專利名稱：由微生物制造5-酮葡糖酸的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及權利要求1-7所述的用微生物生產5-酮葡糖酸的方法、權利要求8-10所述的葡糖酸鹽NADP+-5-氧化還原酶基因、權利要求11所述的一種結構基因、權利要求12所述載體以及權利要求13-15所述的轉化細胞。
已知細菌例如葡糖桿菌屬能將葡萄糖氧化轉化為葡糖酸鹽并將葡糖酸鹽繼續(xù)轉化為5-酮葡糖酸，緊接著可從培養(yǎng)基中獲得最后得到的5-酮葡糖酸。
用微生物制造并獲得5-酮葡糖酸對于抗壞血酸以及尤其是對于L-(+)-酒石酸制備有切身利益?，F在可以從酒石制備L-(+)-酒石酸，酒石是一種制酒時獲得的副產品。由此該酒石酸的生產要取決于是否有這種原料可供應。通常該酒石原料還摻雜有有機物質，以至于要獲得酒石酸需要進行昂貴的處理。
基于上述不利之處，人們試圖研制可替代的酒石酸制造方法。一種可選擇的方法特別包括將微生物獲得的5-酮葡糖酸轉化為L-(+)-酒石酸(也可參見DE專利申請No.P4440191.4-44)。出于經濟上的投資考慮，這種方法用微生物達到的5-酮葡糖酸的產率仍然是很低的所以舉例來說氧化葡糖桿菌在葡萄糖上生長時不斷地將其氧化為2和5-酮葡糖酸，其中按種類不同得到不同的產率對于2-酮葡糖酸生成其產率范圍為4％-97％，對于5-酮葡糖酸生成其產率范圍為4％-35％-均以被轉變的葡萄糖為基準(Weenk，G.，Olijve，W.和Harder，W.，1984，由葡糖桿菌屬種形成酮基葡糖酸，Appl.microbiol.Biotechnol.20，400-405)。借助于不同的培養(yǎng)條件，總可以優(yōu)先形成兩種酮基葡糖酸中的一種當pH值＝4，培養(yǎng)溫度為25℃并且用CaCO3進行滴定時，可以導致大量生成5-酮葡糖酸(Stadler-Szoke，A.，Nyeste，L.和Hollo，J.，1980，關于影響醋酸桿菌形成葡糖酸和5-酮葡萄糖的因素的研究情況，Acta Aliment.9，155-172)。更高的pH值和更高的溫度會促使2-酮葡糖酸形成(Ameyama，M.和Kond.，K.，1958，醋酸桿菌屬種的碳水化合物代謝。Bull.Agric.Chem.Soc.Japan 22，373-379)。
本發(fā)明的任務是提供一種用微生物制造5-酮葡糖酸的方法，采用這種方法可以使5-酮葡糖酸生成的比例提高。本發(fā)明的另一項任務是制備在所述的方法中可使用的原料。
按照本發(fā)明可解決這些任務，具體地說通過提高基因拷貝數從而使能形成5-酮葡糖酸的微生物的葡糖酸鹽NADP+-5-氧化還原酶基因表達提高。結果導致生成的5-酮葡糖酸所占比例提高。
為了提高基因拷貝數，可將所述葡糖酸鹽-氧化還原酶基因裝入一種基因構件或載體中，尤其是含有屬于該葡糖酸鹽-氧化還原酶基因的調節(jié)基因序列的載體，特別是可以加強基因表達的載體。接著，用含有該葡糖酸-氧化還原酶基因的基因構件轉化能形成5-酮葡糖酸的微生物，特別是葡糖桿菌屬或者是氧化葡糖桿菌。同時這樣的生物體自然也可以作為宿主細胞。該宿主細胞沒有自身的葡糖酸鹽NADP+-5-氧化還原酶基因。
基因分離，克隆和轉化過程按分子生物學領域內熟知的方法進行。舉例來說，若從葡糖桿菌，尤其是從氧化葡糖桿菌分離基因，則基于對相應蛋白質的氨基酸序列的認識進行分離。為了將該基因克隆，使用特定的基因探針。將該基因與適用于宿主細胞的載體和表達系統(tǒng)連接以后，應用慣用的轉化方法，導入到宿主細胞中并且在宿主中進行表達。
當應用例如葡糖桿菌屬，尤其是氧化葡糖桿菌作為宿主細胞時，特別適用的轉化方法是雙和三親本接合轉移法。
在分離和測序之后，可以得到葡糖酸鹽-氧化還原酶基因的核苷酸序列，在表1中列出了該核苷酸序列編碼的氨基酸序列或者其等位變體。等位變體特別包括功能衍生物，該衍生物是從相應的序列中通過核苷酸的缺失，插入或者替代而得到的。但該衍生物仍保留了葡糖酸鹽-氧化還原酶活性。相應的序列描述于表1中。
葡糖酸鹽-氧化還原酶基因優(yōu)選的是特別能提高基因活性的調節(jié)基因序列。因此，通過將調節(jié)基因序列進行突變，可以影響調節(jié)蛋白與待調節(jié)葡糖酸鹽-氧化還原酶基因的DNA結合的效率，通過這種方式加強轉錄，因而提高基因表達。進一步說可將稱為″加強子″的調節(jié)序列歸入調節(jié)葡糖酸鹽氧化還原酶基因，該調節(jié)序列通過改進RNA聚合酶和DNA之間的相互作用而同樣導致基因表達提高。
通過對葡糖酸鹽-氧化還原酶基因進行克隆，可以得到含有該基因的質粒或者載體，并且，如上所述，該質粒或者載體適合于轉化到能形成5-酮葡糖酸的微生物中。通過轉化后得到的細胞含有可復制形式的所述基因，也就是說，該基因作為染色體附加拷貝形式，和/或者作為一種質粒或者載體上的附加拷貝形式。所述轉化細胞優(yōu)選是葡糖桿菌，特別是氧化葡糖桿菌的轉化細胞，上面所述染色體上附加拷貝形式是指通過同源重組，該基因拷貝整合到基因組上任何合適位置上。
實施例酶活性的測定在葡糖酸鹽酶催化氧化為5-酮葡糖酸時，NADP+還原為NADPH并且可用光度計測量證實(Okamoto，k.1963.Enzymatic Studieson the Formationof 5-Ketogluconic Acid by AcetobacterSuboxydans，J.Biochem.53，448-452)。
產品測定采用HPLC對葡糖酸鹽和5-酮葡糖酸進行定量分析(R.Klasen等人，1992，氧化葡糖桿菌沒有能力產生酒石酸，Biotechnol.Bioeng.40183-186)。
葡糖酸鹽NADP+-5-氧化還原酶的提純陰離子交換器將氧化葡糖桿菌的不含細胞提取物上樣到并固定到一個陰離子交換器(DEAE-Tentakel，Merck Darmstadt；5 15cm)上。用逐漸增加的NaCl梯度(0-500mM)在350mMNaCl處將該酶洗脫，將活性組分合并并用超濾裝置(Amicon；截止分子量10KDa)進行滲透。
染色親和層析將滲透過的酶溶液上樣并固定到一個染色親和柱上(藍瓊脂糖CL-6BTM，2，6 20cm(T.Atkinson等人，1981，Triazine-dye affinitychromatography，Bio-chem.Soc.Trans.910-13)。用逐漸增高的NaCl梯度(0-500mM)在300mM NaCl處將該酶洗脫。將活性組分合并用一個超濾裝置(Amincon；截止分子量10KDa)在25mM組氨酸/HCl緩沖液pH5.6中滲透。
色譜調焦(Chromatofokussierung)I.將滲透過的酶溶液上樣到用25mM組氨酸/HCl緩沖液pH5.6平衡過的Mono-PTM-層析柱(Pharmacia，Freiburg；0.5×20cm)。應用50ml Polypuffer PB74(Pharmacia，Freiburg)pH4.0到柱上來調節(jié)pH梯度并用此從柱上洗脫蛋白質。
凝膠過濾將合并的活性組分施加到一個凝膠過濾柱(Sephaeryl-S100HR，Pharmacia，Freiburg；2.6×100cm)上。以同樣方式進行洗脫。將活性組分進行合并并用一個起濾裝置(Amicon；截止分子量10KDa)在2.5mM乙酸鹽/NaOH緩沖液pH4.8中滲透。
色譜調焦(Chromatofokussierung)II蛋白質溶液加樣到一個用25mM乙酸鹽/NaOH緩沖液pH4.8平衡過的Mono-PTM-層析柱(Pharmacia，Freiburg；0.5×20cm)。應用50ml的PolypufferPB74(Pharmacia，Freiburg)pH 4.0到柱上，調節(jié)pH梯度，并洗脫蛋白質。通過SDS-PAGE電泳檢測純度之后，將純化的蛋白質等分成樣品，在液氮中冷凍并置于-70℃貯存。
對氨基末端進行測序為了測定氨基末端的氨基酸序列，將100ug純化的蛋白質轉移到PVDF膜上并用一個氣相測序儀(Appl.Biosystems，model 470A)進行檢測(P.Edman等人，1967.一種蛋白質測序儀，Eur.J.Biochem.180-91)。采用HPLC方法可以顯示被分裂出的氨基酸衍生物(苯海硫因)。
基因探針的制備如果沒有特別提到，則根據T.Maniatis等人(1989，MolecularCloningALaboratory manual第2版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold SpringHarbor，N.Y)完成所有分子生物學工作。通過Edman測序分析，檢測出了葡糖酸鹽NADP+-5-氧化還原酶的2-18個氨基酸(

圖1A)。在將蛋白質序列轉譯為相應的核苷酸序列之后，考慮到遺傳密碼的向并性，得到了高度簡并的DNA序列。為了構建一個gno-基因探針，合成符合所要探測肽序列末端的PCR引物(圖IB)。對該引物的5′末端用EcoRI和SacI酶進行限制性切割，以便后面進行克隆時有較高的選擇性。在將引物分離之后，利用該引物，以氧化葡糖桿菌的純化染色體DNA(Y.Takeda等人，1991.CloningandSeguencing of the Gene Encoding Cytochrome C-553(CO)fromGluconobactor oxydans.J.Ferment.Bioeng.721-6)作為模板進行RCR反應(S.J.Gould等人，1989。Use of the polymerasechain reaction forhomology probingIsolation of partialCDNA or genomic clones encodingthe iron-sulfur proteinof succinate dehydrogenase from severalspecies.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861934-1938)。在制備性4％的瓊脂糖凝膠電泳之后分離出一個66bp片段并用限制性核酸內切酶EcoRI和SacI切割。將此制備好的片段與相應酶切割的質粒puc19連接之后克隆到大腸桿菌中。對該66bp PCR片段進行測序，以便探查出沒有簡并的編碼該蛋白質的氨基末端區(qū)域的DNA序列。該DNA序列可以翻譯出其含有的肽序列(圖1C)。從該定序了的PCR片段上探查出一個區(qū)域，該區(qū)域長度為45bp，符合氧化葡糖桿菌的GC含量(60-65％，J.de ley等人，1970.The Status of thegeneric name Gluconobacter.Int.J.Syst.Bact.2083-95)。該序列可用作為合成gno-基因探針的模板(圖1D)。
gno基因限制性圖譜的建立基于現有的PCR實驗經驗，構建一個gno-基因探針并且在用異羥基毛地黃毒苷元標記之后(G.G.Schmitz等人，1991，用末端轉移酶處理尾部后用半抗原異羥基毛地黃毒苷對寡核苷酸進行體外非放射性標記，Anal.Biochem.192222-231)用于進行Southern印跡試驗(E.M.Southern，1975.對凝膠電泳分離的DNA片段中檢測特異性片段，J.Mol.Biol.8503-517)。同時將氧化葡糖桿菌的染色體DNA用限制性內切核酸酶的不同組合進行切割并且在通過瓊脂糖凝膠電泳將限制性切割后各組分分離之后轉移到尼龍膜上。在用基因探針雜交之后，當時的每個組分顯示清晰信號。計算雜交片段的大小之后測定了限制性圖譜(圖1E)。
gno-基因的克隆在制造出了氧化葡糖桿菌的基因庫的一部分之后，借助于菌落雜交將一個3.4Kb BamHI片段進行克隆，該片段攜帶整個gno基因(M.Grunstein等人，1975.菌落雜交分離含有特定基因的克隆DNA的方法，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.723961-3965)。
對gno基因測序對染色體區(qū)域上有關gno-基因進行序列測定(F.Sanger等人，1977.用鏈終止抑制劑進行DNA序列測定.Proc.Natl.Acad.Sci.USA745463-5467)產生一個1510bp的核苷酸序列，其中包含一個771bp的開放閱讀框架，該開放閱讀框架編碼一個分子量為27,300的具有257個氨基酸的多肽(表1)。該核苷酸序列在起始密碼子前面有10bp的一個核糖體結合位點(J.Shine等人，1974，大腸桿菌16s核糖體RNA的3′-末端序列與無意義模板和核糖體結合位點互補。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 711342-1346)以及在終止密碼子之后有160bp的終止子型回文結構(M.Rosenberg等人，1979，與RNA轉錄的啟動和終止相關的調節(jié)序列。Annu.Rev.Genet.13319-353)?；谕茖С龅陌被嵝蛄校a生了由蛋白質測序方法獲得的肽序列。
gno基因在氧化葡糖桿菌中的表達選擇RSF1010質粒的衍生物作為適用于氧化葡糖桿菌的載體DNA，因為該質粒的復制子可以保證在廣譜革蘭氏陰性細菌中進行DNA復制(U.B.Priefer等人，1985，通過引入RSF1010復制和移動功能擴大了大腸桿菌的宿主范圍，J.Bacteriol.163324-330)。應用PRS201PR質粒為基礎，繼續(xù)研究在氧化葡糖桿菌中的基因轉移(R.Schroder等人，1991，利用具廣譜宿主范圍的載體在Acetobacter methanolicus中表達乙肝病毒(HBV)的核心抗原，Appl.Microbiol.Biotechnol.35631-637)。采用接合方式實現質粒轉移(C.Condon等人，1991，在氧化葡糖桿菌種，弱氧化葡糖桿菌中接合以及異源基因的表達。FEMS Microbiol.Lett.80173-178)。該PRS201PR質粒除啟動子外還含有編碼CI-抑制子的溫度敏感型衍生物(CI857)的基因，該衍生物調節(jié)該啟動子。為了使啟動子不受調節(jié)，將PRS201PR質粒的CI857抑制子的一部分消除(PRS201P)。將編碼該葡糖酸鹽NADP+-5-氧化還原酶的一個1.25Kb Bam HI/Sal I片段與經過相同限制性切割的PRS201PR和PRS201P相連接。通過接合將質粒PRS201PR-gno和PRS201P-gno轉移到氧化葡糖桿菌中。活性檢測結果顯示在重組氧化葡糖桿菌菌株中葡糖酸鹽NADP+-5-氧化還原酶活性提高了6.5至8.5倍(表2)。
重組菌株生產5-酮葡糖酸的能力為了測定重組氧化葡糖桿菌的5-酮葡糖酸生產能力，檢測出在發(fā)酵培養(yǎng)基中積累的5-酮葡糖酸(U.Kotera等人，1972，5-酮葡糖酸新氧化產物的分離和化學結構，以及通過該新化合物從葡萄糖至酒石酸的假設途徑，Agric.Biol.Chem.361315-1325)。為了測定分析代謝產物每天取出樣品并且采用HPLC檢測法進行定量檢測。與具有野生型的葡糖酸鹽NADP+-5-氧化還原酶活性的菌株(氧化葡糖桿菌野生型，氧化葡糖桿菌PRS201P)相比，由于gno基因的超過量表達(氧化葡糖桿菌PRS201P-gno)，5-酮葡糖酸的形成提高了11％(表3)。
表1編碼氧化葡糖桿菌的葡糖酸鹽NADP+-5-氧化還原酶的基因的核苷酸序列。底下劃線部分為可能的核糖體結合位點，箭頭所指部分標明潛在的終止子。核苷酸序列下面對應的為蛋白質的氨基酸序列。已經被定序的氨基末端肽序列底下也劃了線。重要的限制性切割位點用粗體印刷。
10 30 50TCACACCCAGATCTCAAAAATCACAGACGGGACACGAGAAAAGACATACCCGAAGTCCACCTAACGTTT70 90 110 130GTTCGCAATGAAATATCACATTTCAACAACACAAACTCTCGTTATCGATGTTACATATAACCTTCATGC150 170 190TGTCCAGAAGCGGGCGGGAAGTTTTTCTGACAAAACTTGATTGCCCGTCTGAGAGCACGCGATGCGCAC210 230 250 270GCGGACTTGTGGATCCCTGGCGGGTTTAGGCTGCTAGGAAGAACAGAACCGTGATTTTGAAGGCTGACABamHI290 310 330GATATGTCCCATCCCGATCTTTTTTCTCTCTCCGGTGCGCGCGCCCTTGTGACCGGGGCGTCACGGGGAM S H P D L F S L S G A R A L V T G A S R G350 370 390 410ATTGGCCTGACGCTGGCAAAGGGGCTTGCGCGCTACGGGGCTGAGGTTGTCCTGAATGGCCGGAATGCTI G L T L A K G L A R Y G A E V V L N G R N A430 450 470GAAAGTCTGGACTCTGCGCAGTCCGGGTTCGAGGCGGAAGGATTGAAAGCCAGTACGGCGGTTTTCGATE S L D S A Q S G F E A E G L K A S T A V F D490 510 530 550GTGACGGATCAGGATGCGGTGATTGATGGCGTCGCGGCGATTGAGCGGGACATGGGACCGATCGATATCV T D Q D A V I D G V A A I E R D M G P I D I570 590 610CTGATCAATAATGCCGGGATACAGCGCCGAGCGCCTCTGGAGGAGTTTTCGCGCAAGGACTGGGATGATL I N N A G I Q R R A P L E E F S R K D W D D630 650 670 690CTGATGTCAACCAATGTCAACGCGGTTTTCTTCGTCGGGCAGGCGGTGGCGCGGCACATGATTCCCCGCL M S T N V N A V F F V G Q A V A R H M I P R710 730 750GGACGGGGCAAGATCGTCAATATCTGTTCCGTCCAGAGTGAACTCGCCCGTCCGGGAATTGCGCCCTATG R G K I V N I C S V Q S E L A R P G I A P Y770 790 810 -ACGGCGACCAAGGGAGCGGTCAAAAACCTGACAAAAGGTATGGCGACGGACTGGGGCAGGCACGGACTTT A T K G A V K N L T K G M A T D W G R H G L830850 870 890CAGATCAACGGGCTGGCACCGGGGTATTTTGCGACGGAAATGACAGAAAGGCTCGTGGCGGACGAAGAAQ I N G L A P G Y F A T E M T E R L V A D E E910 930 950TTCACGGACTGGCTGTGCAAACGGACGCCGGCAGGACGGTGGGGGCAGGTTGAGGAACTGGTCGGAGCAF T D W L C K R T P A G R W G Q V E E L V G A
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表3采用重組氧化葡糖桿菌菌株將葡萄糖轉變?yōu)?-酮葡糖酸。培養(yǎng)是在含有10％(W/V)葡萄糖的基本培養(yǎng)基中完成的。菌株 時間[d]5-酮葡糖酸[mM]氧化葡糖桿菌野生型1 152 563 71氧化葡糖桿菌PRS201P1 122 583 69氧化葡糖桿菌PRS201P-gno 1 192 663 79圖1來自氧化葡糖桿菌的葡糖酸鹽NADP+5-氧化還原酶的氨基末端序列，PCR引物以及gno基因探針。A蛋白質氨基末端的氨基酸序列。BPCR引物的序列。CPCR產物的核苷酸序列。D所使用的基因探針的序列。E染色體區(qū)上有關gno基因的限制性圖譜。
權利要求
1.用微生物制造5-酮葡糖酸的方法，其中包括提高一種形成5-酮葡糖酸的微生物中的葡糖酸鹽NADP+-5-氧化還原酶基因表達。
2.根據權利要求1所述方法，其特征在于，通過提高葡糖酸鹽-氧化還原酶基因拷貝數來提高葡糖酸鹽-氧化還原酶基因表達。
3.根據權利要求2所述方法，其特征在于，為了提高基因拷貝數，將葡糖酸鹽-氧化還原酶基因裝入一個基因構件中。
4.根據權利要求3所述方法，其特征在于，將葡糖酸鹽-氧化還原酶基因裝入一個基因構件中，該基因構件含有歸屬于葡糖酸鹽氧化還原酶基因的調節(jié)基因序列。
5.根據權利要求3或4的所述方法，其特征在于，用含有葡糖酸鹽-氧化還原酶基因的基因構件轉化能形成5-酮葡糖酸的微生物。
6.根據權利要求5所述方法，其特征在于，用含有葡糖酸鹽氧化還原酶基因的基因構件轉化葡糖桿菌，尤其是氧化葡糖桿菌。
7.根據前面權利要求任一項所述方法，其特征在于，葡糖酸鹽-氧化還原酶基因是從葡糖桿菌，尤其是氧化葡糖桿菌中分離的。
8.一種葡糖酸鹽NADP+-5-氧化還原酶基因，它具有編碼表1所示氨基酸序列以及其等位變異體的核苷酸序列。
9.根據權利要求8所述葡糖酸鹽-氧化還原酶基因，具有表1所述核苷酸序列或者實質上有相同功能的DNA序列。
10.根據權利要求8或9所述葡糖酸鹽-氧化還原酶基因，它具有屬于此類的調節(jié)基因序列。
11.結構基因，含有權利要求8-10之一所述葡糖酸鹽氧化還原酶基因。
12.載體，含有權利要求8-10之一所述的葡糖酸鹽氧化還原酶基因或者權利要求11所述的結構基因。
13.轉化細胞，含有可復制形式的權利要求8-10之一所述的葡糖酸鹽-氧化還原酶基因或者權利要求11所述的結構基因。
14.根據權利要求13所述轉化細胞，包含有權利要求12所述載體。
15.根據權利要求13或者14所述轉化細胞，其特征在于，它是葡糖桿菌，優(yōu)選是氧化葡糖桿菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種由微生物制造5-酮葡糖酸的方法。5-酮葡糖酸對于抗壞血酸和L-(+)-酒石酸的生產具有特殊意義。傳統(tǒng)方法是由酒石制造L-(+)-酒石酸，結果由于酒石被有機物質污染而需要價格昂貴的純化方法。因而本發(fā)明提供了5-酮葡糖酸的細菌制造方法，采用該方法將提高能形成5-酮葡糖酸的微生物的葡糖酸鹽NADP
文檔編號C12P7/40GK1138631SQ96105580
公開日1996年12月25日 申請日期1996年2月7日 優(yōu)先權日1995年2月7日
發(fā)明者R·克拉森, S·布林格-邁耶, H·薩姆, C·P·霍倫伯格 申請人:萊因新生物技術工藝和產品公司