ID NO:28)，擴(kuò)增大腸桿菌 ATCC8739 的富馬酸還原酶編碼基因frdAB⑶及其上下游各400個(gè)左右堿基。
[0164]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 U 1、dNTP (每種 dNTP各 IOmM) I ii 1、DNA 模板 20ng、引物(IOuM)各 2 y 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/iil)0.5iil、蒸餾水 33.5iil，總體積為 50u 10
[0165]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分鐘30秒(30個(gè)循環(huán));72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。[0166]將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pEASY-Blunt克隆載體上?？寺◇w系為:1 μ I PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、
Iμ IpEASY-Blunt克隆載體，輕輕混合、室溫反應(yīng)5分鐘后加入50 μ I Transl-Tl感受態(tài)細(xì)胞中(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)，冰浴30分鐘；42°C熱激30秒，立即置于冰上2分鐘。加入250 μ I LB培養(yǎng)基，200rpm，37°C孵育I小時(shí)。取200 μ I菌液涂在含有卡那霉素(終濃度為15 μ g/ml)的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)陽(yáng)性單菌落，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明在載體pEASY-Blunt上插入了富馬酸還原酶編碼基因frdAB⑶及其上下游各400個(gè)左右堿基，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將得到的重組質(zhì)粒命名為PXZ005。
[0167]第二步，以pXZ005 質(zhì)粒 DNA 為模板，使用引物 XZ-frdC-l/XZ-frdB-2 (SEQ ID NO:29/SEQ ID NO:30)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物包含pEASY-Blunt載體和富馬酸還原酶編碼基因上下游各400個(gè)左右堿基。
[0168]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 μ 1、dNTP (每種 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(10 μ M)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸餾水 33.5 μ 1，總體積為 50 μ I。
[0169]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、57°C退火10秒、72°C延伸I分鐘40秒(30個(gè)循環(huán));72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。
[0170]第三步，將含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因(sacB)DNA片段連接至第二步的PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物。
[0171]以PBM002質(zhì)粒(來(lái)源于合肥百邁生物技術(shù)有限公司)為模板，使用引物cat-sacB-up/down PCR 擴(kuò)增 cat-sacB 片段。引物序列為:
[0172]cat-sacB-up:GGAGAAAATACCGCATCAGG(SEQ ID NO:11)
[0173]cat-sacB-down:GCGTTGGCCGATTCATTA(SEQ ID NO:12)。
[0174]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 μ 1、dNTP (每種 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(10 μ Μ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸餾水 33.5 μ 1，總體積為 50 μ I。
[0175]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分鐘(30個(gè)循環(huán));72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。瓊脂糖凝膠電泳回收，獲得含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因(sacB)的DNA片段(3030bp)。
[0176]連接體系為:10ng的第二步PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，30ng的cat-sacB DNA片段，2 μ I10ΧΤ4 連接緩沖液(NEB 公司)，I μ I Τ4 連接酶(NEB 公司，400，OOOcohesive end units/ml)，補(bǔ)充蒸餾水至20 μ I。室溫連接2小時(shí)，取5μ I加入50μ I Transl-Tl感受態(tài)細(xì)胞中(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)，冰浴30分鐘。42°C熱激30秒，立即置于冰上2分鐘。加入250 μ I LB培養(yǎng)基，200rpm，37°C孵育I小時(shí)。取200 μ I菌液涂在含有氯霉素(終濃度為17 μ g/ml)的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)陽(yáng)性單菌落，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒(將cat-sacB DNA片段克隆到pXZ005中的質(zhì)粒)進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果在上述第二步的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上連接了 cat-sacB DNA片段，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將得到的重組質(zhì)粒命名為PXZ006。
[0177]第四步，以PXZ006質(zhì)粒DNA為模板，使用弓丨物XZ-frdB-up/XZ-frdC-down擴(kuò)增出DNA片段I。[0178]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 μ 1、dNTP (每種 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(10 μ Μ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸餾水 33.5 μ 1，總體積為 50 μ I。
[0179]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分鐘40秒(30個(gè)循環(huán));72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。
[0180]DNA片段I包含富馬酸還原酶編碼基因frdAB⑶上游400個(gè)左右堿基、cat-sacBDNA片段、富馬酸還原酶編碼基因frdAB⑶下游400個(gè)左右堿基。
[0181]將DNA片段I用于第一次同源重組。首先將PKD46質(zhì)粒通過氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至菌株XZ-T004 (Morrison, 1977)，然后將DNA片段I電轉(zhuǎn)至帶有pKD46的菌株XZ-T004。
[0182]電轉(zhuǎn)條件為:首先準(zhǔn)備帶有PKD46質(zhì)粒的大腸桿菌XZ-T004的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(Dower et al.，1988);將50 μ I感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，加入50ngDNA片段I，冰上放置2分鐘，轉(zhuǎn)移至0.2cm的Bio-Rad電擊杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)電穿孔儀，電擊參數(shù)為電壓2.5kv。電擊后迅速將Iml LB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至電擊杯中，吹打5次后轉(zhuǎn)移至試管中，75轉(zhuǎn)，30°C孵育2小時(shí)。取200 μ I菌液涂在含有氯霉素(終濃度為17 μ g/ml)的LB平板上，37 °C過夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證(使用引物XZ-frdB-up/XZ-frdC-down進(jìn)行驗(yàn)證，正確的菌落擴(kuò)增產(chǎn)物為3901bp的片段)。挑選一個(gè)正確的單菌落，將其命名為XZ-T005。
[0183]第五步，將第二步得到的pXZ005質(zhì)粒的DNA擴(kuò)增片段進(jìn)行磷酸化處理，并進(jìn)行自連。
[0184]具體步驟如下:將第二步的PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物首先用PCR純化試劑盒清洗(Gel/PCRExtration KU，購(gòu)自BioMIGA生物技術(shù)有限公司);取30ng純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加Λ2μ I 10ΧΤ4連接緩沖液(NEB公司)、I μ I Τ4多核苷酸激酶(NEB公司)，補(bǔ)充蒸餾水至20μ 1，37°C 反應(yīng) 30 分鐘；加入 I μ I Τ4 連接酶(NEB 公司，400，OOOcohesive end units/ml)，室溫反應(yīng)2小時(shí)得到連接產(chǎn)物；取5 μ I連接產(chǎn)物加入50 μ I Transl-Tl感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)中，冰浴30分鐘。42°C熱激30秒，立即至于冰上2分鐘。加入250 μ I LB培養(yǎng)基，200rpm，37°C孵育I小時(shí)。取200 μ I菌液涂在含有卡那霉素(終濃度為15 μ g/ml)的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)陽(yáng)性單菌落，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果上述第二步的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了自連，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，得到質(zhì)粒PXZ007。
[0185]第六步，以pXZ007質(zhì)粒DNA為模板，用引物XZ-frdB-up/XZ-frdC-down擴(kuò)增出DNA片段II。
[0186]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 μ l、dNTP (每種 dNTP 各IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(ΙΟμΜ)各2μ l.Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸懼水 33.5 μ I,總體積為 50 μ I。
[0187]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸15秒(30個(gè)循環(huán));72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。
[0188]DNA片段II用于第二次同源重組。首先將pKD46質(zhì)粒通過氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至XZ-T005 (Morrison, 1977)，然后將 DNA 片段 II 電轉(zhuǎn)至帶有 pKD46 質(zhì)粒的 XZ-T005。
[0189]電轉(zhuǎn)條件為:首先準(zhǔn)備帶有pKD46質(zhì)粒的XZ-T005的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(Dower etal.,1988);將50111感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，加入50ng DNA片段II，冰上放置2分鐘，轉(zhuǎn)移至0.2cm的Bio-Rad電擊杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)電穿孔儀，電擊參數(shù)為電壓2.5kv。電擊后迅速將Iml LB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至電擊杯中，吹打5次后轉(zhuǎn)移至試管中，75轉(zhuǎn)，30°C孵育4小時(shí)。將菌液轉(zhuǎn)移至含有10%蔗糖的沒有氯化鈉的LB液體培養(yǎng)基(250ml燒瓶中裝50ml培養(yǎng)基)，培養(yǎng)24小時(shí)后在含有6%蔗糖的沒有氯化鈉的LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。經(jīng)過PCR驗(yàn)證(使用引物XZ-frdB-up/XZ-frdC-down進(jìn)行驗(yàn)證，正確的菌落擴(kuò)增產(chǎn)物為821bp的片段)，挑選一個(gè)正確的單菌落，將其命名為XZ-T006，得到菌株XZ-T006(表I)。
[0190]敲除frd基因所構(gòu)建的質(zhì)粒見表3,使用的引物序列見表2。
[0191](4)磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因pta和乙酸激酶編碼基因ackA的敲除
[0192]在菌株XZ-T006中敲除磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因pta (GenBank No:ACA77021.1)和乙酸激酶編碼基因ackA(GenBank No:ACA77022.1)，操作步驟共以下六步:
[0193]第一步，以大腸桿菌ATCC 8739基因組DNA為模板，使用引物XZ-ackA-up/XZ-pta-down (SEQ ID NO:35/SEQ ID NO:36)，擴(kuò)增大腸桿菌 ATCC8739 的磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因Pta及其下游400個(gè)左右堿基和乙酸激酶編碼基因ackA及其上游400個(gè)左右堿基。
[0194]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 U 1、dNTP (每種 dNTP各 IOmM) I ii 1、DNA 模板 20ng、引物(IOuM)各 2 y 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/iil)0.5iil、蒸餾水 33.5iil，總體積為 50u 10
[0195]擴(kuò)增條件為98°C`預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、56°C退火10秒、72°C延伸I分鐘30秒(30個(gè)循環(huán));72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。
[0196]將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pEASY-Blunt克隆載體上?？寺◇w系為:1 U I PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、
IU IpEASY-Blunt克隆載體，輕輕混合、室溫反應(yīng)5分鐘后加入50 u I Transl-Tl感受態(tài)細(xì)胞中(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)，冰浴30分鐘；42°C熱激30秒，立即置于冰上2分鐘。加入250 ill LB培養(yǎng)基，200rpm，37°C孵育I小時(shí)。取200 菌液涂在含有卡那霉素(終濃度為15i!g/ml)的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)陽(yáng)性單菌落，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明在載體pEASY-Blunt上插入了磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因Pta及其下游400個(gè)左右堿基和乙酸激酶編碼基因ackA及其上游400個(gè)左右堿基，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將得到的重組質(zhì)粒命名為pXZ023。
[0197]第二步，以pXZ023 質(zhì)粒 DNA 為模板，使用引物 XZ-ackA-2/XZ-pta_2 (SEQ ID NO:37/SEQ ID NO:38)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物包含pEASY-Blunt載體和磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因pta下游400個(gè)左右堿基及乙酸激酶編碼基因ackA上游400個(gè)左右堿基。
[0198]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 U 1、dNTP (每種 dNTP各 IOmM) I ii 1、DNA 模板 20ng、引物(IOuM)各 2 y 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/iil)0.5iil、蒸餾水 33.5iil，總體積為 50u 10
[0199]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、57°C退火10秒、72°C延伸I分鐘40秒(30個(gè)循環(huán));72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。
[0200]第三步，將含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因(sacB)DNA片段連接至第二步的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。[0201]以PBM002質(zhì)粒(來(lái)源于合肥百邁生物技術(shù)有限公司)為模板，使用引物cat-sacB-up/down PCR 擴(kuò)增 cat-sacB 片段。引物序列為:
[0202]cat-sacB-up:GGAGAAAATACCGCATCAGG(SEQ ID NO:11)
[0203]cat-sacB-down:GCGTTGGCCGATTCATTA(SEQ ID NO:12)。
[0204]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 μ 1、dNTP (每種 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(ΙΟμΜ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸餾水 33.5 μ 1，總體積為 50 μ I。
[0205]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分鐘(30個(gè)循環(huán));72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。瓊脂糖凝膠電泳回收，獲得含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶基因(sacB)的DNA片段(3030bp)。
[0206]連接體系為:IOng的第二步PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，30ng的cat-sacB DNA片段，2 μ I10ΧΤ4 連接緩沖液(NEB 公司)，I μ I Τ4 連接酶(NEB 公司，400，OOOcohesive end units/ml)，補(bǔ)充蒸餾水至20 μ I。室溫連接2小時(shí)，取5μ I加入50μ I Transl-Tl感受態(tài)細(xì)胞中(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)，冰浴30分鐘。42°C熱激30秒，立即置于冰上2分鐘。加入250 μ I LB培養(yǎng)基，200rpm，37°C孵育I小時(shí)。取200 μ I菌液涂在含有氯霉素(終濃度為17 μ g/ml)的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)陽(yáng)性單菌落，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒(將cat-sacB DNA片段克隆到pXZ023中的質(zhì)粒)進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果在上述第二步的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上連接了 cat-sacB DNA片段，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將得到的重組質(zhì)粒命名為pXZ024。
[0207]第四步，以pXZ024質(zhì)粒DNA為模板，使用引物XZ-ackA-up/XZ-pta-down擴(kuò)增出DNA片段I。
[0208]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 μ 1、dNTP (每種 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(ΙΟμΜ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸餾水 33.5 μ 1，總體積為 50 μ I。
[0209]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、56°C退火10秒、72°C延伸I分鐘30秒(30個(gè)循環(huán));72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。
[0210]DNA片段I包含磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因pta下游400個(gè)左右堿基、cat-sacB DNA片段、乙酸激酶編碼基因ackA上游400個(gè)左右堿基。
[0211]將DNA片段I用于第一次同源重組。首先將PKD46質(zhì)粒通過氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至菌株XZ-T006 (Morrison，1977)，然后將DNA片段I電轉(zhuǎn)至帶有pKD46的菌株XZ-T006。
[0212]電轉(zhuǎn)條件為:首先準(zhǔn)備帶有PKD46質(zhì)粒的菌株XZ-T006的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(Dower et al.，1988);將50 μ I感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，加入50ngDNA片段I，冰上放置2分鐘，轉(zhuǎn)移至0.2cm的Bio-Rad電擊杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)電穿孔儀，電擊參數(shù)為電壓2.5kv。電擊后迅速將Iml LB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至電擊杯中，吹打5次后轉(zhuǎn)移至試管中，75轉(zhuǎn)，30°C孵育2小時(shí)。取200 μ I菌液涂在含有氯霉素(終濃度為17 μ g/ml)的LB平板上，37°C過夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證(使用引物XZ-ackA-up/XZ-pta-down進(jìn)行驗(yàn)證，正確的菌落擴(kuò)增產(chǎn)物為301 Ibp的片段)。挑選一個(gè)正確的單菌落，將其命名為XZ-T009。
[0213]第五步，將第二步得到的pXZ023質(zhì)粒的DNA擴(kuò)增片段進(jìn)行磷酸化處理，進(jìn)行自連。[0214]具體步驟如下:將第二步的PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物首先用PCR純化試劑盒清洗(Gel/PCRExtration KU，購(gòu)自BioMIGA生物技術(shù)有限公司);取30ng純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加A2μ 1 10XT4連接緩沖液(NEB公司)、1 μ 1 T4多核苷酸激酶(NEB公司)，補(bǔ)充蒸餾水至20μ 1，37°C 反應(yīng) 30 分鐘；加入 1 μ 1 T4 連接酶(NEB 公司，400，OOOcohesive end units/ml)，室溫反應(yīng)2小時(shí)得到連接產(chǎn)物；取5 ill連接產(chǎn)物加入50 μ 1Transl-Tl感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)中，冰浴30分鐘。42°C熱激30秒，立即至于冰上2分鐘。加入250 μ 1 LB培養(yǎng)基，200rpm，37°C孵育1小時(shí)。取200 菌液涂在含有卡那霉素(終濃度為15μ g/ml)的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)陽(yáng)性單菌落，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果上述第二步的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了自連，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，得到質(zhì)粒PXZ025。
[0215]第六步，以pXZ025質(zhì)粒DNA為模板，用引物XZ-ackA-up/XZ-pta-down擴(kuò)增出DNA片段II，DNA片段II用于第二次同源重組。
[0216]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 U 1、dNTP (每種 dNTP各 10禮)1111、0嫩模板20叩、引物(10uM)各 2 μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5μ 1、蒸餾水 33.5μ 1，總體積為 50u 1.
[0217]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、56°C退火10秒、72°C延伸15秒(30個(gè)循環(huán));72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。
[0218]首先將pKD46質(zhì)粒通過氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至XZ-T009 (Morrison，1977)，然后將DNA片段II電轉(zhuǎn)至帶有pKD46質(zhì)粒的XZ-T009。
[0219]電轉(zhuǎn)條件為:首先準(zhǔn)備帶有PKD46質(zhì)粒的XZ-T009的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(Doweretal.,1988);將50 感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，加入50ng DNA片段II，冰上放置2分鐘，轉(zhuǎn)移至0.2cm的Bio-Rad電擊杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)電穿孔儀，電擊參數(shù)為電壓2.5kv。電擊后迅速將Iml LB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至電擊杯中，吹打5次后轉(zhuǎn)移至試管中，75轉(zhuǎn)，30°C孵育4小時(shí)。將菌液轉(zhuǎn)移至含有10%蔗糖的沒有氯化鈉的LB液體培養(yǎng)基(250ml燒瓶中裝50ml培養(yǎng)基)，培養(yǎng)24小時(shí)后在含有6%蔗糖的沒有氯化鈉的LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。經(jīng)過PCR驗(yàn)證(使用引物XZ-ackA-up/XZ-pta-down進(jìn)行驗(yàn)證,正確的菌落擴(kuò)增產(chǎn)物為731bp的片段)，挑選一個(gè)正確的單菌落，將其命名為XZ-T010，得到菌株XZ-TOlO (表I)。
[0220]敲除ackA-pta基因所構(gòu)建的質(zhì)粒見表3，使用的引物序列見表2。
[0221](5)整合乳酸乳球菌的2-酮酸脫羧酶基因和大腸桿菌的二羥酸脫水酶基因(圖5)
[0222]整合乳酸乳球菌的2-酮酸脫羧酶基因(GenBank No:AAS49166, AY548760)和大腸桿菌的二羥酸脫水酶基因(GenBank No:YP_026248, NC_000913)并提高其表達(dá)強(qiáng)度，共有以下七步。所用引物見表2。
[0223]第一步，克隆大腸桿菌MG1655的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的啟動(dòng)子pck到載體pTrc99A0
[0224]以大腸桿菌MG1655 (來(lái)自ATCC，編號(hào)700926)基因組為模板，使用引物P-pck*-up-SpeI/P-pck*-down-KpnI(SEQ ID NO:19/SEQ ID NO:20)擴(kuò)增大腸桿菌 MG1655的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的啟動(dòng)子pck，引物序列見表2。[0225]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 μ 1、dNTP (每種 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(ΙΟμΜ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸餾水 33.5 μ 1，總體積為 50 μ I。
[0226]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán));98°C變性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸15秒(30個(gè)循環(huán));72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。
[0227]擴(kuò)增產(chǎn)物為磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的啟動(dòng)子pck，PCR產(chǎn)物進(jìn)行SpeI (購(gòu)自NEB公司)和KpnI (購(gòu)自NEB公司)酶切。將其克隆到經(jīng)過相同酶酶切的pTrc99A(來(lái)源于合肥百邁生物技術(shù)有限公司)表達(dá)載體上。
[0228]連接體系為:10ng的pTrc99A酶切產(chǎn)物，30ng的pck酶切片段，2μ I 10ΧΤ4連接緩沖液(NEB 公司),I μ I T4 連接酶(NEB 公司，400，OOOcohesive end units/ml)，補(bǔ)充蒸餾水至20μ1。室溫連接2小時(shí)，取5μ I加入50μ I Transl-Tl感受態(tài)細(xì)胞中(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)，冰浴30分鐘。42°C熱激30秒，立即置于冰上2分鐘。加入250 μ ILB培養(yǎng)基，200rpm, 37°C孵育I小時(shí)。取200 μ I菌液涂在含有氨芐青霉素(終濃度為lOOyg/ml)的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)陽(yáng)性單菌落，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明在載體pTrc99A上插入了磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的啟動(dòng)子pck，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將得到的表達(dá)質(zhì)粒命名為pXZ602。
[0229]第二步,克隆磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的突變啟動(dòng)子pck*到pTrc99A。 [0230]以質(zhì)粒pXZ602 為模板，設(shè)計(jì)引物 pck*-F/pck*-R(SEQ ID NO:21/SEQ ID NO:22)，引物序列為見表2。
[0231]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 μ 1、dNTP (每種 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(ΙΟμΜ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸餾水 33.5 μ 1，總體積為 50 μ I。
[0232]擴(kuò)增條件98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分鐘(30個(gè)循環(huán));72°C延伸7分鐘(I個(gè)循環(huán))。
[0233]擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過T4多核苷酸激酶(購(gòu)自NEB公司)加磷，自連得到陽(yáng)性質(zhì)粒。
[0234]具體步驟如下:將PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物首先用PCR純化試劑盒清洗(Gel/PCRExtration Kit,購(gòu)自BioMIGA生物技術(shù)有限公司);取30ng純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入2 μ I 10ΧΤ4連接緩沖液(NEB公司)、1 μ I Τ4多核苷酸激酶(NEB公司)，補(bǔ)充蒸餾水至20μ 1，37°C 反應(yīng) 30 分鐘；加入 I μ I Τ4 連接酶(NEB 公司，400，OOOcohesive end units/ml)，室溫反應(yīng)2小時(shí)得到連接產(chǎn)物；取5 μ I連接產(chǎn)物加入50 μ I Transl-Tl感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)中，冰浴30分鐘。42°C熱激30秒，立即置于冰上2分鐘。加入25(^11^培養(yǎng)基，200印111，371:孵育1小時(shí)。取200 μ I菌液涂在含有氨芐青霉素(終濃度為lOOyg/ml)的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)陽(yáng)性單菌落，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明在載體pTrc99A上插入了磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的突變啟動(dòng)子pck*(SEQ ID NO:75)，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將得到的表達(dá)質(zhì)粒命名為PXZ603。
[0235]第三步，進(jìn)行乳酸乳球菌2-酮酸脫羧酶基因、大腸桿菌二羥酸脫水酶基因，及pck*啟動(dòng)子的連接反應(yīng)。
[0236]以乳酸乳球菌(Lactococuslactis IL1403，來(lái)自 ATCC，編號(hào) 7962)基因組 DNA 為模板，用引物 kivD-F-KpnI/kivD-R-XbaI(SEQ ID NO:23/SEQ ID NO:24)，擴(kuò)增乳酸乳球菌的2-酮酸脫羧酶編碼基因kivD。
[0237]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 ii 1、dNTP (每種 dNTP各 IOmM) I ii 1、DNA 模板 20ng、引物(IOuM)各 2 y 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/iil)0.5iil、蒸餾水 33.5iil，總體積為 50u 10
[0238]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸30秒(30個(gè)循環(huán));72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。擴(kuò)增產(chǎn)物為2-酮酸脫羧酶編碼基因kivD，PCR產(chǎn)物進(jìn)行KpnI (購(gòu)自NEB公司)和XbaI (購(gòu)自NEB公司)酶切。
[0239]以大腸桿菌MG1655 (來(lái)自ATCC，編號(hào)700926)基因組DNA為模板，使用引物ilvD-F-Xbal/iIvD-R-SalI (SEQ ID NO:25/SEQ ID NO:26)，擴(kuò)增大腸桿菌MG1655 的二羥酸脫水酶基因ilvD。
[0240]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 U 1、dNTP (每種 dNTP各 IOmM) I ii 1、DNA 模板 20ng、引物(IOuM)各 2 y 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/iil)0.5iil、蒸餾水 33.5iil，總體積為 50u 10
[0241]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、58°C退火10秒、72°C延伸30秒(30個(gè)循環(huán))；72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。擴(kuò)增產(chǎn)物為二羥酸脫水酶基因ilvD，PCR產(chǎn)物進(jìn)行XbaI (購(gòu)自NEB公司)酶切。
[0242]以質(zhì)粒pXZ603為模板,使用引物P-pck*-up_SpeI和P-pck*-down_KpnI擴(kuò)增磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的突變啟動(dòng)子pck'擴(kuò)增體系為:NewEngland Biolabs Phusion 5X緩沖液 IOii 1、(1見？(每種(1見13各101111)111 1、0嫩模板20叩、引物(IOiiM)各 2 ii l.PhusionHigh-Fidelity DNA 聚合`酶(2.5U/yl) 0.5 yl、蒸餾水 33.5 yl，總體積為 50 yl。擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán));98°C變性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸15秒(30個(gè)循環(huán))；72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。擴(kuò)增產(chǎn)物為磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的突變啟動(dòng)子pck% PCR產(chǎn)物進(jìn)行KpnI酶切。
[0243]上述三個(gè)片段進(jìn)行連接反應(yīng)。連接體系為:pck*酶切PCR片段10ng，kivD酶切PCR 片段 20ng，ilvD 酶切 PCR 片段 15ng，5 U I 2Xquick Iigase 緩沖液(購(gòu)自 NEB 公司)，0.5 u IQuick T4DNA連接酶(購(gòu)自NEB公司)，補(bǔ)充蒸餾水至lOiil。25°C，5分鐘。
[0244]以連接產(chǎn)物為模板，使用引物P-pck*-up-SpeI和iIvD-R-SalI進(jìn)行PCR擴(kuò)增以提高連接產(chǎn)物的濃度。
[0245]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 U 1、dNTP (每種 dNTP各 IOmM) I ii 1、DNA 模板 20ng、引物(IOuM)各 2 y 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/iil)0.5iil、蒸餾水 33.5iil，總體積為 50u 10
[0246]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、58°C退火10秒、72°C延伸I分鐘(30個(gè)循環(huán))；72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。擴(kuò)增產(chǎn)物為pck%kivD和ilvD的連接片段。
[0247]第四步，以pXZ015質(zhì)粒DNA為模板，用引物XZ_pflB-l/XZ-pf 1B-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到pXZ015質(zhì)粒的DNA擴(kuò)增片段。
[0248]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 U 1、dNTP (每種 dNTP各 IOmM) I ii 1、DNA 模板 20ng、引物(IOuM)各 2 y 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸餾水 33.5 μ 1，總體積為 50 μ I。
[0249]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán));98°C變性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分鐘40秒(30個(gè)循環(huán));72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。
[0250]第五步，將含有磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的突變啟動(dòng)子pck'2-酮酸脫羧酶和二羥酸脫水酶的DNA片段連接至第四步PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0251]連接體系為:10ng的第四步PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，30ng的第三步PCR擴(kuò)增DNA片段，2μ I10ΧΤ4 連接緩沖液(NEB 公司)，I μ I Τ4 連接酶(NEB 公司，400，OOOcohesive end units/ml)，補(bǔ)充蒸餾水至20 μ I。室溫連接2小時(shí)，取5μ I加入50μ I Transl-Tl感受態(tài)細(xì)胞中(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)，冰浴30分鐘，42°C熱激30秒，立即置于冰上2分鐘。加入250 μ I LB培養(yǎng)基，200rpm，37°C孵育I小時(shí)。取200 μ I菌液涂在含有卡那霉素(終濃度為15 μ g/ml)的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)陽(yáng)性單菌落，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明在載體PXZ015上插入了磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的突變啟動(dòng)子pck'2-酮酸脫羧酶編碼基因kivD和二羥酸脫水酶ilvD，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將得到的質(zhì)粒命名為pXZ618(構(gòu)建過程見圖5a)。
[0252]第六步，以pXZ016 質(zhì)粒 DNA 為模板，用引物 XZ_pflB-up/XZ-pflB-down 進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到PXZ016質(zhì)粒的DNA擴(kuò)增片段I。
[0253]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 μ 1、dNTP (每種 dNTP各 IOmM)I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(ΙΟμΜ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸餾水 33.5 μ 1，總體積為 50 μ I。
[0254]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分鐘(30個(gè)循環(huán));72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。
[0255]DNA片段I包含丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因pflB上游400個(gè)左右堿基、cat-sacBDNA片段、丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因pflB下游400個(gè)左右堿基。
[0256]將pXZ016質(zhì)粒的DNA擴(kuò)增片段用于第一次同源重組。
[0257]電轉(zhuǎn)條件為:首先準(zhǔn)備帶有PKD46質(zhì)粒的大腸桿菌XZ-T010的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(Dower et al.，1988);將50 μ I感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，加入50ngDNA擴(kuò)增片段I，冰上放置2分鐘，轉(zhuǎn)移至0.2cm的Bio-Rad電擊杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)電穿孔儀，電擊參數(shù)為電壓2.5kv。電擊后迅速將Iml LB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至電擊杯中，吹打5次后轉(zhuǎn)移至試管中，75轉(zhuǎn)，30°C孵育2小時(shí)。取200 μ I菌液涂在含有氯霉素(終濃度為17yg/ml)的LB平板上，37°C過夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證(使用引物XZ-pflB_up/XZ-pf IB-down進(jìn)行驗(yàn)證，正確的菌落擴(kuò)增產(chǎn)物為3909bp的片段)。挑選一個(gè)正確的單菌落，得到菌株AS5 (構(gòu)建過程見圖5b)。
[0258]第七步，以pXZ618 質(zhì)粒 DNA 為模板，用引物 XZ_pflB-up/XZ-pflB-down 進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到PXZ618質(zhì)粒的DNA擴(kuò)增片段II。
[0259]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 μ 1、dNTP (每種 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(ΙΟμΜ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸餾水 33.5 μ 1，總體積為 50 μ I。
[0260]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分鐘15秒(30個(gè)循環(huán));72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。[0261]將PXZ618質(zhì)粒的DNA擴(kuò)增片段用于第二次同源重組。
[0262]電轉(zhuǎn)條件為:首先準(zhǔn)備帶有pKD46的菌株AS5的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(Dower etal.，1988);將50 μ I感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，加入50ng DNA片段II，冰上放置2分鐘，轉(zhuǎn)移至0.2cm的Bio-Rad電擊杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)電穿孔儀，電擊參數(shù)為電壓2.5kv。電擊后迅速將Iml LB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至電擊杯中，吹打5次后轉(zhuǎn)移至試管中，75轉(zhuǎn)，30°C孵育4小時(shí)。將菌液轉(zhuǎn)移至含有10%蔗糖的沒有氯化鈉的LB液體培養(yǎng)基(250ml燒瓶中裝50ml培養(yǎng)基)，培養(yǎng)24小時(shí)后在含有6%蔗糖的沒有氯化鈉的LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。經(jīng)過PCR驗(yàn)證(使用引物XZ-pf lB-up/XZ-pf IB-down進(jìn)行驗(yàn)證，正確的菌落擴(kuò)增產(chǎn)物為4871bp左右的片段。挑選一個(gè)正確的單菌落，將其命名為菌株AS6(表1)(構(gòu)建過程見圖5c)。
[0263](6)整合乳酸乳球菌的醇脫氫酶基因 [0264]將磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的突變啟動(dòng)子pck*和乳酸乳球菌的醇脫氫酶基因adhA (GenBank No:NP_267964.1,NC_002662.1)整合到 AS6 的 frd位點(diǎn)，并提高其表達(dá)強(qiáng)度，共有以下五步:
[0265]第一步，進(jìn)行乳酸乳球菌的醇脫氫酶基因adhA，及pck*啟動(dòng)子的連接反應(yīng)。
[0266]以乳酸乳球菌(Lactococuslactis IL1403，來(lái)自 ATCC，編號(hào) 7962)基因組 DNA 為模板，用引物 adhA-F-XbaI/adhA-R-SalI(SEQ ID NO:33/SEQ ID NO:34)，擴(kuò)增乳酸乳球菌的醇脫氫酶基因adhA。
[0267]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 μ 1、dNTP (每種 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(ΙΟμΜ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸餾水 33.5 μ 1，總體積為 50 μ I。
[0268]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸30秒(30個(gè)循環(huán));72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。
[0269]擴(kuò)增產(chǎn)物為醇脫氫酶基因adhA，PCR產(chǎn)物進(jìn)行XbaI (購(gòu)自NEB公司)酶切。
[0270]以質(zhì)粒pXZ603 為模板，使用引物 P-pck*-up_SpeI 和 P-pck*-down_XbaI (SEQ IDNO:31/SEQ ID NO:32)擴(kuò)增磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的突變啟動(dòng)子pck*。擴(kuò)增體系為:NewEngland Biolabs Phusion 5X 緩沖液 10 μ 1、dNTP (每種 dNTP 各 IOmM) I μ 1、DNA 模板20ng、引物(ΙΟμΜ)各 2μ l.Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸餾水33.5 μ 1，總體積為50 μ I。擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸15秒(30個(gè)循環(huán))；72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。擴(kuò)增產(chǎn)物為磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的突變啟動(dòng)子pck% PCR產(chǎn)物進(jìn)行XbaI酶切。
[0271]兩個(gè)片段進(jìn)行連接反應(yīng)。連接體系為:pck*酶切PCR片段10ng，adhA酶切PCR片段 20ng，5yl 2Xquick Iigase 緩沖液(購(gòu)自 NEB 公司)，0.5 μ I Quick T4DNA 連接酶(購(gòu)自NEB公司)，補(bǔ)充蒸餾水至10 μ I。25°C，5分鐘。
[0272]以連接產(chǎn)物為模板，使用引物P-pck*-up_SpeI和 adhA-R_SalI(SEQ ID NO:31/SEQIDNO:34)進(jìn)行PCR擴(kuò)增以提高連接產(chǎn)物的濃度。
[0273]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 μ 1、dNTP (每種 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(ΙΟμΜ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸餾水 33.5 μ 1，總體積為 50 μ I。[0274]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分鐘(30個(gè)循環(huán));72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。擴(kuò)增產(chǎn)物為pck*和adhA的連接片段。
[0275]第二步，以pXZ005質(zhì)粒DNA為模板，用引物XZ-frdB-2/XZ-frdC_l進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到pXZ005質(zhì)粒的DNA擴(kuò)增片段。
[0276]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 U 1、dNTP (每種 dNTP各 IOmM) I ii 1、DNA 模板 20ng、引物(IOuM)各 2 y 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/iil)0.5iil、蒸餾水 33.5iil，總體積為 50u 10
[0277]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、57°C退火10秒、72°C延伸I分鐘40秒(30個(gè)循環(huán));72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。
[0278]第三步，將含有磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的突變啟動(dòng)子pck'醇脫氫酶基因adhA的DNA片段連接至第二步PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0279]連接體系為:IOng的第二步PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，30ng的第一步PCR擴(kuò)增DNA片段，2 ill10XT4 連接緩沖液(NEB 公司),I U I T4 連接酶(NEB 公司，400，OOOcohesive end units/ml)，補(bǔ)充蒸餾水至20 ill。室溫連接2小時(shí)，取5 ill加入50 ill Transl-Tl感受態(tài)細(xì)胞中(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)，冰浴30分鐘，42°C熱激30秒，立即置于冰上2分鐘。加入250 u I LB培養(yǎng)基，200rpm, 37°C孵育I小時(shí)。取200 yl菌液涂在含有卡那霉素(終濃度為15 u g/ml)的LB平板上，過夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)陽(yáng)性單菌落，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明在載體PXZ005上插入了磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的突變啟動(dòng)子pck*和醇脫氫酶基因adhA，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將得到的質(zhì)粒命名為pXZ619。
[0280]第四步，以pXZ006 質(zhì)粒 DNA 為模板，用引物 XZ-frdB-up/XZ-frdC-down 進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到PXZ006質(zhì)粒的DNA擴(kuò)增片段，將PXZ006質(zhì)粒的DNA擴(kuò)增片段用于第一次同源重組。[0281]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 U 1、dNTP (每種 dNTP各 IOmM) I ii 1、DNA 模板 20ng、引物(IOuM)各 2 y 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/iil)0.5iil、蒸餾水 33.5iil，總體積為 50u 10
[0282]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(I個(gè)循環(huán))；98°C變性10秒、57°C退火10秒、72°C延伸I分鐘(30個(gè)循環(huán));72°C延伸5分鐘(I個(gè)循環(huán))。
[0283]電轉(zhuǎn)條件為:首先準(zhǔn)備帶有PKD46質(zhì)粒的大腸桿菌AS6的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(Dower et al.，1988);將50 感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，加入50ngDNA片段，冰上放置2分鐘，轉(zhuǎn)移至0.2cm的Bio-Rad電擊杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)電穿孔儀，電擊參數(shù)為電壓2.5kv。電擊后迅速將Iml LB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至電擊杯中，吹打5次后轉(zhuǎn)移至試管中，75轉(zhuǎn)，30°C孵育2小時(shí)。取200 ill菌液涂在含有氯霉素(終濃度為17 u g/ml)的LB平板上，37°C過夜培養(yǎng)后，挑選5個(gè)單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證(使用引物XZ-frdB-up/XZ-frdC-down進(jìn)行驗(yàn)證，正確的菌落擴(kuò)增產(chǎn)物為3901bp的片段)。挑選一個(gè)正確的單菌落，將其命名為AS17。
[0284]第五步，以pXZ619質(zhì)粒DNA為模板，用引物XZ-frdB-up/XZ-frdC-down進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PXZ619質(zhì)粒的DNA擴(kuò)增片段，PXZ619質(zhì)粒的DNA擴(kuò)增片段用于第二次同源重組。[0285]擴(kuò)增體系為:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 緩沖液 10 μ 1、dNTP (每種 dNTP各 1OmM) 1 μ 1、DNA 模板 20ng、引物(10μΜ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸餾水 33.5 μ 1，總體積為 50 μ 1。
[0286]擴(kuò)增條件為98°C預(yù)變性2分鐘(1個(gè)循環(huán));98°C變性10秒、57°C退火10秒、72°C延伸1分鐘40秒(30個(gè)循環(huán));72°C延伸5分鐘(1個(gè)循環(huán))。
[0287]電轉(zhuǎn)條件為:首先準(zhǔn)備帶有PKD46質(zhì)粒的大腸桿菌AS17的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(Dower et al.，1988);將50 μ 1感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，加入50ngDNA片段，冰上放置2分鐘，轉(zhuǎn)移至0.2cm的Bio-Rad電擊杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)電穿孔儀，電擊參數(shù)為電壓2.5kv。電擊后迅速將Iml LB培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至電擊杯中，吹打5次后轉(zhuǎn)移至試管中，75轉(zhuǎn)，30°C孵育4小時(shí)。將菌液轉(zhuǎn)移至含有10%蔗糖的沒有氯化鈉的LB液體培養(yǎng)基(250ml燒瓶中裝50ml培養(yǎng)基)，培養(yǎng)24小時(shí)后在含有6%蔗糖的沒有氯化鈉的LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。經(jīng)過PCR驗(yàn)證(使用引物XZ-frdB-up/XZ-frdC-down進(jìn)行驗(yàn)證,正確的菌落擴(kuò)增產(chǎn)物為1844bp左右的片段)，挑選一個(gè)正確的單菌落，將其命名為菌株AS18 (表1)。
[0288]所用引物見表2，構(gòu)建的質(zhì)粒見表3。
[0289]表1、生產(chǎn)異丁醇的重組大腸桿菌
[0290]菌株名相關(guān)特征a_
ATCC 8739~野生型
XZ-T002AldhA
XZ-T004AldhA, ApflB
XZ-T006AldhA, ApflB, Afrd
XZ-TOlOAldhA, ΔρβΒ, Afrd, AackA-pta
AS6XZ-TOI O, pflB::pck*-kivD-1lvD
ASl 8A S 6, frd::pck*-adhA
AS29AS18，ρβΒ:: Ml-93-kivD-1lvD
AS72AS29, AadhE
AS74AS29, /\adhE, AtdcDE
整合α/Μ基因到/也乃五位點(diǎn)并用人工啟動(dòng)子進(jìn)行調(diào)控
AS75AS74, tdcDE: :alsS AS77AS74, tdcDE::Ml-93-alsS
AS78AS74, tdcDE::Ml-37-alsS
AS79AS74, tdcDE::Ml-46-alsS
AS80AS74, tdcDE::Ml-30-alsS
AS81AS74, tdcDE::Ml-64-alsS
AS82AS74, tdcDE::Ml-12-alsS
整合基因到W/d位點(diǎn)并用人工啟動(dòng)子進(jìn)行調(diào)控
AS83AS74，IdhAr.alsS
AS84AS74, ldhA::Ml-93-alsS
AS85AS74, ldhA::Ml-37-alsS
AS86AS74, IdhA::M1 -46-alsS
AS87AS74, ldhA::Ml-30-alsS
AS88AS74, IdhA::Ml-64-alsS
AS89AS74, ldhA::Ml-12-alsS
AS 105AS77, ldhA::Ml-64-alsS
整合z7vC基因到mgsA位點(diǎn)并用人工啟動(dòng)子進(jìn)行調(diào)控
AS 106AS 105, mgsA;:M1 -93-1lvC
AS 107AS 105, mgsA::Ml-37-1lvC
AS 108AS 105, mgsA::Ml-46-1lvC
AS 109AS 105, mgsA::Ml-30-1lvC
在菌株AS108中調(diào)控/wLlS基因表達(dá)
AS 142AS 108, Ml-93-pntAB
AS 143ASm,Ml-37-pntAB
AS 144AS 108, Ml-46-pntAB_
[0291]
【權(quán)利要求】
1.一種重組大腸桿菌，其包含2-酮酸脫羧酶、醇脫氫酶、乙酰乳酸合成酶、乙酰羥酸還原異構(gòu)酶和二羥酸脫水酶，其特征在于所述大腸桿菌中吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶的活性同時(shí)被增強(qiáng)，并且任選地，選自2-酮酸脫羧酶、醇脫氫酶、乙酰乳酸合成酶、乙酰羥酸還原異構(gòu)酶和二羥酸脫水酶中的1、2、3、4或5種酶的活性被增強(qiáng)。
2.權(quán)利要求1的重組大腸桿菌，其中所述2-酮酸脫羧酶和乙酰乳酸合成酶編碼基因是外源的，并且任選地，重組大腸桿菌包含外源的醇脫氫酶編碼基因。
3.權(quán)利要求2的重組大腸桿菌，其中乙酰羥酸還原異構(gòu)酶和二羥酸脫水酶活性被增強(qiáng)。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的重組大腸桿菌，其中所述酶的活性增強(qiáng)是通過將所述酶的基因編碼序列置于強(qiáng)啟動(dòng)子的控制之下和/或增加所述酶編碼基因的一或多個(gè)拷貝。
5.權(quán)利要求4的重組大腸桿菌，其中所述酶編碼基因的一或多個(gè)拷貝和任選存在的啟動(dòng)子核苷酸序列整合入所述重組大腸桿菌的基因組中，或者將包含所述酶編碼基因的質(zhì)粒導(dǎo)入所述重組大腸桿菌中。
6.權(quán)利要求4的重組大腸桿菌，其中所述強(qiáng)啟動(dòng)子選自SEQID NO:1、2、3、4或5任一所示的啟動(dòng)子。
7.權(quán)利要求4的重組大腸桿菌，其包含: (a)活性增強(qiáng)的乙酰羥酸還原異構(gòu)酶； (b)活性增強(qiáng)的二羥酸脫水酶； (C)外源例如來(lái)自乳酸乳球菌的2-酮酸脫羧酶； (d)外源例如來(lái)自枯草芽孢桿菌的`乙酰乳酸合成酶；并且 所述重組大腸桿菌的吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶編碼基因pntAB基因置于強(qiáng)啟動(dòng)子例如SEQIDNO:1、2、3、4或5所示的啟動(dòng)子控制之下；以及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶編碼基因yfjB置于強(qiáng)啟動(dòng)子例如SEQ ID N0:l、2、3、4或5所示的啟動(dòng)子控制之下。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的重組大腸桿菌，其中所述大腸桿菌中選自如下的一或多種內(nèi)源性酶的活性被降低、例如被失活: (i)乳酸脫氫酶； (?)丙酮酸甲酸裂解酶； (iii)富馬酸還原酶； (iv)磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶； (V)乙酸激酶； (vi)乙醇脫氫酶； (vii)丙酸激酶； (viii)甲酸乙酰轉(zhuǎn)移酶；和 (ix)甲基乙二醛合酶。
9.權(quán)利要求8的重組大腸桿菌，其包含: (a)大腸桿菌的乙酰羥酸還原異構(gòu)酶編碼基因ilvC，其被整合到所述重組大腸桿菌染色體的甲基乙二醛合酶編碼基因mgsA位點(diǎn)并且置于SEQ ID NO:3所示的啟動(dòng)子的控制下； (b)大腸桿菌的二羥酸脫水酶編碼基因ilvD，其被整合到所述重組大腸桿菌染色體的丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因PflB位點(diǎn)并且置于SEQ ID NO:1所示的啟動(dòng)子的控制下；(C)乳酸乳球菌的2-酮酸脫羧酶編碼基因kivD，其被整合到所述重組大腸桿菌染色體的丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因PflB位點(diǎn)并且置于SEQ ID NO:1所示的啟動(dòng)子控制之下； (d)乳酸乳球菌的醇脫氫酶編碼基因adhA，其被整合到所述重組大腸桿菌染色體的富馬酸還原酶編碼基因frd位點(diǎn)并且置于SEQ ID NO:75所示的啟動(dòng)子控制之下； (e)枯草芽孢桿菌的乙酰乳酸合成酶編碼基因alsS，其被分別整合到所述重組大腸桿菌染色體的丙酸激酶編碼基因tdcD位點(diǎn)和乳酸脫氫酶編碼基因IdhA位點(diǎn)，并且分別置于SEQ ID NO:1和5所示的啟動(dòng)子控制之下；并且 所述重組大腸桿菌的吡啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶編碼基因PntAB基因的原始啟動(dòng)子被替換為SEQ ID NO:1、3、4或5所示的啟動(dòng)子；以及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶編碼基因yf jB的原始啟動(dòng)子被替換為SEQ ID NO:2、3或4所示的啟動(dòng)子；以及 所述重組大腸桿菌的甲基乙二醛合酶編碼基因mgsA、丙酮酸甲酸裂解酶編碼基因pflB、富馬酸還原酶編碼基因frd、丙酸激酶編碼基因tdcD、甲酸乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因tdcE、乳酸脫氫酶編碼基因ldhA、磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因pta、乙酸激酶編碼基因ackA和乙醇脫氫酶編碼基因adhE被敲除。
10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的重組大腸桿菌在生產(chǎn)異丁醇中的應(yīng)用。
11.一種生產(chǎn)異丁醇的方法，包括: (a)發(fā)酵培養(yǎng)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的重組大腸桿菌； (b)分離并收獲異丁醇。
12.權(quán)利要求11的方法，其中 -發(fā)酵溫度為25°C -39°C ； -發(fā)酵體系的PH值為6.0-8.0 ； -發(fā)酵時(shí)間為24小時(shí)-144小時(shí)； -細(xì)菌液接種培養(yǎng)基的發(fā)酵接種量體積百分比為0.01% -10%，例如0.01%、0.3%或10% ； 發(fā)酵培養(yǎng)基是由以下成分組成的水溶液:葡萄糖、KH2PO4, K2HPO4, (NH4) 2HP04、MgSO4 ? 7H20 和 CaCl2 ? 2H20 ；FeCl3 ? 6H20、CoCl2 ? 6H20、CuCl2 ? 2H20, ZnCl2、Na2MoO4 ? 2H20和 MnCl2 ? 4H20。 其中 葡萄糖為 50g/L-150g/L ；
KH2PO4 為 0.5g/L-5g/L ；
K2HPO4 為 0.5g/L-10g/L ；
(NH4)2HPO4 為 lg/L-lOg/L ；
MgSO4 ? 7H20 為 0.lg/L-5g/L ；
CaCl2 ? 2H20 為 0.lg/L-5g/L ；
FeCl3 ? 6H20 為 0.2 ii g/L-5 u g/L ；
CoCl2 ? 6H20 為 0.05 ii g/L-5 u g/L ；
CuCl2 ? 2H20 為 0.05 ii g/L-5 u g/L ；
ZnCl2 為 0.05 ii g/L-5 u g/L ；
Na2MoO4 ? 2H20 為 0.05 y g/L-5 u g/L ;和MnCl2.4H20 為 0.05 μ g/L-5 μ g/L。
13.權(quán)利要求11或12的方法，其中所述發(fā)酵為好氧發(fā)酵或厭氧發(fā)酵。
14.權(quán)利要求13的方法，其中好氧發(fā)酵的通氣量為0.1-3.0L/min.L。
【文檔編號(hào)】C12P7/04GK103667163SQ201210322624
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年9月4日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月4日
【發(fā)明者】張學(xué)禮, 石愛琴, 朱欣娜, 馬延和 申請(qǐng)人:天津工業(yè)生物技術(shù)研究所