專利名稱：新型植物基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物中的廣譜病害抗性、包括系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)的現(xiàn)象。更具體地說，本發(fā)明涉及與可導(dǎo)致植物中系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)相關(guān)的鼠耳芥屬NIM1基因同源物的鑒定、分離和表征。
植物經(jīng)常受到包括病毒、細(xì)菌、真菌和線蟲在內(nèi)的各種致病生物體的攻擊。農(nóng)作物植物特別脆弱，因?yàn)樗鼈兺ǔＩL成遺傳均勻的單種栽培物；當(dāng)病害發(fā)作時(shí)，損失可能是嚴(yán)重的。然而，大部分植物具有其抵抗致病生物體的先天機(jī)制。植物培育者和病理學(xué)家已經(jīng)鑒定了對植物病原體具有抗性的天然變化形式并將其培育成許多農(nóng)作物植物。這些天然病害抗性基因通常提供了抵抗病原體的高水平抗性或免疫性。
系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)是一種用于自身抵抗病原體的復(fù)合系統(tǒng)植物的組成部分(Hunt和Ryals，1996；Ryals等，1996)。另外參見美國專利號5,614,395。SAR是植物病原體反應(yīng)的一個(gè)特別重要的方面，因?yàn)樗遣≡w誘導(dǎo)的對包括病毒、細(xì)菌和真菌在內(nèi)的廣譜感染性病原體的系統(tǒng)抗性。當(dāng)SAR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被阻斷時(shí)，植物變得對通常導(dǎo)致病害的病原體更為敏感且它們對不經(jīng)常導(dǎo)致病害的某些感染性病原體也變得敏感(Gaffney等，1997；Delaney等，1994；Delaney等，1997；Bi等，1995；Mauch-Mani和Slusarenko，1996)。這些觀察結(jié)果表明SAR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對維持植物健康是關(guān)鍵的。
在理論上，SAR反應(yīng)可以被分成兩個(gè)階段。在初始階段中，識別病原體感染且釋放通過韌皮部傳輸?shù)竭h(yuǎn)端組織的信號。這種系統(tǒng)性信號被因SAR基因和病害抗性的表達(dá)而起反應(yīng)的靶細(xì)胞覺察。SAR的維持期是指從數(shù)周到植物的整個(gè)生命期的時(shí)間期限，在此過程中該植物是準(zhǔn)穩(wěn)態(tài)的且病害抗性得到控制(Ryals等，1996)。
水楊酸(SA)的累積看起來是SAR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所需的。不能因用特異性抑制劑處理，即，苯丙氨酸解氨酶的后生阻抑或特異性降解SA的水楊酸羥化酶的轉(zhuǎn)基因表達(dá)而累積SA的植物也不能誘導(dǎo)SAR基因表達(dá)或病害抗性(Gaffney等，1993；Delaney等，1994；Mauch-Mani和Slusaerenko，1996；Maher等，1994；Pallas等，1996)。盡管已經(jīng)建議SA可以用作系統(tǒng)性信號，但是目前這是有爭議的；且迄今為止，確切已知所有情況是如果SA不能累積，那么SAR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)將被阻斷(Pallas等1996；Shulaev，1995；Vernooij等，1994)。
近來，鼠耳芥屬已經(jīng)表現(xiàn)出可作為研究SAR的模型系統(tǒng)(Uknes等，1992；Uknes等，1993；Cameron等，1994；Mauch-Mani和Slusarenko，1994；Dempsey和Klessig，1995)。已經(jīng)證實(shí)鼠耳芥屬中的SAR可以被病原體和諸如SA、2，6-二氯異煙酸(INA)和苯并(1，2，3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲酯(BTH)這樣的化學(xué)藥品所激活(Uknes等，1992；Vernooij等，1995；Lawton等，1996)。在用INA或BTH進(jìn)行處理或病原體感染后，至少三種與病理相關(guān)的(PR)蛋白質(zhì)基因即PR-1、PR-2和PR-5同時(shí)被誘導(dǎo)且伴隨抗性發(fā)作(Uknes等，1992，1993)。在煙草中，用病原體或免疫化合物處理的最佳特征化物種誘導(dǎo)至少9組基因的表達(dá)(Ward等，1991)。通過用不同的SAR基因轉(zhuǎn)化植物已經(jīng)產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因病害抗性植物(美國專利號5,614,395)。
已經(jīng)分離出了具有改良的SAR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的大量鼠耳芥屬突變體(Delaney，1997)。這些突變體中最重要的是所謂的1sd(病變模擬病害)突變體和acd2(加速的細(xì)胞死亡)(Dietrich等，1994；Greenberg等，1994)。這些突變體均在其葉上具有一定程度的自發(fā)性壞死病變形成、SA水平升高、SAR基因的mRNA累積和病害抗性顯著提高。已經(jīng)分離并表征了至少7種不同的1sd突變體(Dietrich等；1994；Weymann等，1995)。另一種有意義類型的突變體是cim(組成型免疫)突變體(Lawton等，1993)。另外參見美國專利號5,792,904和國際PCT申請WO 94/16077。類似于1sd突變體和acd2，cim突變體具有升高的SA和SAR基因表達(dá)和抗性，不過，與1sd或acd2相反，在其葉上不會(huì)表現(xiàn)出可檢測到的病變。cpr1(PR基因的組成型表達(dá)子)可以是一類cim突變體；然而，因?yàn)樯形聪齝pr1葉上存在的顯微病變，所以cpr1可能是一類1sd突變體(Bowling等，1994)。
已經(jīng)分離了在SAR信號傳輸中被阻斷的突變體。ndr1(非物種特異性病害抗性)是一種使含有不同無毒力基因的丁香假單胞菌和寄生霜霉的一般無毒性分離物生長的突變體(Century等；1995)。顯然這種突變體在SAR信號傳輸中的早期被阻斷。npr1(PR基因的非表達(dá)子)是一種不能在INA處理后誘導(dǎo)SAR信號途徑表達(dá)的突變體(Cao等，1994)。已經(jīng)根據(jù)eds(增強(qiáng)的病害敏感性)突變體在接種低濃度細(xì)菌后維持細(xì)菌感染的能力分離了它們(Glazebrook等，1996；Parker等，1996)。某些eds突變體在表型上非常類似于npr1且近來已經(jīng)證實(shí)eds5和eds53是npr1的等位基因(Glazebrook等，1996)。nim1(非誘導(dǎo)型免疫)是一種在用INA處理后維持寄生霜霉(即霜霉病致病病原體)生長的突變體(Delaney等，1995；美國專利號5,792,904)。盡管nim1可以在病原體感染后累積SA，但是它不能誘導(dǎo)SAR基因表達(dá)或病害抗性，這提示這種突變阻斷了SA下游的途徑。nim1在其對INA或BTH反應(yīng)的能力上也受到了削弱，這提示在這些化學(xué)藥品作用的下游存在阻斷作用(Delaney等，1995；Lawton等，1996)。
已經(jīng)分離并表征了鼠耳芥屬的等位基因，它們的突變體分別對nim1和npr1表型負(fù)責(zé)(Ryals等，1997；Cao等，1997)。野生型NIM1基因產(chǎn)物與導(dǎo)致鼠耳芥屬中SAR和基因?qū)虿『剐缘男盘栟D(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)有關(guān)(Ryals等，1997)。Ryals等，1997還報(bào)導(dǎo)了nim1的另外5種等位基因的分離方法，這些等位基因顯示出在化學(xué)誘導(dǎo)的PR-1基因表達(dá)和真菌抗性方面從每周削弱到被強(qiáng)力阻斷的一系列的表型。將野生型NPR1基因轉(zhuǎn)化成npr1突變體不僅補(bǔ)充了突變，從而恢復(fù)了SAR誘導(dǎo)作用對PR-基因表達(dá)和病害抗性的反應(yīng)性，而且在沒有SAR誘導(dǎo)作用存在的情況下賦予了所述的轉(zhuǎn)基因植物對丁香假單胞菌導(dǎo)致的感染更高的抗性(Cao等，1997)。WO 98/06748中描述了從鼠耳芥屬中分離NPR1和從Nicotiana glutinosa中分離同源物的方法。另外參見WO 97/49822、WO 98/26082和WO 98/29537。
盡管作了大量研究且應(yīng)用了包括植物的遺傳轉(zhuǎn)化在內(nèi)的完善和深入細(xì)致的農(nóng)作物保護(hù)措施，但是每年因病害導(dǎo)致的損失仍保持在10億美元。因此，存在對開發(fā)基于植物中病害抗性的遺傳基礎(chǔ)不斷增加的了解的新的農(nóng)作物保護(hù)措施的持續(xù)需求。特別地，存在對鑒定、分離和表征來自其它植物物種的鼠耳芥屬NIM1基因的同源物的需求。
在描述本發(fā)明的過程中，使用下列術(shù)語且這些術(shù)語的定義如下所示。
相關(guān)/可操作地連接指的是物理或功能相關(guān)的兩個(gè)DNA序列。例如，認(rèn)為啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)DNA序列與編碼RNA或蛋白質(zhì)的DNA序列“相關(guān)”，條件是這兩個(gè)序列可操作地連接或定位以使調(diào)節(jié)DNA序列影響編碼或結(jié)構(gòu)DNA序列的表達(dá)水平。
嵌合基因一種重組DNA序列，其中啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)DNA序列可操作地與編碼mRNA或表達(dá)為蛋白質(zhì)的DNA序列連接或相關(guān)，使得調(diào)節(jié)DNA序列能夠調(diào)節(jié)相關(guān)DNA序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)。嵌合基因的調(diào)節(jié)DNA序列通常不與在自然界中發(fā)現(xiàn)的相關(guān)的DNA序列可操作地連接。
編碼序列轉(zhuǎn)錄成諸如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有義RNA或反義RNA這樣的RNA的核酸序列。優(yōu)選隨后在生物體中翻譯所述的RNA以便產(chǎn)生蛋白質(zhì)。
互補(bǔ)指的是包括反平行核苷酸序列的兩個(gè)核苷酸序列，所述的反平行核苷酸序列能夠在反平行核苷酸序列中的互補(bǔ)堿基對殘基之間形成氫鍵時(shí)彼此配對。
表達(dá)指的是植物中內(nèi)源性基因或轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。例如，就反義構(gòu)建體而言，表達(dá)可能指的僅是反義DNA的轉(zhuǎn)錄。
表達(dá)彈夾能夠指導(dǎo)特定核苷酸序列在合適的宿主細(xì)胞中的表達(dá)的核酸序列，它包括與感興趣的核苷酸序列可操作地連接的啟動(dòng)子，所述的感興趣的核苷酸序列與終止信號可操作地連接。它一般還包括適當(dāng)翻譯所述核苷酸序列所需的序列。包括感興趣的核苷酸序列的表達(dá)彈夾可以是嵌合的，即其成分中的至少一種相對于其其它成分中的至少一種而言是異源的。該表達(dá)彈夾還可以是一種天然出現(xiàn)但已經(jīng)以用于異源表達(dá)的重組形式獲得的表達(dá)彈夾。然而，一般來說，該表達(dá)彈夾相對于宿主而言是異源的，即所述表達(dá)彈夾的特定核酸序列不會(huì)在宿主細(xì)胞中天然出現(xiàn)且必須通過轉(zhuǎn)化事件將其引入宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞的祖先。表達(dá)彈夾中核苷酸序列的表達(dá)可以在組成型啟動(dòng)子或僅當(dāng)宿主細(xì)胞接觸某些特定的外部刺激物時(shí)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下進(jìn)行。就諸如植物這樣的多細(xì)胞生物體而言，所述的啟動(dòng)子對特定的組織或器官或發(fā)育階段也具有特異性。
基因位于基因組內(nèi)且除上述編碼核酸序列外還包括對控制編碼部分的表達(dá)、即轉(zhuǎn)錄和翻譯來說是必不可少的其它主要調(diào)節(jié)核酸序列的確定區(qū)。基因還可以包括其它的5’和3’未翻譯序列和終止序列?？梢源嬖诘钠渌缡莾?nèi)含子。
異源DNA序列本文所用的術(shù)語“異源DNA序列”、“外源DNA片段”或“異源核酸”各自指的是來源于對特定宿主細(xì)胞而言是外來的來源的序列或如果來自相同來源那么是根據(jù)其原始形式修飾的序列。因此，宿主細(xì)胞中的異源基因包括對特定宿主細(xì)胞而言是內(nèi)源性的但例如已經(jīng)通過應(yīng)用DNA改組修飾的基因。該術(shù)語還包括天然出現(xiàn)的DNA序列的非天然出現(xiàn)的多拷貝。因此，該術(shù)語指的是一種DNA片段，它對所述細(xì)胞而言是外源的或異源的或與所述細(xì)胞同源但位于通常未發(fā)現(xiàn)所述元件的所述宿主細(xì)胞核酸內(nèi)的某一位置上。表達(dá)外源DNA片段以便產(chǎn)生外源性多肽類。
同源DNA序列天然與引入其中的宿主細(xì)胞相關(guān)的DNA序列。
同類編碼當(dāng)核酸序列編碼與由參比核酸序列編碼的多肽具有相同的氨基酸序列的多肽時(shí)該核酸序列與參比核酸序列一起同類編碼。
分離的在本發(fā)明的上下文中，分離的核酸分子或分離的酶是一種脫離其天然環(huán)境存在且因此不是天然產(chǎn)物的受人控制的核酸分子或酶。分離的核酸分子或酶可以以純化形式存在或可以存在于諸如例如重組宿主細(xì)胞這樣的非天然環(huán)境中。
最小啟動(dòng)子啟動(dòng)子元件、特別是TATA元件，它們是無活性的或在沒有上游激活的情況下具有顯著降低的啟動(dòng)子活性。在有合適的轉(zhuǎn)錄因子存在的情況下，最小啟動(dòng)子的功能是啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。
天然的指的是存在于未轉(zhuǎn)化細(xì)胞基因組中的基因。
天然出現(xiàn)的術(shù)語“天然出現(xiàn)的”用于描述與由人通過人工方式生產(chǎn)不同的能在自然界中發(fā)現(xiàn)的物體。例如，存在于生物體(包括病毒)中的蛋白質(zhì)或核苷酸序列是天然出現(xiàn)的，它們可以分離自天然來源且沒有被人在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行過人為修飾。
NIM1Ryals等，1997中描述的基因，它與SAR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)有關(guān)。
NIM1由NIM1基因編碼的蛋白質(zhì)。
核酸術(shù)語“核酸”指的是脫氧核苷酸或核糖核苷酸及其單或雙鏈形式的聚合物。除非另有限定，該術(shù)語包括含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，它們與參比核酸具有相似的結(jié)合特性且以與天然出現(xiàn)的核苷酸相似的方式被代謝。除非另有說明，特定的核酸序列無疑還包括其保守修飾的變化形式(例如簡并密碼子取代)和互補(bǔ)序列以及明確指定的序列。具體地，可以通過生成其中一種或多種選擇的(或全部)密碼子的第三位被混合的堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實(shí)現(xiàn)簡并密碼子取代(Batzer等，《核酸研究》(Nucleic Acid Res.)195081(1991)；Ohtsuka等，《生化雜志》(J.Biol.Chem.)2602605-2608(1985)；Rossolini等，《分子細(xì)胞探針》(Mol.Cell.Probes)891-98(1994))。也可以將術(shù)語“核酸”或“核酸序列”與基因、cDNA和由基因編碼的mRNA互換使用。在本發(fā)明的上下文中，核酸分子優(yōu)選是DNA片段。核苷酸由下列標(biāo)準(zhǔn)縮寫的其堿基來表示腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和鳥嘌呤(G)。
ORF可讀框。
植物任何完整的植物。
植物細(xì)胞植物的結(jié)構(gòu)和生理單位，它包括原生質(zhì)體和細(xì)胞壁。植物細(xì)胞可以是分離的單細(xì)胞或培養(yǎng)的細(xì)胞形式或作為諸如例如植物組織、植物器官或完整植物這樣的高級機(jī)體構(gòu)造單位的一部分。
植物細(xì)胞培養(yǎng)物植物單位培養(yǎng)物，諸如例如原生質(zhì)體、細(xì)胞培養(yǎng)物細(xì)胞、植物組織中的細(xì)胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、合子和不同發(fā)育階段的胚。
植物材料指的是葉、莖、根、花或花的部分、果實(shí)、花粉、卵細(xì)胞、合子、種子、插條、細(xì)胞或組織培養(yǎng)物、或植物的任何其它部分或產(chǎn)物。
植物器官植物明顯的和可見的結(jié)構(gòu)和分化部分，諸如根、莖、葉、花芽或胚。
植物組織組織成結(jié)構(gòu)和功能單位的一組植物細(xì)胞。包括植物或培養(yǎng)物中的植物的任何組織。本術(shù)語包括但不限于完整植物、植物器官、植物種子、組織培養(yǎng)物和組織成結(jié)構(gòu)和/或功能單位的任何組的植物細(xì)胞。該術(shù)語連同如上所述的或由本定義包括的任何特殊類型的植物組織一起使用或在沒有如上所述的或由本定義包括的任何特殊類型的植物組織的情況下使用并不排除任何其它類型的植物組織。
啟動(dòng)子含有RNA聚合酶II的結(jié)合位點(diǎn)并啟動(dòng)DNA轉(zhuǎn)錄的編碼區(qū)上游的未翻譯的DNA序列。啟動(dòng)子區(qū)還可以包括起基因表達(dá)調(diào)節(jié)物作用的其它元件。
原生質(zhì)體不含細(xì)胞壁或僅含部分細(xì)胞壁的分離的植物細(xì)胞。
純化的術(shù)語“純化的”在用于核酸或蛋白質(zhì)時(shí)指的是基本上不含其它在天然狀態(tài)下與其相關(guān)的細(xì)胞成分的核酸或蛋白質(zhì)。優(yōu)選它是在同源狀態(tài)下，不過，它可以處于無水的或含水的溶液中。一般使用諸如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相層析這樣的分析型化學(xué)技術(shù)來測定純度和均勻性。屬于存在于制品中的主要物質(zhì)的蛋白質(zhì)基本上是純化的。術(shù)語“純化的”指的是核酸或蛋白質(zhì)在電泳凝膠中主要產(chǎn)生一條帶。特別地，它指的是核酸或蛋白質(zhì)的純度至少約為50％、更優(yōu)選純度至少約為85％且最優(yōu)選純度至少約為99％。
重組DNA分子使用重組DNA技術(shù)彼此連接的DNA分子的組合。
調(diào)節(jié)元件在控制核苷酸序列表達(dá)中所涉及的序列。調(diào)節(jié)元件包括可操縱地與感興趣的核苷酸序列和終止信號連接的啟動(dòng)子。它們一般還包括正確翻譯所述核苷酸序列所需的序列。
選擇性標(biāo)記基因其在植物細(xì)胞中的表達(dá)使細(xì)胞產(chǎn)生選擇優(yōu)勢的基因。用選擇性標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞所具有的選擇優(yōu)勢可能是由于與未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長相比它們在有諸如抗生素或除草劑這樣的負(fù)選擇劑存在情況下的生長能力所造成的。與未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)化細(xì)胞所具有的選擇優(yōu)勢也可能是由于它們將添加的化合物用作營養(yǎng)物、生長因子或能源的增強(qiáng)的或新的能力所造成的。選擇性標(biāo)記基因還指其在植物細(xì)胞中的表達(dá)使細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)的和正的選擇優(yōu)勢的基因或基因組合。
顯著提高大于測定技術(shù)中固有的誤差限度的酶活性的提高，優(yōu)選在有抑制劑存在的情況下使野生型酶的活性提高約2倍或2倍以上、更優(yōu)選提高約5倍或5倍以上且最優(yōu)選提高約10倍或10倍以上。
就兩種或多種核酸或蛋白質(zhì)序列而言所用的術(shù)語“相同”或“同一性”百分比指的是當(dāng)進(jìn)行最大相應(yīng)性比較和序列對比時(shí)相同或具有規(guī)定的氨基酸殘基或核苷酸百分比的兩種或多種序列或亞序列，正如使用下列序列對比算法或通過目測檢查所測得。
基本上相同就兩種核酸或蛋白質(zhì)序列而言所用的術(shù)語“基本上相同”指的是當(dāng)進(jìn)行最大相應(yīng)性比較和序列對比時(shí)具有至少60％、優(yōu)選80％、更優(yōu)選90-95％且最優(yōu)選99％的核苷酸或氨基酸殘基同一性的兩種或多種序列或亞序列，正如使用下列序列對比算法或通過目測檢查所測得的。在至少約50個(gè)殘基長的序列區(qū)內(nèi)、更優(yōu)選在約100個(gè)殘基區(qū)內(nèi)存在基本的同一性且最優(yōu)選在約150個(gè)殘基內(nèi)序列基本上相同。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，序列在全長編碼區(qū)內(nèi)基本上相同。此外，基本上相同的核酸或蛋白質(zhì)序列具有基本上相同的功能。
為了進(jìn)行序列比較，一般一個(gè)序列起參比序列的作用，將測試序列與其進(jìn)行比較。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，將測試和參比序列輸入計(jì)算機(jī)，如果需要指定亞序列等同物并指定序列算法程序參數(shù)。然后序列比較算法以指定的程序參數(shù)為基準(zhǔn)計(jì)算出測試序列與參比序列相比較的序列同一性百分比。
例如，可以通過下列方法進(jìn)行用于比較的序列最佳排列Smith&Waterman的局部同源性算法《數(shù)學(xué)應(yīng)用發(fā)展》(Adv.Appl.Math.)2482(1981)；Needleman&Wunsch的同源性序列對比算法《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.)443(1970)；Pearson&Lipman的相似性方法檢索《美國國家科學(xué)院院報(bào)》(Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA)852444(1988)；這些算法的計(jì)算機(jī)化應(yīng)用(Wisconsin GeneticsSofware Package中的GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA和TFASTA，GeneticsComputer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)；或目測檢查(通常參見Ausubel等，參見下文)。
適合于確定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一個(gè)實(shí)例是BLAST算法，它描述在Altschul等的《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.)215403-410(1990)中。公眾可以通過國家生物技術(shù)信息中心 (National Center for Biotechnology Information)(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行BLAST分析的軟件。該算法包括首先通過確定查詢序列中長度W的短詞來確定主要?jiǎng)澗€的序列對(HSPs)，當(dāng)用數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的詞進(jìn)行序列對比時(shí)，它們與某些正值閾值得分T相適應(yīng)或滿足它們。T指的是鄰近詞得分閾值(Altschul等，1990)。命中這些起始的鄰近詞為啟動(dòng)檢索程序打下基礎(chǔ)以便找到含有它們的更長的HSPs。然后沿各序列的兩個(gè)方向擴(kuò)展命中的詞，直到累積的序列對比得分得到增加為止。就核苷酸序列而言，使用參數(shù)M(配對殘基對的有利結(jié)果得分；總＞0)和N(錯(cuò)配殘基的不利結(jié)果得分；總＜0)來計(jì)算累積得分。就氨基酸序列而言，將得分矩陣用于計(jì)算累積得分。當(dāng)累積序列對比得分從其獲得的最大值下降到X量時(shí)停止在各方向上擴(kuò)展命中詞，累積得分達(dá)到0或0以下，這是因?yàn)槔鄯e了一種或多種負(fù)得分的殘基序列對比或達(dá)到各序列的末端所導(dǎo)致的。BLAST算法的參數(shù)W、T和X確定了序列對比的敏感性和速度。BLATN程序(就核苷酸序列而言)使用詞長度(W)為11、期望值(E)為10、截止值為100、M＝5、N＝4和兩鏈比較作為默認(rèn)值。就氨基酸序列而言，BLASTP程序使用詞長度(W)為3、期望值(E)為10和BLOSUM62得分矩陣作為默認(rèn)值(參見Henikoff&Henikoff《美國國家科學(xué)院院報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)8910915(1989)。
除計(jì)算序列同一性百分比外，BLAST算法還進(jìn)行了兩種序列之間相似性的統(tǒng)計(jì)分析(參見，例如Karlin&Altschul《美國國家科學(xué)院院報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)905873-5787(1993))。由BLAST算法提供的相似性的一個(gè)測定值是最小的和數(shù)概率(P(N))，它產(chǎn)生了一個(gè)概率的示數(shù)，通過該示數(shù)也許會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間的配對。例如，如果在測試核酸序列與參比核酸序列進(jìn)行比較過程中的最小和數(shù)概率約小于0.1、更優(yōu)選約小于0.01且最優(yōu)選約小于0.001，那么認(rèn)為測試核酸序列與參比序列相似。
兩個(gè)核酸序列基本上相同的另一種表示方式是兩個(gè)分子在嚴(yán)格條件下彼此雜交。術(shù)語“特異性地與…雜交”指的是分子僅與特定的核苷酸序列在嚴(yán)格條件下的結(jié)合、雙重組合或雜交，此時(shí)所述的序列存在于復(fù)合的混合物(例如總細(xì)胞)DNA或RNA中?！盎旧辖Y(jié)合”指的是探針核酸與靶核酸之間的互補(bǔ)雜交且包括可以通過降低雜交培養(yǎng)基的嚴(yán)格性而容納的最小錯(cuò)配以便實(shí)現(xiàn)對靶核酸序列進(jìn)行所需檢測。
就諸如DNA雜交和Northern雜交這樣的核酸雜交實(shí)驗(yàn)而言所用的“嚴(yán)格雜交條件”和“嚴(yán)格雜交洗滌條件”具有序列依賴性且在不同的環(huán)境參數(shù)下是不同的。較長的序列特別在較高的溫度下雜交。關(guān)于核酸雜交的廣泛指導(dǎo)原則可以在下列文獻(xiàn)中找到Tijssen(1993)《生化實(shí)驗(yàn)室技術(shù)和分子生物學(xué)-使用核酸探針的雜交》(LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridizationwith Nucleic Acid Probes)第1部分第2章“雜交原理和核酸探針測定策略的綜述”(Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleic acid probe assays)，Elsevier，New York。一般來說，就在規(guī)定的離子強(qiáng)度和pH下的特定序列而言，將高度嚴(yán)格雜交和洗滌條件選擇為低于熱熔點(diǎn)(Tm)約5℃。一般來說，在“嚴(yán)格條件”下探針與其靶亞序列雜交而不與其它序列雜交。
Tm是50％的靶序列與完好配對探針雜交的溫度(在指定的離子強(qiáng)度和pH下)。將非常嚴(yán)格的條件選擇為等于特定探針的Tm。用于在DNA或RNA印跡中的濾膜上雜交具有100個(gè)以上互補(bǔ)殘基的互補(bǔ)核酸的嚴(yán)格雜交條件的一個(gè)實(shí)例是在42℃下50％甲酰胺與1mg肝素雜交，其中將雜交過程進(jìn)行過夜。高度嚴(yán)格的洗滌條件的一個(gè)實(shí)例是在72℃下用0.15M NaCl洗滌約15分鐘。一個(gè)洗滌條件的一個(gè)實(shí)例是在65℃下用0.2×SSC洗滌15分鐘(參見下文Sambrook對SSC緩沖液的描述)。通常在高度嚴(yán)格性洗滌前是低度嚴(yán)格性洗滌以便除去背景探針信號。就雙鏈體、例如100個(gè)以上核苷酸而言，中度嚴(yán)格性洗滌的一個(gè)實(shí)例是在45℃下用1×SSC洗滌15分鐘。就雙鏈體、例如100個(gè)以上核苷酸而言，低度嚴(yán)格性洗滌的一個(gè)實(shí)例是在40℃下用4-6×SSC洗滌15分鐘。就短探針(例如約10-50個(gè)核苷酸)而言，嚴(yán)格條件一般包括在pH 7.0-8.3下鹽濃度低于約1.0M Na離子、一般約為0.01-1.0M Na離子濃度(或其它鹽)且溫度一般至少約為30℃。還可以通過添加諸如甲酰胺這樣的去穩(wěn)定劑來實(shí)現(xiàn)嚴(yán)格條件。一般來說，在特定雜交測定試驗(yàn)中對不相關(guān)探針?biāo)^察到的2倍(或2倍以上)的信噪比表明了檢測特異性雜交。如果核酸編碼的蛋白質(zhì)基本上相同，那么在嚴(yán)格條件下無法彼此雜交的核酸仍基本上相同。例如，這種情況在使用遺傳密碼所允許的最大密碼簡并產(chǎn)生核酸拷貝時(shí)發(fā)生。
下面是可以用于克隆基本上與本發(fā)明參比核苷酸序列相同的同源核苷酸序列的雜交/洗滌條件組的實(shí)例參比核苷酸序列與參比核苷酸序列優(yōu)選在50℃下的7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中雜交、其中在50℃下用2×SSC洗滌；更理想的是在50℃下的7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中雜交、其中在50℃下用1×SSC、0.1％SDS洗滌；更理想的是在50℃下的7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中雜交、其中在50℃下用0.5×SSC、0.1％SDS洗滌；優(yōu)選在50℃下的7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中雜交、其中在50℃下用0.1×SSC、0.1％SDS洗滌；更優(yōu)選在50℃下的7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中雜交、其中在65℃下用0.1×SSC、0.1％SDS洗滌。
兩種核酸序列或蛋白質(zhì)基本上相同的進(jìn)一步證明方式是由第一種核酸編碼的蛋白質(zhì)與由第二種核酸編碼的蛋白質(zhì)發(fā)生交叉免疫反應(yīng)或特異性地與之結(jié)合。因此，一種蛋白質(zhì)通常與第二種蛋白質(zhì)基本上相同，例如，其中兩種蛋白質(zhì)的區(qū)別僅在于保守取代。
術(shù)語“特異性地(或選擇性地)與抗體結(jié)合”或“特異性地(或選擇性地)與…發(fā)生免疫反應(yīng)”在涉及蛋白質(zhì)或肽時(shí)指的是結(jié)合反應(yīng)是在有蛋白質(zhì)和其它生物制品的異源群體存在的情況下蛋白質(zhì)存在的決定因素。因此，在指定的免疫測定條件下，特異性抗體結(jié)合特定的蛋白質(zhì)而不以顯著量結(jié)合存在于樣品中的其它蛋白質(zhì)。在這類條件下與抗體的特異性結(jié)合可能需要根據(jù)其對特定蛋白質(zhì)的特異性來選擇的抗體。例如，可以選擇針對具有由本發(fā)明任何核酸序列編碼的氨基酸序列的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的抗體以便獲得與該蛋白質(zhì)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)而不與除多態(tài)變體外的其它蛋白質(zhì)發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體?？梢詫⒍喾N免疫測定方式用于選擇與特定蛋白質(zhì)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體。例如，通常將固相ELISA免疫測定法、蛋白質(zhì)印跡或免疫組織化學(xué)法用于選擇與蛋白質(zhì)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的單克隆抗體。參見Harlow和Lane((1988)《抗體-實(shí)驗(yàn)室手冊》(Antibodies，A LaboratoryManual)，Cold Spring Harbor Publications，New York“Harlow和Lane”)對可以用于測定特異性免疫反應(yīng)性的免疫測定方式和條件的描述。一般來說，特異性或選擇性反應(yīng)將是背景信號或噪聲的至少2倍且更常見的是背景的10-100倍以上。
特定核酸序列的“保守修飾的變化形式”指的是編碼相同或基本上相同的氨基酸序列或其中核酸序列不編碼氨基酸序列的那些核酸序列。由于遺傳密碼的簡并性，所以大量功能相同的核酸編碼任何給定的多肽。例如，密碼子CGT、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG均編碼氨基酸精氨酸。因此，在用密碼子表示的精氨酸的每一位上，可以將密碼子改變成任何相應(yīng)的所述密碼子而不會(huì)改變所編碼的蛋白質(zhì)。這類核酸變化形式是“沉默變化形式”，它們是“保守修飾變化形式”的一個(gè)種類。除非另有說明，編碼蛋白質(zhì)的本文所述的每個(gè)核酸序列也描述了每一種可能的沉默變化形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為可以修飾核酸中的各密碼子(ATG除外，它通常僅是甲硫氨酸的密碼子)以便通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)得到功能相同的分子。因此，編碼蛋白質(zhì)的核酸的各“沉默變化形式”在各所述序列中是隱含的。
此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到在所編碼的序列中改變、添加或缺失單個(gè)氨基酸或較小百分比的氨基酸(一般低于5％、更常見的是低于1％)的各個(gè)取代、缺失或添加是“保守修飾的變化形式”，其中這種改變導(dǎo)致氨基酸被化學(xué)上相似的氨基酸所取代。提供功能相似氨基酸的保守取代表在本領(lǐng)域中是眾所周知的。下列5組中各包含屬于相互保守取代的氨基酸脂族甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)；芳香族苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫的甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；堿性的精氨酸(R)、賴氨酸(K)、組氨酸(H)；酸性的天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。另外參見Creighton(1984)《蛋白質(zhì)》(Proteins)，W.H.Freeman和Company。此外，在所編碼的序列中改變、添加或缺失單個(gè)氨基酸或較小百分比的氨基酸的各個(gè)取代、缺失或添加也是“保守修飾的變化形式”。
“亞序列”指的是分別包括核酸或氨基酸的較長序列(例如蛋白質(zhì))的一部分的核酸或氨基酸序列。
當(dāng)將其它核苷酸(或其它類似分子)引入核酸時(shí)核酸是“延長的”。最常見的是使用聚合酶(例如DNA聚合酶)、例如在核酸3’末端添加序列的聚合酶進(jìn)行該過程。
當(dāng)將來自兩種核酸中每一種的序列在子代核酸中組合時(shí)兩種核酸被“重組”。當(dāng)這兩種核酸是用于重組的底物時(shí)可“直接”重組兩條序列。當(dāng)使用諸如交換寡核苷酸這樣的中間體重組所述序列時(shí)可“間接重組”兩條序列。就間接重組而言，僅僅一條序列是用于重組的真正底物且在某些情況下兩條序列都不是用于重組的底物。
例如配體和受體這樣的兩種分子之間的“特異性結(jié)合親和力”指的是在分子混合物中一種分子對另一種分子的優(yōu)先結(jié)合。如果結(jié)合親和力約為1×104M-1-約1×106M-1或1×106M-1以上，那么可以將該分子的結(jié)合看作是特異性的。
轉(zhuǎn)化一種用于將異源DNA引入宿主細(xì)胞或生物體的過程。
“轉(zhuǎn)化的”、“轉(zhuǎn)基因的”和“重組的”指的是諸如細(xì)菌或植物這樣已經(jīng)引入了異源核酸分子的宿主生物體。核酸分子可以被穩(wěn)定地整合入宿主的基因組或也可以作為染色體外分子存在。這類染色體外分子可以是自體復(fù)制的。認(rèn)為轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或植物不僅包括轉(zhuǎn)化過程的終產(chǎn)物而且包括其轉(zhuǎn)基因子代?！胺寝D(zhuǎn)化的”、“非轉(zhuǎn)基因的”或“非重組的”宿主指的是例如細(xì)菌或植物這樣不含異源核酸分子的野生型生物體。
本發(fā)明通過提供幾種來自另外的植物物種的鼠耳芥屬NIM1基因同源物而滿足了上述需求。特別地，本發(fā)明涉及NIM1基因的煙草(Nicotiana tabacum)、番茄(Lycopericon esculentum)、歐洲油菜(Brassica napus)、鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)、甜菜(Beta vulgaris)、向日葵(Helianthus annuus)和馬鈴薯(Solanumtuberosum)的同源物的分離，這些同源物編碼認(rèn)為與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)有關(guān)的蛋白質(zhì)，所述的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)對可導(dǎo)致植物中系統(tǒng)獲得性抗性的生物和化學(xué)誘導(dǎo)物敏感。
因此，本發(fā)明涉及一種分離的核酸分子，它包括編碼SEQ ID NO2、4、6、8、16、18、20、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、62、64、66、68、70、72或74的核苷酸序列。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種包括SEQ ID NO1、3、5、7、15、17、19、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、61、63、65、67、69、71或73的分離的核酸分子。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種包括核苷酸序列的分離的核酸分子，所述的核苷酸序列在序列中包括與SEQ ID NO1、3、5、7、15、17、19、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、61、63、65、67、69、71或73的至少20、25、30、35、40、45或50個(gè)(優(yōu)選20個(gè))連續(xù)堿基對部分相同的至少20、25、30、35、40、45或50個(gè)(優(yōu)選20個(gè))連續(xù)的堿基對部分。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種包括核苷酸序列的分離的核酸分子，可以使用應(yīng)用表示為SEQ ID NO9和10、SEQ ID NO21和24、SEQ ID NO22和24、SEQ ID NO25和28、SEQ ID NO26和28或SEQ ID NO59和60的引物對的聚合酶鏈反應(yīng)從番茄DNA文庫擴(kuò)增所述的核苷酸序列；在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種包括核苷酸序列的分離的核酸分子，可以使用應(yīng)用表示為SEQ ID NO22和24或SEQ ID NO26和28的引物對的聚合酶鏈反應(yīng)從甜菜DNA文庫擴(kuò)增所述的核苷酸序列；在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種包括核苷酸序列的分離的核酸分子，可以使用應(yīng)用表示為SEQ ID NO26和28的引物對的聚合酶鏈反應(yīng)從向日葵DNA文庫擴(kuò)增所述的核苷酸序列；在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種包括核苷酸序列的分離的核酸分子，可以使用應(yīng)用表示為SEQ ID NO21和24、SEQ ID NO21和23、SEQ ID NO22和24、SEQ ID NO25和28或SEQ ID NO26和28的引物對的聚合酶鏈反應(yīng)從馬鈴薯DNA文庫擴(kuò)增所述的核苷酸序列；在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種包括核苷酸序列的分離的核酸分子，可以使用應(yīng)用表示為SEQ ID NO9和10或SEQ ID NO26和28的引物對的聚合酶鏈反應(yīng)從歐洲油菜DNA文庫擴(kuò)增所述的核苷酸序列；在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種包括核苷酸序列的分離的核酸分子，可以使用應(yīng)用表示為SEQ ID NO13和14、SEQ ID NO21和24或SEQ ID NO22和24的引物對的聚合酶鏈反應(yīng)從鼠耳芥DNA文庫擴(kuò)增所述的核苷酸序列；在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種包括核苷酸序列的分離的核酸分子，可以使用應(yīng)用表示為SEQ ID NO9和10、SEQ ID NO11和12、SEQ ID NO21和24、SEQ ID NO22和24、SEQ ID NO25和28或SEQ ID NO26和28的引物對的聚合酶鏈反應(yīng)從煙草DNA文庫擴(kuò)增所述的核苷酸序列；或在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種包括核苷酸序列的分離的核酸分子，可以使用應(yīng)用引物對的聚合酶鏈反應(yīng)從植物DNA文庫擴(kuò)增所述的核苷酸序列，所述的引物對包括SEQ ID NO1、3、5、7、15、17、19、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、61、63、65、67、69、71或73編碼序列(CDS)的前20個(gè)核苷酸和最后20個(gè)核苷酸的反向補(bǔ)體。
本發(fā)明還包括一種嵌合基因，它包括在植物中具有活性的與本發(fā)明NIM1同源物編碼序列可操作地連接的啟動(dòng)子；本發(fā)明還包括含有這類嵌合基因的重組載體，其中所述的載體能夠穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化入宿主且可以用這類載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化宿主。優(yōu)選所述的宿主是諸如下列農(nóng)學(xué)上重要的農(nóng)作物之一的植物水稻、小麥、大麥、黑麥、玉米、馬鈴薯、canola、向日葵、胡蘿卜、甘薯、甜菜、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、甘藍(lán)、花椰菜、嫩莖花椰菜、蕪菁、蘿卜、菠菜、蘆筍、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、南瓜、南瓜、黃瓜、蘋果、梨、溫柏、甜瓜、洋李、櫻桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、鳳梨、鱷梨、番瓜、芒果、香蕉、大豆、煙草、番茄、高粱和糖甘蔗。本發(fā)明還包括來自本發(fā)明植物的種子。
此外，本發(fā)明涉及一種增加植物中SAR基因表達(dá)的方法，該方法通過在所述植物中表達(dá)自身含有在植物中具有活性的與本發(fā)明NIM1同源物編碼序列可操作地連接的啟動(dòng)子的嵌合基因來進(jìn)行，其中在轉(zhuǎn)化的植物中以高于野生型植物的水平表達(dá)所編碼的蛋白質(zhì)。
此外，本發(fā)明涉及一種提高植物中病害抗性的方法，該方法通過在所述植物中表達(dá)自身含有在植物中具有活性的與本發(fā)明NIM1同源物編碼序列可操作地連接的啟動(dòng)子的嵌合基因來進(jìn)行，其中在轉(zhuǎn)化的植物中以高于野生型植物的水平表達(dá)所編碼的蛋白質(zhì)。
此外，本發(fā)明涉及一種選自SEQ ID NO9-14、21-28、59和60組成的組的PCR引物。
本發(fā)明還包括一種用于分離與可導(dǎo)致植物中系統(tǒng)獲得性抗性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)相關(guān)的NIM1同源物的方法，該方法包括使用應(yīng)用引物對的聚合酶鏈反應(yīng)從植物DNA文庫擴(kuò)增DNA分子，其中所述的引物對相當(dāng)于SEQ ID NO1、3、5、7、15、17、19、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、61、63、65、67、69、71或73編碼序列(CDS)的前20個(gè)核苷酸和最后20個(gè)核苷酸的反向補(bǔ)體；或所述的引物對表示為SEQ ID NO9和10、SEQ ID NO11和12、SEQID NO13和14、SEQ ID NO21和24、SEQ ID NO22和24、SEQ ID NO21和23、SEQ ID NO25和28、SEQ ID NO26和28或SEQ ID NO59和60。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的植物DNA文庫是煙草(Nicotianatabacum)、番茄(Lycopericon esculentum)、歐洲油菜(Brassicanapus)、鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)、甜菜(Beta vulgaris)、向日葵(Helianthus annuus)和馬鈴薯(Solanum tuberosum)的DNA文庫。
有關(guān)本文所述的幾種NIM1同源物的Northern數(shù)據(jù)表示了組成型表達(dá)或BTH-誘導(dǎo)性。據(jù)推定本文所述的NIM1基因同源物編碼對生物和化學(xué)誘導(dǎo)物敏感的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)中所涉及的蛋白質(zhì)，所述的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)可在植物中產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性。本發(fā)明還涉及植物中這類NIM1同源物的轉(zhuǎn)基因表達(dá)以便增加SAR基因表達(dá)并增強(qiáng)病害抗性。
可以使用下面的實(shí)施例中所述的技術(shù)或通過使用作為構(gòu)建PCR引物基礎(chǔ)的序列表中所示的序列的PCR來分離本發(fā)明的DNA序列。例如，可以將具有SEQ ID NO7的大約前和最后20-25個(gè)連續(xù)核苷酸的序列的寡核苷酸用作PCR引物以便從來自植物來源(鼠耳芥)的cDNA文庫直接擴(kuò)增cDNA序列(SEQ ID NO7)。同樣可以使用作為PCR引物基礎(chǔ)的序列表中所示的DNA序列末端、通過PCR從相應(yīng)植物的cDNA或基因組DNA文庫中擴(kuò)增本發(fā)明的其它DNA序列。
據(jù)推定在植物中轉(zhuǎn)基因表達(dá)本發(fā)明的NIM1同源物可使一系列廣泛的植物病原體產(chǎn)生免疫性，所述的植物病原體包括但不限于病毒或類病毒，例如煙草或黃瓜花葉病毒、環(huán)斑病毒或壞死病毒、天竺葵葉卷曲病毒、紅色三葉草環(huán)斑病毒、番茄叢矮病毒等病毒；真菌，例如卵菌諸如寄生疫霉和煙草霜霉；細(xì)菌，例如丁香假單胞菌和煙草野火病假單胞菌；昆蟲、諸如蚜蟲，例如桃短尾蚜；和鱗翹目，例如Heliothus的種類；以及線蟲，例如南方根結(jié)線蟲。本發(fā)明的載體和方法對大量玉米病害生物體來說是有用的、包括但不限于霜霉諸如；大孢指疫霉、Sclerophthora rayissiae、禾生指梗霉、Pernosclerospora sorghi、Peronosclerospora philippinensis、Peronosclerospora sacchari和Peronosclerospora maydis；銹菌諸如高粱柄銹菌、多堆柄銹菌和Physopella zeae；其它真菌諸如Cercospora zeae-maydis、禾生刺盤孢、串珠鐮孢、玉蜀黍赤霉、Exerohilum turcicum、玉蜀黍球梗孢、禾白粉菌、殼針孢屬和Bipolaris maydis；和細(xì)菌諸如斯獲氏歐文氏桿菌。
本發(fā)明的方法可以用于將病害抗性賦予各種植物，包括裸子植物、單子葉植物和雙子葉植物。盡管可以使屬于這些寬類別的任何植物產(chǎn)生病害抗性，但是它特別適用于農(nóng)學(xué)上重要的農(nóng)作物植物，諸如水稻、小麥、大麥、黑麥、油菜、玉米、馬鈴薯、胡蘿卜、甘薯、甜菜、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、甘藍(lán)、花椰菜、嫩莖花椰菜、蕪菁、蘿卜、菠菜、蘆筍、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜、南瓜、綠皮密生西葫蘆、黃瓜、蘋果、梨、溫柏、甜瓜、杧果、李子、櫻桃、桃、蜜桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、鳳梨、鱷梨、番瓜、杧果、香蕉、大豆、煙草、番茄、高粱和甘蔗。
可以將本發(fā)明的NIM1同源物編碼序列插入為植物設(shè)計(jì)的表達(dá)彈夾以便使用標(biāo)準(zhǔn)遺傳工程技術(shù)構(gòu)建本發(fā)明的嵌合基因。對適合于實(shí)現(xiàn)所選植物宿主中所需模式和水平的表達(dá)的諸如啟動(dòng)子、信號序列、5’和3’未翻譯序列和增強(qiáng)子這樣的特異性調(diào)節(jié)序列的選擇屬于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的水平范圍內(nèi)?？梢詫⒑性诤线m讀框中連接的各個(gè)元件的所得分子插入能夠轉(zhuǎn)化至宿主植物細(xì)胞的載體中。
能夠在植物或植物細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子的實(shí)例(即那些能夠啟動(dòng)相關(guān)編碼序列表達(dá)的啟動(dòng)子、諸如那些編碼植物細(xì)胞中NIM1同源物的啟動(dòng)子)包括鼠耳芥屬和玉米遍在蛋白質(zhì)啟動(dòng)子；花椰菜花葉病毒(CaMV)19S或35S啟動(dòng)子和CaMV雙啟動(dòng)子；水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子；來自煙草、鼠耳芥屬或玉米的PR-1啟動(dòng)子；胭脂氨酸合酶啟動(dòng)子；核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞單位(ssuRUBISCO)啟動(dòng)子等。特別優(yōu)選的是鼠耳芥屬遍在蛋白質(zhì)啟動(dòng)子?？梢孕揎梿?dòng)子自身以便控制啟動(dòng)子強(qiáng)度，從而按照本領(lǐng)域已知的方法提高相關(guān)編碼序列的表達(dá)。優(yōu)選用于本發(fā)明的啟動(dòng)子是那些產(chǎn)生高水平組成型表達(dá)的啟動(dòng)子。
可以使信號或轉(zhuǎn)運(yùn)肽類與本發(fā)明的嵌合DNA構(gòu)建體中的NIM1同源物編碼序列融合以便使所表達(dá)的蛋白質(zhì)定向轉(zhuǎn)運(yùn)至所需的作用部位。信號肽類的實(shí)例包括那些與植物發(fā)病機(jī)理相關(guān)蛋白質(zhì)天然連接的信號肽，例如PR-1、PR-2等。參見，例如Payne等，1988。轉(zhuǎn)運(yùn)肽類的實(shí)例包括諸如那些在Von Heijne等(1991)、Mazur等(1987)和Vorst等(1988)中所述的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽類；以及諸如那些在Boutry等(1987)中所述的線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)肽類。另外還包括使所編碼的蛋白質(zhì)集中于諸如液泡這樣的各種細(xì)胞區(qū)室中的序列。例如，參見Neuhaus等(1991)和Chrispeels(1991)。
本發(fā)明的嵌合DNA構(gòu)建體可以含有本發(fā)明的多拷貝的啟動(dòng)子或多拷貝的NIM1同源物編碼序列。此外，該構(gòu)建體可以包括標(biāo)記物的編碼序列和諸如信號或轉(zhuǎn)運(yùn)肽類這樣的其它肽類的編碼序列，它們各自在帶有DNA分子中的其它功能元件的合適的讀框中。這類構(gòu)建體的制備方法屬于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的水平范圍內(nèi)。
有用的標(biāo)記物包括提供除草劑、抗生素或藥物抗性的肽類，諸如例如耐原卟啉原氧化酶抑制劑、潮霉素、卡那霉素、G418、慶大霉素、潔霉素、氨甲蝶呤、草甘膦、膦絲菌素等。可以將這些標(biāo)記物用于從來轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中篩選用本發(fā)明嵌合DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。其它有用的標(biāo)記物是可以通過例如顏色反應(yīng)這樣的可肉眼觀察的反應(yīng)方便檢測的肽酶，例如熒光素酶、β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。
可以用多種已知方法將諸如本文所述的那些用于植物表達(dá)的嵌合基因引入植物細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解對方法的選擇可能取決于為轉(zhuǎn)化而靶向的植物(即單子葉植物或雙子葉植物)和/或細(xì)胞器(即細(xì)胞核、葉綠體、線粒體)的類型。轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的適宜方法包括微量注射(Crossway等，1986)、電穿孔(Riggs等，1986)、農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Hinchee等，1988；Ishida，1996)、定向基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski等，1984；Hayashimoto等，1990)和使用獲自Agracetus，Inc.，Madison，Wisconsin and Dupont，Inc.，Wilmington，Delaware的裝置進(jìn)行的沖擊粒子加速(參見，例如美國專利4,945,050和McCabe等，1988)。另外參見Weissinger等(1988)；Sanford等(1987)(洋蔥)；Christou等(1988)(大豆)；McCabe等(1988)(大豆)；Datta等(1990)(水稻)；Klein等(1988)(玉米)；Klein等(1988)(玉米)；Klein等(1988)(玉米)；Fromm等(1990)；和Gordon-Kamm等(1990)(玉米)；Svab等(1990)(煙草葉綠體)；Gordon-Kamm等(1993)(玉米)；Shimamoto等(1989)(水稻)；Christou等(1991)(水稻)；Datta等(1990)(水稻)；歐洲專利申請EP 0 332581(鴨茅屬和其它Pooideae)；Vasil(1993)(小麥)；Weeks等(1993)(小麥)；Wan等(1994)(大麥)；Jahne等(1994)(大麥)；Umbeck等(1987)(棉花)；Casas等(1993)(高粱)；Somers等(1992)(燕麥)；Torbert等(1995)(燕麥)；Weeks等(1993)(小麥)；WO 94/13822(小麥)；和Nehra等(1994)(小麥)。在Koziel等(1993)、Hill等(1995)和Koziel等(1996)中可以找到通過微粒轟擊將重組DNA分子引入玉米的一組特別優(yōu)選的實(shí)施方案。另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是公開在EP 0 292 435中的玉米的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法。
一旦將包括NIM1同源物編碼序列的嵌合基因轉(zhuǎn)化入特定的植物物種，則可以使用傳統(tǒng)的育種技術(shù)使之在該物種中繁殖或?qū)⑵湟迫胂嗤锓N的其它的變種、特別包括商品變種中。本發(fā)明特別優(yōu)選的植物包括上面所列的農(nóng)學(xué)上重要的農(nóng)作物。通過有性繁殖來傳遞上述基因工程的轉(zhuǎn)基因種子和植物的遺傳特性且這些特性由此可以在子代植物中得到維持和傳播。
I.鼠耳芥屬NIMI基因同源物的分離實(shí)施例1來自煙草的NIM1同源物的分離將來自從煙草cDNA文庫的噬菌體切下的團(tuán)塊的質(zhì)粒DNA用作使用下列引物對進(jìn)行的PCR的模板5’-AGATTATTGTCAAGTCTAATG-3’(SEQ IDNO9)+5’-TTCCATGTACCTTTGCTTC-3’(SEQ ID NO10)和5’-GCGGATCCATGGATAATAGTAGG-3’(SEQ ID NO11)+5’-GCGGATCCTATTTCCTAAAAGGG-3’(SEQ ID NO12)。循環(huán)條件優(yōu)選94℃下1分鐘、40℃下1分鐘和72℃下1.5分鐘，并且該反應(yīng)優(yōu)選進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。將瓊脂糖凝膠上的PCR產(chǎn)物放出、切下并克隆入pCRII-TOPO(Invitrogen)。
這種煙草NIM1同源物的全長cDNA序列表示為SEQ ID NO1，并且由該cDNA序列編碼的蛋白質(zhì)表示為SEQ ID NO2。已經(jīng)在1998年8月17日將包含SEQ IDNO1的煙草NIM1同源物在NRRhL(AgriculturalResearch Service，Patent Culture Collection，Northern RegionalResearch Center，1815 North University Street，Peoria，lllinois61604，U.S.A.)以pNOV1206保藏，并給予其保藏號為NRRL B-30051。
實(shí)施例2來自番茄的NIM1同源物的分離使用來自Stratagene的方案從番茄的λZAPII cDNA文庫中切下噬菌粒。將噬菌粒(質(zhì)粒)大量轉(zhuǎn)化入各含有約80,000個(gè)克隆的10個(gè)庫內(nèi)的大腸桿菌XL1-Blue中，并從這些庫中提取DNA。通過使用下列引物進(jìn)行的PCR篩選所述庫中存在的NIM1同源物5’-AGATTATTGTCAAGTCTAATG-3’(SEQ ID NO9)和5’-TTCCATGTACCTTTGCTTC-3’(SEQ ID NO10)。
通過克隆PCR-擴(kuò)增的DNA片段并測序證實(shí)了從所述庫中擴(kuò)增的序列含有NIM1同源物。連續(xù)制備較小的庫并通過使用上述相同引物的PCR來篩選存在的NIM1同源物，直到獲得含有該同源物的單克隆為止。在cDNA克隆含有缺少5’端的部分基因的情況中，采用5’RACE(cDNA末端的快速擴(kuò)增)獲得所述基因的全長序列。
這種番茄NIM1同源物的全長cDNA序列表示為SEQ ID NO3，并且由該cDNA序列編碼的蛋白質(zhì)表示為SEQ ID NO4。已經(jīng)在1998年8月17日將包含SEQ IDNO3的番茄NIM1同源物在NRRL(AgriculturalResearch Service，Patent Culture Collection，Northern RegionalResearch Center，1815 North University Street，Peoria，lllinois61604，U.S.A.)以pNOV1204保藏，并給予其保藏號為NRRL B-30050。實(shí)施例3來自歐洲油菜的NIM1同源物的分離使用來自Stratagene的方案從歐洲油菜的λZAPII cDNA文庫中切下噬菌粒。將噬菌粒(質(zhì)粒)大量轉(zhuǎn)化入各含有約80,000個(gè)克隆的10個(gè)庫內(nèi)的大腸桿菌XL1-Blue中，并從這些庫中提取DNA。通過PCR篩選所述庫中通過使用序列引物進(jìn)行的PCR而存在的NIM1同源物5’-AGATTATTGTCAAGTCTAATG-3’(SEQ ID NO9)和5’-TTCCATGTACCTTTGCTTC-3’(SEQ ID NO10)。
通過克隆PCR-擴(kuò)增的DNA片段并測序證實(shí)了從所述庫中擴(kuò)增的序列含有NIM1同源物。連續(xù)制備較小的庫并通過使用上述相同引物的PCR來篩選存在的NIM1同源物，直到獲得含有該同源物的單克隆為止。在cDNA克隆含有缺少5’端的部分基因的情況中，采用5’RACE(cDNA末端的快速擴(kuò)增)獲得所述基因的全長序列。
這種歐洲油菜NIM1同源物的部分cDNA序列表示為SEQ ID NO5，并且由該cDNA序列編碼的蛋白質(zhì)表示為SEQ ID NO6。已經(jīng)在1998年8月17日將包含SEQ IDNO5的歐洲油菜NIM1同源物在NRRL(Agricultural Research Service，Patent Culture Collection，Northern Regional Research Center，1815 North University Street，Peoria，lllinois 61604，U.S.A.)以pNOV1203保藏，并給予其保藏號為NRRL B-30049。
實(shí)施例4來自鼠耳芥的NIM1同源物的分離BLAST在查詢檢測GenBank條目B26306時(shí)使用鼠耳芥屬或番茄NIM1氨基酸序列檢索，B26306含有來自細(xì)菌人工染色體(BacterialArtifical Chromosome)(BAC)F18D8的鼠耳芥屬基因組序列。預(yù)測部分BAC序列編碼與NIM1具有顯著相似性(47％氨基酸同一性)的蛋白質(zhì)。將下列引物用于F18D8序列區(qū)5’-TCAAGGCCTTGGATTCAGATG-3’(SEQ ID NO13)和5’-ATTAACTGCGCTACGTCCGTC-3’(SEQ ID NO14)。
將所述引物用于與作為模板的來自以pFL61-為基礎(chǔ)的鼠耳芥屬cDNA文庫的DNA的PCR反應(yīng)。循環(huán)條件優(yōu)選94℃下30秒、53℃下30秒、72℃下30秒。該反應(yīng)優(yōu)選進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。檢測預(yù)測大小(290個(gè)堿基對)的PCR產(chǎn)物并通過使逐漸減小量的文庫經(jīng)過大腸桿菌的連續(xù)純化和重新鑒別通過PCR存在的克隆而從cDNA文庫中純化相應(yīng)于F18D8引物的cDNA克隆。最終獲得單一陽性克隆并測序。該克隆的序列證實(shí)了存在與NIM1具有顯著同源性的可讀框。
這種鼠耳芥NIM1同源物的全長cDNA序列表示為SEQ ID NO7，并且由該cDNA序列編碼的蛋白質(zhì)表示為SEQ ID NO8。已經(jīng)在1999年5月25日將包含SEQ IDNO7的鼠耳芥NIM1同源物在NRRL(Agricultural Research Service，Patent Culture Collection，Northern Regional Research Center，1815 North University Street，Peoria，lllinois 61604，U.S.A.)以AtNMLc5保藏，并給予其保藏號為NRRL B-30139。
實(shí)施例5簡并引物的設(shè)計(jì)除NIM1基因(Ryals等人，1997)和上述實(shí)施例4中所述的NIM-樣基因(AtNMLc5-SEQ ID NO7)外，鼠耳芥還含有三種其它NIM-樣(NML)基因組序列AtNMLc2(SEQ ID NO15)、AtNMLc4-1(SEQ IDNO17)和AtNMLc4-2(SEQ ID NO19)，其中c[#]代表特定NML基因位于其上的染色體號。使用GCG Seqweb多重序列對比程序(Pretty，Wisconsin Genetics Computer Group)，將來自鼠耳芥(Ryals等，1997)、煙草(實(shí)施例1-SEQ ID NO1)和番茄(實(shí)施例2-SEQ ID NO3)的NIM1序列以及來自鼠耳芥的NML序列(SEQ ID NO7、15、17和19)進(jìn)行序列對比。以這種序列對比為基礎(chǔ)，三個(gè)區(qū)顯示出充分的保守性以便設(shè)計(jì)對來自包括甜菜、向日葵、馬鈴薯和canola在內(nèi)的其它農(nóng)作物物種的NIM1同源物進(jìn)行PCR擴(kuò)增所用的簡并PCR引物。將根據(jù)這些保守區(qū)設(shè)計(jì)的引物列于下面的表1中。使用僅帶有來自鼠耳芥(Ryals等，1997)、煙草(實(shí)施例1-SEQ ID NO1)和番茄(實(shí)施例2-SEQID NO3)的NIM1序列的序列組來設(shè)計(jì)NIM1(A-D)引物。使用除來自鼠耳芥的四種NML序列(SEQ ID NO7、15、17和19)之外還帶有上述三種序列的序列組來設(shè)計(jì)NIM2(A-D)引物。優(yōu)選由GenosysBiotechnologies，Inc.(The Woodlands，Texas)來合成引物。根據(jù)寡核苷酸中單一位點(diǎn)上一種以上堿基的標(biāo)志將簡并位置列在表1中?！叭∠颉敝傅氖撬鲆锸欠穸ㄏ蛴赾DNA的3’端(下游)或5’端(上游)。表1簡并引物
實(shí)施例6對來自農(nóng)作物物種NIM-樣DNA片段的PCR擴(kuò)增使用基因組DNA或cDNA作為模板從鼠耳芥屬、番茄、煙草、甜菜、向日葵、馬鈴薯和canola擴(kuò)增NIM-樣DNA片段。將所用的引物組合以及預(yù)計(jì)的片段大小列在下面的表2中。表2引物組合和DNA片段大小
優(yōu)選在GeneAmp PCR System 9700(PE Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)中使用Ready-To-Go PCR Beads(Amersham，Piscataway，NJ)進(jìn)行簡并引物的PCR。在各反應(yīng)中使用20-40ng的基因組DNA或5-10ng的cDNA，其中各引物的終濃度為0.8μM。優(yōu)選的循環(huán)參數(shù)如下94℃1分鐘；3個(gè)循環(huán)的[94℃30秒；37℃30秒；72℃2分鐘]；35個(gè)循環(huán)的[94℃30秒；60℃30秒；72℃2分鐘]；72℃7分鐘；4℃保持。在2％瓊脂糖凝膠上分析反應(yīng)產(chǎn)物并切下適當(dāng)大小的DNA片段。例如使用Geneclean III試劑盒(BIO 101，Inc.，Carlsbad，CA)從瓊脂糖帶上分離DNA片段，例如使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)對其進(jìn)行克隆。例如，使用CONCERT快速質(zhì)粒小量制備系統(tǒng)(Life Technologies，Inc.，Rockyille，MD)分離質(zhì)粒并通過標(biāo)準(zhǔn)方案測序。
NIM-樣DNA片段獲自所嘗試的所有植物物種且在許多情況中分離了多種單一NIM-樣序列。表3和附圖
2具體描述了所分離的NIM-樣片段。表3NIM-樣PCR片段
以這些結(jié)果為基礎(chǔ)，上述簡并引物PCR可以從各種植物物種擴(kuò)增NIM-樣片段。特別地，使用來自所嘗試的所有物種的cDNA作為模板的NIM 2B/NIM 2D的引物組合是成功的。特別優(yōu)選使用Ready-To-Go PCRBeads來獲得產(chǎn)物。此外，對除鼠耳芥屬、番茄和甜菜外的所有樣品來說優(yōu)選使用cDNA作為模板，其中基因組DNA是充分的。
實(shí)施例7其它簡并引物以4種煙草片段(SEQ ID NO29、31、33和35)和用于測定番茄是否還含有不使用表1中所列簡并引物擴(kuò)增的相似NIM-樣序列的番茄序列(SEQ ID NO37)的序列對比為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)新簡并引物對。將由這些片段設(shè)計(jì)的引物列在下面的表3中且優(yōu)選由GenosysBiotechnologies，Inc.(The Woodlands，Texas)合成。根據(jù)寡核苷酸中單一位點(diǎn)上一種以上堿基的標(biāo)志將簡并位置列在表3中?！叭∠颉敝傅氖撬鲆锸欠穸ㄏ蛴赾DNA的3’端(下游)或5’端(上游)。表4其它簡并引物
如上所述使用番茄cDNA進(jìn)行簡并引物的PCR并克隆和測序可能的產(chǎn)物。序列分析顯示了兩類NIM-樣片段第一種與用SEQ ID NO37表示的番茄序列相同，而第二種在番茄中是唯一的，并且與用SEQ IDNO31和33表示的煙草序列具有88％的同一性。這種新型番茄序列的序列用SEQ ID NO61表示。
實(shí)施例8全長NIM-樣cDNA’s優(yōu)選通過使用SMART RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech，Palo Alto，CA)的RACE PCR從NIM-樣PCR片段中獲得相應(yīng)的cDNA序列上游和下游。優(yōu)選對至少三種獨(dú)立的RACE產(chǎn)物的每個(gè)5’-或3’-末端測序，以便消除PCR誤差。分別將所得的符合用SEQ ID NO39、43和31表示的NIM-樣PCR片段的甜菜、向日葵B和煙草B NIM1同源物的全長cDNA序列表示為SEQ ID NO63、65和73。
優(yōu)選通過RT-PCR克隆符合NIM-樣基因組序列AtNMLc2(SEQ IDNO15)、AtNMLc4-1(SEQ ID NO17)和AtNMLc4-2(SEQ ID NO19)的NIM-樣鼠耳芥cDNA’s。使用寡脫氧胸苷酸引物反轉(zhuǎn)錄來自鼠耳芥的總RNA。使用以各基因組序列(SEQ ID NO15、17和19)編碼區(qū)的5’和3’末端為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的特異性有義和反義寡核苷酸引物、通過PCR來擴(kuò)增所得的第一鏈cDNA。將預(yù)測大小的PCR片段克隆入載體并測序以便證實(shí)這些cDNA克隆與NIM-樣基因組序列一致。將與NIM-樣基因組序列AtNMLc2(SEQ ID NO15)一致的cDNA序列表示為SEQ ID NO67；將與NIM-樣基因組序列AtNMLc4-1(SEQ ID NO17)一致的全長cDNA序列表示為SEQ ID NO69；并將與NIM-樣基因組序列AtNMLc4-2(SEQ ID NO19)一致的全長cDNA序列表示為SEQ ID NO71。
實(shí)施例9Northern分析Northern數(shù)據(jù)表明在用100μM或300μM BTH(苯并(1，2，3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲酯)處理后甜菜NIM-樣克隆(SEQID NO39和63)的表達(dá)提高了3-7倍。此外，Northern數(shù)據(jù)表明向日葵A NIM-樣克隆(SEQ ID NO41)的表達(dá)是組成型的。此外，Northern數(shù)據(jù)表明在用100μM或300μM BTH處理后向日葵B NIM-樣克隆(SEQ ID NO43和65)的表達(dá)提高了2倍。
II.植物中本發(fā)明基因序列的表達(dá)可以使用常規(guī)的重組DNA技術(shù)將本發(fā)明的NIM1同源物引入植物細(xì)胞。一般來說，這一過程包括使用本領(lǐng)域中公知的標(biāo)準(zhǔn)克隆步驟將本發(fā)明的編碼序列插入與該編碼序列是異源的(即正常情況下不存在的)表達(dá)系統(tǒng)。所述載體含有轉(zhuǎn)錄和翻譯所插入編碼蛋白質(zhì)的序列所必不可少的元件?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中公知的大量載體系統(tǒng)，諸如質(zhì)粒、噬菌體病毒和其它修飾的病毒。合適的載體包括但不限于病毒載體，諸如λ載體系統(tǒng)λgtl1、λgtl0和卡隆4；質(zhì)粒載體，諸如pBI121、pBR322、pACYC177、pACYC184、pAR系列、pKK223-3、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pRK290、pKC37、pKC101、pCDNAII和其它相似系統(tǒng)。還可以修飾所述表達(dá)系統(tǒng)的成分以便增加表達(dá)。例如，可以使用截短的序列、核苷酸取代或其它修飾方法。在合適的條件下可以采用本文所述的表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化實(shí)際上任何的農(nóng)作物植物細(xì)胞?？梢允罐D(zhuǎn)化的細(xì)胞再生成完整植物，使得NIM1同源物增加SAR基因表達(dá)并提高轉(zhuǎn)基因植物中的病害抗性。
實(shí)施例10植物表達(dá)彈夾的構(gòu)建首先在表達(dá)彈夾中將用于轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的編碼序列裝配在植物中可表達(dá)的合適啟動(dòng)子之后。該表達(dá)彈夾還可以包括表達(dá)轉(zhuǎn)基因所需或篩選的任何其它序列。這類序列包括但不限于轉(zhuǎn)錄終止子；諸如內(nèi)含子這樣促進(jìn)表達(dá)的外部序列；活性序列和用于將基因產(chǎn)物靶向至特定細(xì)胞器和細(xì)胞區(qū)室的序列。然后便利地將這些表達(dá)彈夾轉(zhuǎn)入下述植物轉(zhuǎn)化載體。下面是典型表達(dá)彈夾中各種成分的描述。
1.啟動(dòng)子對表達(dá)彈夾中所用啟動(dòng)子的選擇決定轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)基因的空間和時(shí)間分布型。所選擇的啟動(dòng)子表達(dá)特殊細(xì)胞類型(諸如葉表皮細(xì)胞、葉肉細(xì)胞、根皮層細(xì)胞)或特殊組織或器官(例如，根、葉或花)中的轉(zhuǎn)基因，并且這種選擇反映出累積基因產(chǎn)物所需的位置。另一方面，所選擇的啟動(dòng)子可以在不同誘導(dǎo)條件下啟動(dòng)基因的表達(dá)。啟動(dòng)子在其強(qiáng)度即促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的能力上是可變的。根據(jù)所用宿主細(xì)胞系統(tǒng)的不同，可以使用包括基因的天然啟動(dòng)子在內(nèi)的許多合適啟動(dòng)子中的任何一種。下面是可以用于表達(dá)彈夾中的啟動(dòng)子的非限制性實(shí)例。
a.組成型表達(dá)、遍在蛋白質(zhì)啟動(dòng)子遍在蛋白質(zhì)是一種已知累積在許多細(xì)胞類型中的基因產(chǎn)物且已經(jīng)從用于轉(zhuǎn)基因植物的幾個(gè)物種中克隆了其啟動(dòng)子(例如向日葵-Binet等人，1991；玉米-Christensen等人，1989；和鼠耳芥屬-Norris等人，1993)。已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因單子葉植物系統(tǒng)中研發(fā)了玉米遍在蛋白質(zhì)啟動(dòng)子且為單子葉植物轉(zhuǎn)化而構(gòu)建的其序列和載體公開在專利申請EP 0342 926(Lubrizol)中。Taylor等人(1993)描述了包括玉米遍在蛋白質(zhì)啟動(dòng)子和第一種內(nèi)含子的載體(pAHC25)及其在通過微射轟擊引入時(shí)大量單子葉植物的細(xì)胞混懸液中的高活性。特別優(yōu)選將鼠耳芥屬遍在蛋白質(zhì)啟動(dòng)子用于本發(fā)明的NIM1同源物中。這種遍在蛋白質(zhì)啟動(dòng)子適合于包括單子葉植物和雙子葉植物在內(nèi)的轉(zhuǎn)基因植物中的基因表達(dá)。合適的載體是pAHC25的衍生物或在該申請中記載的通過引入合適的遍在蛋白質(zhì)啟動(dòng)子和/或內(nèi)含子序列而修飾的任何轉(zhuǎn)化載體。
b.組成型表達(dá)，CaMV35S啟動(dòng)子質(zhì)粒pCGN1761的構(gòu)建記載在公開的專利申請EP 0392 225(實(shí)施例23)中。pCGN1761含有“雙”CaMV35S啟動(dòng)子和tml轉(zhuǎn)錄終止子(在該啟動(dòng)子和該終止子之間具有單一EcoRI位點(diǎn))并帶有pUC-型主鏈。構(gòu)建帶有修飾的多接頭的pCGN1761衍生物，所述的多接頭除包括存在的EcoRI位點(diǎn)外還包括Notl和Xhol位點(diǎn)。將這種衍生物命名為pCGN1761ENX。pCGN1761ENX用于克隆其多接頭內(nèi)的cDNA序列或編碼序列(包括微生物ORF序列)以便在轉(zhuǎn)基因植物中在35S啟動(dòng)子控制下表達(dá)所述的序列。可以用與啟動(dòng)子5’連接的Hindlll、Sphl、Sall和Xbal位點(diǎn)和與終止子3’連接的Xbal、BamHl和Bgll位點(diǎn)切割如此構(gòu)建的完整35S啟動(dòng)子-編碼序列-tml終止子彈夾以便轉(zhuǎn)入諸如下述的轉(zhuǎn)化載體。此外，可以通過用Hindlll、Sphl、Sall、Xbal或Pstl進(jìn)行5’切割并用任何的多接頭限制位點(diǎn)(EcoRI、Notl或Xhol)進(jìn)行3’切割來除去雙35S啟動(dòng)子片段，以便用另一啟動(dòng)子進(jìn)行取代。如果需要，通過引入可以促進(jìn)翻譯的序列來進(jìn)行克隆位點(diǎn)周圍的修飾。這在需要超表達(dá)時(shí)特別有用。例如，可以如美國專利號5,639,949的實(shí)施例37中所述通過使翻譯起始位點(diǎn)最佳化來修飾pCGN1761ENX。
c.組成型表達(dá)，肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子已知在大多數(shù)細(xì)胞類型中表達(dá)了幾種肌動(dòng)蛋白的同種型且由此肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子對組成型啟動(dòng)子來說是一種良好的選擇。特別地，已經(jīng)克隆和表征了來自水稻Actl基因的啟動(dòng)子(McElroy等人，1990)。發(fā)現(xiàn)1.3kb的該啟動(dòng)子片段含有水稻原生質(zhì)體中表達(dá)所需的全部調(diào)節(jié)元件。此外，已經(jīng)特異性構(gòu)建了用于單子葉植物的基于Actl啟動(dòng)子的大量表達(dá)載體(McElroy等人，1991)。它們結(jié)合了Actl-內(nèi)含子1、Adhl 5’側(cè)翼序列和Adhl-內(nèi)含子1(來自玉米醇脫氫酶基因)和來自CaMV35S啟動(dòng)子的序列。顯示出最高程度表達(dá)的載體是35S和Actl內(nèi)含子或Actl 5’側(cè)翼序列和Actl內(nèi)含子的融合體。使起始ATG(GUS報(bào)道基因的)周圍的序列最佳化也會(huì)促進(jìn)表達(dá)?？梢苑奖愕匦揎椨蒑cElroy等人(1991)所述的啟動(dòng)子表達(dá)彈夾以用于基因表達(dá)，并且這些啟動(dòng)子表達(dá)彈夾特別適用于單子葉植物宿主。例如，可以從McElroy構(gòu)建體中除去含啟動(dòng)子的片段并將其用于取代pCGN1761ENX中的雙35S啟動(dòng)子，然后將它用于插入特異性基因序列。接著可以將由此構(gòu)建的融合基因轉(zhuǎn)入合適的轉(zhuǎn)化載體。在一個(gè)獨(dú)立的報(bào)導(dǎo)中，還發(fā)現(xiàn)帶有第一種內(nèi)含子的水稻Actl啟動(dòng)子指導(dǎo)經(jīng)培養(yǎng)的大麥細(xì)胞中的高度表達(dá)(Chibbar等人，1993)。
d.誘導(dǎo)型表達(dá)，PR-1啟動(dòng)子可以用產(chǎn)生適宜的高度表達(dá)水平的所選擇的任何其它啟動(dòng)子來取代pCGN1761ENX中的雙35S啟動(dòng)子。根據(jù)實(shí)例，美國專利號5,614,395中所述的化學(xué)調(diào)節(jié)啟動(dòng)子之一可以取代雙35S啟動(dòng)子。優(yōu)選用限制酶從所選擇的啟動(dòng)子來源中切割選擇的啟動(dòng)子，不過，可以另外選擇使用攜帶合適終止限制位點(diǎn)的引物來對所選擇的啟動(dòng)子進(jìn)行PCR擴(kuò)增。應(yīng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后應(yīng)對所述啟動(dòng)子重新進(jìn)行測序以便檢查在靶載體中克隆擴(kuò)增的啟動(dòng)子后的擴(kuò)增誤差。從質(zhì)粒pCIB1004中切割化學(xué)/病原體調(diào)節(jié)煙草PR-1a啟動(dòng)子(用于構(gòu)建，參見例如EP 0332 104中的實(shí)施例21)并將其轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pCGN1761ENX(Uknes等人，1992)。用Ncol切割pCIB1004并通過用T4 DNA聚合酶處理使所得線性化片段的3’突出端鈍端化。然后用Hindlll切割該片段并將所得的含PR-1a的啟動(dòng)子片段進(jìn)行凝膠純化，并克隆入已經(jīng)除去了雙35S啟動(dòng)子的pCGN1761ENX中。該過程通過下列步驟來進(jìn)行用Xhol切割和用T4聚合酶鈍端化處理；隨后用Hindlll切割并分離含有pCIB1004啟動(dòng)子片段被克隆入的片段的較大載體-終止子。這一過程產(chǎn)生一種pCGN1761ENX衍生物，它帶有PR-1a啟動(dòng)子和tml終止子以及帶有單一EcoRI和Notl位點(diǎn)的間插多接頭。可以將所選擇的編碼序列插入該載體，隨后可以將融合產(chǎn)物(即啟動(dòng)子-基因-終止子)轉(zhuǎn)入包括下文所述的那些載體在內(nèi)的任何選擇的轉(zhuǎn)化載體。可以采用各種化學(xué)調(diào)節(jié)物來誘導(dǎo)所選擇的編碼序列在按照本發(fā)明轉(zhuǎn)化的植物中的表達(dá)，這些化學(xué)調(diào)節(jié)物包括美國專利號5,523,311和5,614,395中公開的苯并噻二唑、異煙酸和水楊酸化合物。
e.誘導(dǎo)型表達(dá)，一種乙醇-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子還可以將諸如乙醇這樣的某些醇類或酮類誘導(dǎo)的啟動(dòng)子用于使本發(fā)明的編碼序列產(chǎn)生誘導(dǎo)型表達(dá)。這類啟動(dòng)子例如是來自構(gòu)巢曲霉的alcA基因啟動(dòng)子(Caddick等人，1998)。在構(gòu)巢曲霉中，alcA基因編碼醇脫氫酶I，其表達(dá)在有化學(xué)誘導(dǎo)物存在的情況下由AlcR轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)。為了本發(fā)明的目的，用本發(fā)明的編碼序列來取代包括與最小35S啟動(dòng)子(Caddick等人，1998)融合的alcA基因啟動(dòng)子序列的質(zhì)粒palcACAT中的CAT編碼序列以便形成帶有在alcA基因啟動(dòng)子控制下的編碼序列的表達(dá)彈夾?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中眾所周知的方法來進(jìn)行該過程。
f.誘導(dǎo)型表達(dá)、一種糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子使用基于類固醇激素的系統(tǒng)誘導(dǎo)本發(fā)明NIM1同源物的表達(dá)也是所關(guān)注的。例如，可以使用糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)的誘導(dǎo)系統(tǒng)(Aoyama和Chua，1997)并且通過應(yīng)用糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)基因表達(dá)，例如一種合成的糖皮質(zhì)激素，優(yōu)選地塞米松，優(yōu)選的濃度范圍在0.1mM-1mM、更優(yōu)選10mM-100mM。為了本發(fā)明的目的，用編碼NIM1同源物的基因序列取代熒光素酶基因序列以便在與35S最小啟動(dòng)子融合的GAL4上游活化序列6個(gè)拷貝的控制下形成帶有編碼NIM1同源物的基因序列的表達(dá)彈夾。使用本領(lǐng)域中眾所周知的方法來進(jìn)行該過程。反式作用因子包括GAL4 DNA的結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Keegan等人，1986)，該結(jié)構(gòu)域與皰疹病毒蛋白VP16(Triezenberg等人，1988)的反式激活域融合，這種反式激活域與大鼠糖皮質(zhì)激素受體(Picard等人，1988)的激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合。融合蛋白的表達(dá)由適合于本領(lǐng)域中公知或本文所述植物中的表達(dá)的任何啟動(dòng)子來控制。這種表達(dá)彈夾還包括在含有編碼與6xGAL4/最小啟動(dòng)子融合的NIM1同源物的基因序列的植物中。因此，獲得融合蛋白的組織或器官特異性可導(dǎo)致NIM1同源物的誘導(dǎo)型組織或器官特異性。
g.根特異性表達(dá)基因表達(dá)的另一種模式是根表達(dá)。合適的根啟動(dòng)子由de Framond(1991)描述并且也記載于公開的專利申請EP 0452 269中。將這種啟動(dòng)子轉(zhuǎn)入諸如pCGN1761ENX這樣合適的載體以便插入所選擇的基因，隨后將完整的啟動(dòng)子-基因-終止子彈夾轉(zhuǎn)入有意義的轉(zhuǎn)化載體中。
h.創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子也適合于基因表達(dá)。已經(jīng)描述了大量這類啟動(dòng)子(例如Xu等人，1993)；Logemann等人，1989；Rohrmeier&Lehle，1993；Firek等人，1993；Warner等人，1993)，它們均適用于本發(fā)明。Logemann等人描述了雙子葉植物馬鈴薯wunl基因的5’上游序列。Xu等人證實(shí)來自雙子葉植物馬鈴薯的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(pin2)在單子葉植物水稻中具有活性。此外，Rohrmeier&Lehle描述了玉米WiplcDNA的克隆，它是創(chuàng)傷誘導(dǎo)型的且可以將其用于使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離關(guān)連啟動(dòng)子。類似地，F(xiàn)irek等人和Warner等人已經(jīng)描述了來自單子葉植物石刁柏的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型基因，將它在局部創(chuàng)傷和病原體侵害部位表達(dá)。使用本領(lǐng)域中眾所周知的克隆技術(shù)可以將這些啟動(dòng)子轉(zhuǎn)入與涉及本發(fā)明基因融合的合適載體，并用于在植物創(chuàng)傷部位上表達(dá)這些基因。
i.髓優(yōu)選的表達(dá)專利申請WO 93/07278中描述了優(yōu)選在髓細(xì)胞中表達(dá)的玉米trpA基因的分離。列出了從轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)擴(kuò)展至-1726bp的基因序列和啟動(dòng)子。使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)可以將這種啟動(dòng)子或其部分轉(zhuǎn)入諸如pCGN1761這樣的載體，其中它可以取代35S啟動(dòng)子，并可用于以髓優(yōu)選方式啟動(dòng)外源基因的表達(dá)。實(shí)際上，可以將含有髓優(yōu)選的啟動(dòng)子或其部分的片段轉(zhuǎn)入任何載體并修飾以便在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
j.葉特異性表達(dá)Hudspeth&Grula(1989)已經(jīng)描述了編碼磷酸烯醇羧酶(PEPC)的玉米基因。使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)可以將用于該基因的啟動(dòng)子用于以葉特異性方式啟動(dòng)轉(zhuǎn)基因植物中任何基因的表達(dá)。
k.花粉特異性表達(dá)WO 93/07278中描述了在花粉細(xì)胞中表達(dá)的玉米鈣依賴性蛋白激酶(CDPK)的分離?；蛐蛄泻蛦?dòng)子從轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)擴(kuò)展至1400bp。使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)可以將這種啟動(dòng)子或其部分轉(zhuǎn)入諸如pCGN1761這樣的載體，其中它可以取代35S啟動(dòng)子，并可用于以花粉特異性方式啟動(dòng)本發(fā)明NIM1同源物的表達(dá)。
2.轉(zhuǎn)錄終止子各種轉(zhuǎn)錄終止子可以應(yīng)用于表達(dá)彈夾。它們負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)基因及其正確聚腺苷酸化后的轉(zhuǎn)錄終止。合適的轉(zhuǎn)錄終止子是那些已知在植物中起作用的終止子且包括CaMV 35S終止子、tml終止子、胭脂氨酸合酶終止子和豌豆rbcS E9終止子。它們可用于單子葉植物和雙子葉植物。此外，可以使用一種基因的天然轉(zhuǎn)錄終止子。
3.用于表達(dá)的增強(qiáng)或調(diào)節(jié)的序列已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量來自轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)的可促進(jìn)基因表達(dá)的序列，并且可以將這些序列與本發(fā)明的基因聯(lián)合使用以便增加其在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)。
已經(jīng)證實(shí)不同的內(nèi)含子序列可促進(jìn)表達(dá)、特別是在單子葉植物細(xì)胞中。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)玉米Adhl基因的內(nèi)含子可顯著促進(jìn)野生型基因在引入玉米細(xì)胞時(shí)在其關(guān)連啟動(dòng)子控制下的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子1特別有效且在與氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因的融合構(gòu)建體中的表達(dá)得到提高(Callis等，1987)。在相同的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，來自玉米bronzel基因的內(nèi)含子在促進(jìn)表達(dá)方面具有相似的作用。通常將內(nèi)含子序列引入植物轉(zhuǎn)化載體、一般是未翻譯的前導(dǎo)區(qū)內(nèi)。
已知許多來源于病毒的未翻譯前導(dǎo)序列也可促進(jìn)表達(dá)，并且它們在雙子葉植物細(xì)胞中特別有效。特別地，已經(jīng)證實(shí)來自煙草花葉病毒(TMV，“W-序列”)、玉米褪綠斑駁病(MCMV)和苜?；ㄈ~病毒(AMV)的前導(dǎo)序列可有效促進(jìn)表達(dá)(例如Gallie等人，1987；Skuzeski等人，1990)。
4.細(xì)胞內(nèi)基因產(chǎn)物的靶向已知在植物中存在靶向基因產(chǎn)物的不同機(jī)理，并且已經(jīng)以一定的具體方式表征了控制這些機(jī)理起作用的序列。例如，由在進(jìn)入葉綠體以產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)的過程中被切割的不同蛋白質(zhì)氨基酸末端發(fā)現(xiàn)的信號序列控制將基因產(chǎn)物靶向至葉綠體(例如Comao等人，1988)。這些信號序列可以與異源基因產(chǎn)物融合以便影響異源產(chǎn)物引入葉綠體(van den Broeck等人，1985)。編碼合適的信號序列的DNA可以分離自編碼RUBISCO蛋白質(zhì)、CAB蛋白質(zhì)、EPSP合酶、GS2蛋白質(zhì)和已知是葉綠體定位的許多其它蛋白質(zhì)的5’末端。另外參見美國專利號5,639,949的實(shí)施例37中的小標(biāo)題“使用葉綠體靶向的表達(dá)”。
其它基因產(chǎn)物定位于其它諸如線粒體和過氧化物酶體這樣的細(xì)胞器(例如Unger等人，1989)。還可以操縱編碼這些產(chǎn)物的cDNAs以便使異源基因產(chǎn)物靶向至這些細(xì)胞器。這類序列的實(shí)例是核編碼的腺苷三磷酸酶和特異性線粒體用的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶同種型。Rogers等人(1985)已經(jīng)描述了靶向細(xì)胞蛋白質(zhì)體。
此外，已經(jīng)表征了可使基因產(chǎn)物靶向至其它細(xì)胞區(qū)室的序列。氨基末端序列負(fù)責(zé)靶向至ER、質(zhì)外體和從糊粉細(xì)胞進(jìn)行胞外分泌(Koehler&Ho，1990)。另外，氨基末端序列與羧基末端序列負(fù)責(zé)基因產(chǎn)物的液泡靶向(Shinshi等人，1990)。
通過將上述合適的靶向序列與有意義的轉(zhuǎn)基因序列融合，有可能使得轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物定向于任何細(xì)胞器或細(xì)胞區(qū)室。例如，為了進(jìn)行葉綠體靶向，使來自RUBISCO基因、CAB基因、EPSP合酶基因或GS2基因的葉綠體信號序列與轉(zhuǎn)基因的氨基末端ATG進(jìn)行框內(nèi)融合。所選擇的信號序列應(yīng)包括已知的切割位點(diǎn)，并且所構(gòu)建的融合體應(yīng)考慮到切割所需的切割位點(diǎn)后的任何氨基酸。在某些情況中，通過在切割位點(diǎn)與轉(zhuǎn)基因ATG之間添加少量氨基酸或在轉(zhuǎn)基因序列中取代某些氨基酸可以滿足這種要求。通過體外翻譯體外轉(zhuǎn)錄的構(gòu)建體、隨后使用由Bartlett等人(1982)和Wasmann等人(1986)所述的技術(shù)，通過葉綠體體外攝取來測試為引入葉綠體所構(gòu)建的融合體的葉綠體攝入功效。這些構(gòu)建技術(shù)在本領(lǐng)域中是眾所周知的且同樣可用于線粒體和過氧化物酶體。
上述細(xì)胞靶向機(jī)理不僅可以與其關(guān)連啟動(dòng)子共同使用，而且可以與異源啟動(dòng)子一起使用，從而在與靶向信號來源的啟動(dòng)子不同的表達(dá)模式的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下實(shí)現(xiàn)特異性靶向細(xì)胞的目的。
實(shí)施例11植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建大量可以應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化載體對于植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是公知的，并且可以將涉及本發(fā)明的基因與任何這類載體一起使用。對載體的選擇將取決于優(yōu)選的轉(zhuǎn)化技術(shù)和用于轉(zhuǎn)化的靶物種。就某些靶物種而言，可以優(yōu)選不同的抗生素或除草劑選擇標(biāo)記。在轉(zhuǎn)化中通常使用的選擇標(biāo)記包括產(chǎn)生卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptll基因(Messing&Vierra，1982；Bevan等人，1983)、產(chǎn)生除草劑膦絲菌素抗性的bar基因(White等人，1990；Spencer等人，1990)、產(chǎn)生抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochinger&Diggelmann)和產(chǎn)生氨甲蝶呤抗性的dhfr基因(Bourouis等人，1983)以及產(chǎn)生草甘膦抗性的EPSPS基因(美國專利號4,940,935和5,188,642)。
1.適合于農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)化的載體許多載體可以應(yīng)用于使用根癌土壤桿菌的轉(zhuǎn)化。它們一般攜帶至少一種T-DNA邊緣序列且包括諸如pBIN19(Bevan，《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)(1984))和pXYZ這樣的載體。下面描述了適合于農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)化的兩種典型載體的構(gòu)建。
a.pCIB200和pCIB2001二元載體pCIB200和pCIB2001用于構(gòu)建適用于農(nóng)桿菌屬的重組載體，且以下列方式構(gòu)建它們。通過Narl消化pTJS75而生成pTJS75kan(Schmidhauser&Helinski，1985)，從而切下四環(huán)素抗性基因，隨后插入來自攜帶NPTII的pUC4K的Accl片段(Messing&Vierra，1982；Bevan等人，1983；McBride等人，1990)。將Xhol接頭與含有左和右T-DNA邊緣、植物選擇性nos/nptll嵌合基因和pUC多接頭的PCIB7的EcoRV片段連接(Rothstein等人，1987)，并將Xhol-消化的片段克隆入Sall-消化的pTJS75kan中，以便生成pCIB200(還可參見EP 0 332 104，實(shí)施例19)。pCIB200含有下列單一多接頭限制位點(diǎn)EcoRI、Sstl、Kpnl、Bglll、Xbal和Sall。pCIB2001是通過插入其它限制位點(diǎn)的多接頭而生成的pCIB200的衍生物。在pCIB2001的多接頭中的單一限制位點(diǎn)有EcoRI、Sstl、Kpnl、Bglll、Xbal、Sall、Mlul、Bcll、Avrll、Apal、Hpal和Stul。pCIB2001除含有這些單一限制位點(diǎn)外還具有植物和細(xì)菌卡那霉素選擇性、用于農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的左和右T-DNA邊緣、用于大腸桿菌與其它宿主之間轉(zhuǎn)移的RK2-衍生的trfA功能和同樣來自RK2的OriT和OriV功能。pCIB2001多接頭適合于克隆含有其自身調(diào)節(jié)信號的植物表達(dá)彈夾。
b.pCIBi0及其潮霉素選擇衍生物二元載體pCIB10含有編碼植物中篩選用的卡那霉素抗性的基因和T-DNA右和左邊緣序列并引入來自廣泛宿主范圍質(zhì)粒pRK252的序列，使它在大腸桿菌和農(nóng)桿菌屬中復(fù)制。Rothstein等人(1987)描述了其構(gòu)建。構(gòu)建了引入潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因(Gritz等人，1983)的pCIB10的各種衍生物。這些衍生物能夠選擇僅針對潮霉素(pCIB743)或針對潮霉素和卡那霉素(pCIB715、pCIB717)的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。
2.適合于非農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)化的載體不使用根癌土壤桿菌的轉(zhuǎn)化避開了在選擇的轉(zhuǎn)化載體中對T-DNA序列的需求，結(jié)果除了諸如上述含有T-DNA序列的載體之外，還可以使用缺乏這些序列的載體。不依賴于農(nóng)桿菌屬的轉(zhuǎn)化技術(shù)包括通過粒子轟擊、原生質(zhì)體吸收(例如PEG和電穿孔)和微注射的轉(zhuǎn)化。對載體的選擇主要取決于對所轉(zhuǎn)化物種的優(yōu)先選擇。下面描述了適合于非農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)化的典型載體的構(gòu)建。
a.pCIB3064
pCIB3064是一種適合于與通過除草劑basta(或膦絲菌素)選擇聯(lián)用的定向基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的pUC-衍生的載體。質(zhì)粒pCIB246包括可操作地與大腸桿菌GUS基因融合的CaMV 35S啟動(dòng)子和CaMV 35S轉(zhuǎn)錄終止子，在PCT公開申請WO 93/07278中有描述。這種載體的35S啟動(dòng)子含有兩個(gè)起始位點(diǎn)的ATG序列5’。使用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)使這些位點(diǎn)發(fā)生突變，以這樣一種方式以便除去ATGs并生成限制位點(diǎn)Sspl和Pvull。新的限制位點(diǎn)是離單一Sall位點(diǎn)96和37bp和離實(shí)際起始位點(diǎn)101和42bp。將所得的pCIB246衍生物命名為pCIB3025。然后通過用Sall和Sacl消化從pCIB3025上切下GUS基因，使末端鈍端化并重新連接而生成質(zhì)粒pCIB3060。質(zhì)粒pJIT82獲自John Innes Centre，Norwich，切下含有來自產(chǎn)綠色鏈霉菌的bar基因的400bp Saml片段并將其插入pCIB3060的Hpal位點(diǎn)(Thompson等人，1987)。該過程生成pCIB3064，它包括在除草劑篩選用的CaMV 35S啟動(dòng)子和終止子控制下的bar基因、氨芐青霉素抗性基因(用于大腸桿菌中的篩選)和帶有單一位點(diǎn)Sphl、Pstl、Hindlll和BamHl的多接頭。這種載體適合于克隆含有其自身調(diào)節(jié)信號的植物表達(dá)彈夾。
b.pSOG19和pSOG35pSOG35是一種使用大腸桿菌基因二氫葉酸還原酶(DFR)作為產(chǎn)生氨甲蝶呤抗性的選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)化載體。將PCR用于擴(kuò)增35S啟動(dòng)子(-800bp)、來自玉米Adh1基因的內(nèi)含子6(-550bp)和18bp來自pSOG10的GUS未翻譯前導(dǎo)序列。另外通過PCR擴(kuò)增編碼大腸桿菌二氫葉酸還原酶II型基因的250-bp片段，并給這兩種PCR片段裝配來自包括pUC19載體主鏈和胭脂氨酸合酶終止子的pB1221(Clontech)的Sacl-Pstl片段。裝配這些片段產(chǎn)生含有與內(nèi)含子6序列融合的35S啟動(dòng)子、GUS前導(dǎo)區(qū)、DHFR基因和胭脂氨酸合酶終止子的pSOG19。來自玉米褪綠斑駁病毒(MCMV)的前導(dǎo)序列對pSOG19中的GUS前導(dǎo)區(qū)取代的產(chǎn)生了pSOG35載體。pSOG19和pSOG35攜帶用于氨芐青霉素抗性的pUC基因并具有用于克隆外來物質(zhì)的Hindlll、Sphl、Pstl和EcoRl位點(diǎn)。
實(shí)施例12轉(zhuǎn)化一旦將有意義的基因序列克隆入表達(dá)系統(tǒng)，則將它轉(zhuǎn)化入植物細(xì)胞。用于植物轉(zhuǎn)化和再生的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。例如，已經(jīng)將Ti質(zhì)粒載體用于轉(zhuǎn)運(yùn)外源DNA以及直接DNA吸收、脂質(zhì)體、電穿孔、微注射和微粒。此外，可以將來自農(nóng)桿菌屬的細(xì)菌用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。下面是用于轉(zhuǎn)化雙子葉植物和單子葉植物的有代表性技術(shù)的描述。
1.雙子葉植物的轉(zhuǎn)化用于雙子葉植物的轉(zhuǎn)化技術(shù)在本領(lǐng)域中是眾所周知的且包括基于農(nóng)桿菌屬的技術(shù)和不需要農(nóng)桿菌屬的技術(shù)。非農(nóng)桿菌屬技術(shù)包括由原生質(zhì)體或細(xì)胞直接攝入外源性遺傳物質(zhì)。該過程可以通過PEG或電穿孔介導(dǎo)的吸收、粒子轟擊介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)或微注射來完成。這些技術(shù)的實(shí)例由Paszkowski等人，1984；Potrykus等人，1985；Reich等人，1986和Klein等人，1987描述。在每種情況中，使用本領(lǐng)域中公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生成完整植物。
農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是一種用于轉(zhuǎn)化雙子葉植物的優(yōu)選技術(shù)，這是由于其高轉(zhuǎn)化效率及其在許多不同物種的廣泛應(yīng)用所導(dǎo)致的。農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)化一般包括將攜帶有意義的外源DNA的二元載體(例如pCIB200或pCIB2001)轉(zhuǎn)入合適的農(nóng)桿菌屬菌株的步驟，這種合適的農(nóng)桿菌屬菌株可以依賴于共存Ti質(zhì)粒上由宿主農(nóng)桿菌屬菌株攜帶的vir基因補(bǔ)體或染色體的存在方式(例如pCIB200和pCIB2001所用的菌株CIB542)(Uknes等人，1993)。將重組二元載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌屬的過程通過使用攜帶重組二元載體的大腸桿菌進(jìn)行的三親交配步驟來完成，所述的大腸桿菌是一種攜帶諸如pRK2013且能夠使重組二元載體達(dá)到靶農(nóng)桿菌屬菌株的質(zhì)粒的輔助大腸桿菌菌株。另一方面，可以通過DNA轉(zhuǎn)化將重組二元載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌屬(H_fgen&Willmitzer，1988)。
通過重組農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)化靶植物物種通常包括農(nóng)桿菌屬與來自植物的外植體的共培養(yǎng)，并按照本領(lǐng)域中眾所周知的方案進(jìn)行。在攜帶二元質(zhì)粒T-DNA邊緣之間存在的抗生素或除草劑抗性標(biāo)記的選擇培養(yǎng)基上使轉(zhuǎn)化的組織再生。
另一種使用基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的手段包括使惰性或生物活性顆粒推進(jìn)到植物組織和細(xì)胞上。這項(xiàng)技術(shù)公開在美國專利號4,945,050、5,036,006和5,100,792中。一般來說，該過程包括在有效透過細(xì)胞外表面并在其內(nèi)部產(chǎn)生結(jié)合的條件下將惰性或生物活性顆粒推進(jìn)到細(xì)胞中。當(dāng)使用惰性顆粒時(shí)，可以通過給顆粒包裹含有所需基因的載體而將所述載體引入細(xì)胞。另一方面，靶細(xì)胞可被載體包圍，使得該載體尾隨顆粒進(jìn)入細(xì)胞。也可以將生物活性顆粒(例如各自含有試圖引入的DNA的干燥的酵母細(xì)胞、干燥的細(xì)菌或噬菌體)推進(jìn)到植物細(xì)胞組織中。
2.單子葉植物的轉(zhuǎn)化目前大多數(shù)單子葉植物物種的轉(zhuǎn)化已經(jīng)成為常規(guī)的。優(yōu)選的技術(shù)包括使用PEG或電穿孔技術(shù)將基因直接轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體和粒子轟擊入愈傷組織。可以使用單DNA物種或多DNA物種進(jìn)行轉(zhuǎn)化(即共轉(zhuǎn)化)且這兩項(xiàng)技術(shù)均適用于本發(fā)明。共轉(zhuǎn)化可以具有避免完全載體構(gòu)建和生成帶有感興趣基因的未連鎖的基因座和選擇性標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物的優(yōu)點(diǎn)，從而能夠在隨后的生產(chǎn)過程中除去所述的選擇性標(biāo)記，應(yīng)將這一過程看作是理想的。然而，使用共轉(zhuǎn)化的缺點(diǎn)在于整合入基因組的單一DNA種類的頻率低于100％(Schocher等人，1986)。
專利申請EP 0292 435、EP 0392 225和WO 93/07278中描述了用于來自玉米原種近交系的愈傷組織和原生質(zhì)體的制備、使用PEG或電穿孔轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體和由轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體再生玉米植物的技術(shù)。Grodon-Kamm等人(1990)和Fromm等人(1990)已經(jīng)公開了使用粒子轟擊轉(zhuǎn)化A188-衍生的玉米品系的技術(shù)。此外，WO 93/07278和Koziel等人(1993)中描述了通過粒子轟擊轉(zhuǎn)化玉米原種近交系的技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)使用傳粉后14-15天從玉米穗上切下的1.5-2.5mm長的未成熟胚和轟擊用PDS-1000He Biolstics裝置。
還可以通過使用原生質(zhì)體或粒子轟擊的定向基因轉(zhuǎn)移技術(shù)來進(jìn)行水稻的轉(zhuǎn)化。已經(jīng)描述了針對日本型和印度型的原生質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Zhang等人，1988；Shimamoto等人，1989；Datta等人，1990)。兩種類型也通常是使用粒子轟擊轉(zhuǎn)化的(Christou等，1991)。此外，WO 93/21335中描述了通過電穿孔轉(zhuǎn)化水稻的技術(shù)。
專利申請EP 0 332 581中描述了Pooideae原生質(zhì)體的生成、轉(zhuǎn)化和再生。這些技術(shù)用于轉(zhuǎn)化鴨茅屬和小麥。此外，Vasil等人(1992)已經(jīng)描述了使用粒子轟擊入C型長期再生性愈傷組織的細(xì)胞進(jìn)行小麥的轉(zhuǎn)化，Vasil等人(1993)和Weeks等人(1993)也描述了使用粒子轟擊未成熟胚和成熟胚衍生的愈傷組織來進(jìn)行小麥的轉(zhuǎn)化。然而，優(yōu)選的小麥轉(zhuǎn)化技術(shù)涉及通過粒子轟擊未成熟胚轉(zhuǎn)化小麥并包括在基因遞送之前的高蔗糖或高麥芽糖步驟。在轟擊前，將任何數(shù)量的胚(0.75-1mm長)平板固定在含有3％蔗糖(Murashiga&Skoog，1962)和3mg/l 2，4-D的MS培養(yǎng)基上以便誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，使該步驟在黑暗中進(jìn)行。在選擇進(jìn)行轟擊的當(dāng)天，從誘導(dǎo)培養(yǎng)基中取出胚并置于滲壓劑(即含有一般以15％的所需濃度添加的蔗糖或麥芽糖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基)上。使胚進(jìn)行質(zhì)壁分離2-3小時(shí)，然后進(jìn)行轟擊。雖然并不關(guān)鍵，但通常是每個(gè)靶平板上有20個(gè)胚。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)程序使一種合適的攜帶基因的質(zhì)粒(諸如pCIB3064或pSG35)沉淀在微米大小的金粒子上。用使用～1000psi的破裂壓力并使用標(biāo)準(zhǔn)80目篩的DuPont Biolistics_氦裝置向各平板的胚發(fā)射。在轟擊后，將胚放回黑暗處以便恢復(fù)約24小時(shí)(仍然在滲壓劑上)。24小時(shí)后，從滲壓劑上取出胚并放回誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在此它們在再生前穩(wěn)定約1個(gè)月。約1個(gè)月后，將帶有發(fā)育中的胚發(fā)生愈傷組織的胚外植體轉(zhuǎn)入再生培養(yǎng)基(MS+1mg/升NAA、5mg/升GA)，該培養(yǎng)基進(jìn)一步含有合適的選擇劑(就pCIB3064而言是10mg/l basta，就pSOG35而言是2mg/l氨甲蝶呤)。約1個(gè)月后，將發(fā)育的枝條轉(zhuǎn)入稱作“GA7s”的含有半數(shù)濃度的MS、2％蔗糖和相同濃度的選擇劑的較大無菌容器中。
還描述了使用農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)化單子葉植物的技術(shù)方案。參見，WO94/00977和美國專利號5,591,616。
III.培育和種子生產(chǎn)實(shí)施例13培育通過用本發(fā)明基因轉(zhuǎn)化獲得的植物可以是任何廣泛的植物物種，包括那些單子葉植物和雙子葉植物；然而，本發(fā)明方法中所用的植物優(yōu)選自上文所述的農(nóng)學(xué)上重要的靶農(nóng)作物。可以通過培育將本發(fā)明基因的表達(dá)與對生產(chǎn)和質(zhì)量來說重要的其它特征一起引入植物品系。培育手段和技術(shù)在本領(lǐng)域中是公知的。例如，參見Welsh J.R.(1981)；Wood D.R.(編輯)(1983)；Mayo O.(1987)；Singh，D.P.(1986)；和Wricke和Weber(1986)。
通過有性繁殖或營養(yǎng)生長傳遞上述基因工程的轉(zhuǎn)基因種子和植物的遺傳特性，由此可以在子代植物中維持并傳播這些特性。通常所述的維持和傳播充分利用了為適合特殊目的發(fā)展的農(nóng)業(yè)方法，諸如耕種、播種或收獲。還可以應(yīng)用諸如水培或溫室技術(shù)這樣的特殊方法。當(dāng)生長的農(nóng)作物易受到由昆蟲或感染以及雜草植物競爭所導(dǎo)致的損害和破壞時(shí)，實(shí)施某些措施以便控制雜草、植物病害、昆蟲、線蟲和其它不良條件以改善產(chǎn)量。它們包括耕作土壤或除去雜草和感染植物這樣的機(jī)械措施以及施用諸如除草劑、殺真菌劑、殺配子劑、殺線蟲劑、生長調(diào)節(jié)劑、催熟劑和殺蟲劑這樣的農(nóng)用化學(xué)品。
在植物培育中可以進(jìn)一步應(yīng)用本發(fā)明的有利遺傳特性的轉(zhuǎn)基因植物和種子，其目的在于開發(fā)具有改善特性的植物，所述的改善特性諸如害蟲、除草劑或應(yīng)激耐受性、改善的營養(yǎng)價(jià)、產(chǎn)量提高或使倒伏或脫落損失減小的改進(jìn)結(jié)構(gòu)。不同培育步驟的特征在于充分確定的人的干預(yù)諸如選擇雜交品系、親本品系的定向傳粉或選擇合適的子代植物。根據(jù)所需特性的不同，制定不同的培育措施。相關(guān)技術(shù)在本領(lǐng)域中是眾所周知的，而且包括但不限于雜交、近交、回交培育、多線培育、變種混合、種間雜交、非整倍體技術(shù)等。雜交技術(shù)還包括植物不育化以便通過機(jī)械、化學(xué)或生化方式產(chǎn)生雄性或雌性不育植物。帶有不同品系花粉的雄性不育植物的交叉?zhèn)鞣鄞_保了雄性不育的基因組，而雌性不育植物均勻地獲得了兩親本品系的特性。因此，可以將本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因種子和植物用于改善的植物品系的培育，例如，這種培育方法提高了諸如除草劑或殺蟲劑(pestidice)處理這樣的常規(guī)方法的有效性，或因其改進(jìn)的遺傳特性而不再需要所述的方法。另一方面，可以獲得具有改善的應(yīng)激特性的新型農(nóng)作物，由于它們具有最佳化遺傳“設(shè)備”，從而使收獲產(chǎn)品的質(zhì)量優(yōu)于不能耐受類似的不良發(fā)育條件的產(chǎn)品。
實(shí)施例14種子的生產(chǎn)在種子的生產(chǎn)過程中，發(fā)芽的質(zhì)量和種子的均勻度是主要的產(chǎn)品特征，而由農(nóng)場主收獲和銷售的發(fā)芽的質(zhì)量和種子的均勻度并不重要。當(dāng)難以保持農(nóng)作物不含其它農(nóng)作物和雜草種子來控制種子生長病害和生產(chǎn)發(fā)芽良好的種子時(shí)，在生長、調(diào)節(jié)和銷售純種子領(lǐng)域中富有經(jīng)驗(yàn)的種子生產(chǎn)者已經(jīng)進(jìn)行了相當(dāng)廣泛而明確的種子生產(chǎn)實(shí)踐。因此，對農(nóng)場主而言通常的做法是購買滿足特定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的保質(zhì)種子而不是使用從其擁有的農(nóng)作物中收獲的種子。通常將用作種子的繁殖物質(zhì)用包括除草劑、殺昆蟲劑、殺真菌劑、殺細(xì)菌劑、殺線蟲劑、殺軟體動(dòng)物劑或其混合物的保護(hù)劑包裹材料進(jìn)行處理。通常使用的保護(hù)劑包裹材料包括諸如克菌丹、萎銹靈、福美雙(TMTD_)、methalaxyl(Apron_)、蟲螨磷(Actellic_)這樣的化合物。如果需要，可以將這些化合物與通常在制劑領(lǐng)域使用的其它載體、表面活性劑或促進(jìn)施用的佐劑一起配制以便產(chǎn)生抵抗由細(xì)菌、真菌或動(dòng)物昆蟲導(dǎo)致的破壞的保護(hù)作用?？梢酝ㄟ^用液體制劑浸滲繁殖物質(zhì)或通過用組合的濕或干制劑包裹來施用所述的保護(hù)劑包裹材料。諸如定向于芽或果實(shí)的處理這樣的其它施用方法也是可行的。
本發(fā)明的再一個(gè)方面是提供諸如上述典型方法這樣的新型農(nóng)用方法，其特征在于使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物物質(zhì)或轉(zhuǎn)基因種子。
可以將種子裝入由合適的包裝材料構(gòu)成的包、容器或管中，所述的包、容器或管能夠密封以包含種子?？梢詫⑷萜骰蚬茉O(shè)計(jì)成種子的短期或長期包裝或兩者均有的包裝。合適的包裝材料的實(shí)例包括諸如牛皮紙這樣的紙、硬質(zhì)塑料或柔順?biāo)芰匣蚱渌酆喜牧?、玻璃或金屬。理想的情況是所述的包、容器或管由多層相同或不同類型的包裝材料構(gòu)成。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供所述的包、容器或管以便防止或限制水和濕氣接觸種子。在一個(gè)實(shí)例中，將所述的包、容器或管密封、例如加熱密封以便防止水或濕氣進(jìn)入。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將吸水物質(zhì)置于包裝材料層之間或接近包裝材料層。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將包、容器或管或構(gòu)成的包裝材料進(jìn)行處理以便限制、抑制或防止種子儲存或運(yùn)輸過程中的病害、污染或其它不利影響。這類處理方法的一個(gè)實(shí)例是例如通過化學(xué)方式或通過接觸射線進(jìn)行不育化。本發(fā)明包括的是一種商品包，它裝有包含本發(fā)明基因的轉(zhuǎn)基因植物的種子、合適的載體及其用于使植物產(chǎn)生廣譜病害抗性的標(biāo)記說明書，其中所述轉(zhuǎn)基因植物種子中包含本發(fā)明基因，其在所述轉(zhuǎn)化植物中的表達(dá)水平高于在野生型植物中的表達(dá)水平。
IV.病害抗性評價(jià)用本領(lǐng)域中公知的方法抗性病害抗性評價(jià)。參見Uknes等人(1993)；G_rlach等人(1996)；Alexander等人(1993)。例如，幾種有代表性的病害抗性測定如下所述。
實(shí)施例15寄生疫霉(黑脛病)抗性測定對如Alexander等人(1993)中所述生長的6周齡植物進(jìn)行黑脛病致病生物體寄生疫霉抗性測定。給植物澆水、排干水且然后通過給土壤施用10ml孢子囊混懸液(300孢子囊/ml)進(jìn)行接種。將接種的植物保存在維持在日溫度23-25℃和夜溫度20-22℃的溫室內(nèi)。本試驗(yàn)用枯萎指數(shù)如下0＝無癥狀；1＝無癥狀；1＝有一定枯萎征兆、膨脹度下降；2＝明顯的枯萎癥狀、但無腐爛或矮化；3＝明顯的枯萎癥狀、伴有矮化，但無明顯的莖腐爛；4＝嚴(yán)重枯萎、肉眼可見莖腐爛和一定的對根系的損害；5＝如4所述，但植物接近死亡或已經(jīng)死亡并伴有根系的嚴(yán)重減少。在對以隨機(jī)設(shè)計(jì)方式排列的植物全盲的情況下取得全部測定得分。實(shí)施例16丁香假單胞菌抗性測定給幾種6-7周齡植物的兩個(gè)下部的葉子注入濃度為106或3×106/ml水溶液的丁香假單胞菌變種煙草野火病假單胞菌(Pseuodomonas syringae pv.tabaci)菌株#551。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)評價(jià)6株單獨(dú)的植物。給煙草野火病假單胞菌感染的植物定為5點(diǎn)病害嚴(yán)重等級5＝100％死亡的組織；0＝無癥狀。對每天的評價(jià)結(jié)果進(jìn)行T-檢驗(yàn)(LSD)并在平均病害等級值后顯示分型。在評價(jià)當(dāng)天后面跟著相同字母的數(shù)值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著差異。
實(shí)施例17煙草尾孢抗性測定將煙草尾孢(ATCC#18366)的孢子混懸液(100,000-150,000個(gè)孢子/ml)噴灑在葉表面的緊急溢放口上。將植物維持在100％濕度下5天。此后給植物噴水霧、每天5-10次。在各時(shí)間點(diǎn)處評價(jià)6株單獨(dú)的植物。給煙草尾孢定級為顯示病害主要癥狀的葉面積百分比a％。對每天的評價(jià)結(jié)果進(jìn)行T-檢驗(yàn)(LSD)并在平均病害等級值后顯示分型。在評價(jià)當(dāng)天后面跟著相同字母的數(shù)值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著差異。
實(shí)施例18寄生霜霉抗性測定對如Uknes等人(1993)中所述的植物進(jìn)行寄生霜霉抗性測定。通過噴灑分生孢子混懸液(大約5×104個(gè)孢子/毫升)給植物接種寄生霜霉的相容分離物。在17℃下的生長室內(nèi)的濕度下通過14小時(shí)-日/10小時(shí)-夜循環(huán)培養(yǎng)接種植物。在有分生孢子梗存在的情況下接種后的3-14天、優(yōu)選7-12天時(shí)檢查植物。此外，隨機(jī)選擇經(jīng)各種處理的幾種植物并用乳酚-錐蟲藍(lán)染色(Keogh等人，1980)以便于鏡檢。
上述公開的實(shí)施方案是解釋性的。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說本發(fā)明的該公開內(nèi)容僅是本發(fā)明許多變化形式的一部分。所有這類顯而易見和可預(yù)測的變化形式均包括在權(quán)利要求中。
序列表中序列的簡要描述SEQ ID NO1-來自煙草的NIM1同源物的全長cDNA序列。SEQ ID NO2-由SEQ ID NO1編碼的煙草NIM1同源物的蛋白質(zhì)序列。SEQ ID NO3-來自番茄的NIM1同源物的全長cDNA序列。SEQ ID NO4-由SEQ ID NO3編碼的番茄NIM1同源物的蛋白質(zhì)序列。SEQ ID NO5-來自歐洲油菜的NIM1同源物的部分cDNA序列。SEQ ID NO6-由SEQ ID NO5編碼的歐洲油菜NIM1同源物的部分蛋白質(zhì)序列。SEQ ID NO7-來自鼠耳芥的NIM1同源物(AtNMLc5)的全長cDNA序列。SEQ ID NO8-由SEQ ID NO7編碼的鼠耳芥NIM1同源物AtNMLc5的全長蛋白質(zhì)序列。SEQID NO9-14-實(shí)施例1-4中使用的寡核苷酸引物。SEQ ID NO15-來自鼠耳芥的NIM1同源物(AtNMLc2)的基因組DNA序列。SEQ ID NO16-由SEQ ID NO15編碼的鼠耳芥NIM1同源物AtNMLc2的蛋白質(zhì)序列。SEQ ID NO17-來自鼠耳芥的NIM1同源物(AtNMLc4-1)的基因組DNA序列。SEQ ID NO18-由SEQ ID NO17編碼的鼠耳芥NIM1同源物AtNMLc4-1的蛋白質(zhì)序列。SEQID NO19-來自鼠耳芥的NIM1同源物(AtNMLc4-2)的基因組DNA序列。SEQ ID NO20-由SEQ ID NO19編碼的鼠耳芥NIM1同源物AtNMLc4-2的蛋白質(zhì)序列。SEQ ID NO21-PCR引物NIM 1A。SEQ ID NO22-PCR引物NIM 1B。SEQ ID NO23-PCR引物NIM 1C。SEQ ID NO24-PCR引物NIM 1D。SEQ ID NO25-PCR引物NIM 2A。SEQ ID NO26-PCR引物NIM 2B。SEQ ID NO27-PCR引物NIM 2C。SEQ ID NO28-PCR引物NIM 2D。SEQ ID NO29-由煙草(煙草A)擴(kuò)增的659bp NIM-樣DNA片段，它是36個(gè)序列的共有區(qū)且與鼠耳芥NIM1基因序列具有67％的序列同一性。SEQ ID NO30-由SEQ ID NO29編碼的蛋白質(zhì)序列。SEQ ID NO31-由煙草(煙草B)擴(kuò)增的498bp NIM-樣DNA片段，它是2個(gè)序列的共有區(qū)且與鼠耳芥NIM1基因序列具有62％的序列同一性。SEQ ID NO32-由SEQ ID NO31編碼的蛋白質(zhì)序列。SEQ ID NO33-由煙草(煙草C)擴(kuò)增的498bp NIN-樣DNA片段，它是3個(gè)序列的共有區(qū)且與鼠耳芥NIM1基因序列具有63％的序列同一性。SEQ ID NO34-由SEQ ID NO33編碼的蛋白質(zhì)序列。SEQ ID NO35-由煙草(煙草D)擴(kuò)增的399bp NIM-樣DNA片段，它與鼠耳芥NIM1基因序列具有59％的序列同一性。SEQ ID NO36-由SEQ ID NO35編碼的蛋白質(zhì)序列。SEQ ID NO37-由番茄(番茄A)擴(kuò)增的498bp NIM-樣DNA片段，它是8個(gè)序列的共有區(qū)且與鼠耳芥NIM1基因序列具有63％的序列同一性。SEQ ID NO38-由SEQ ID NO37編碼的蛋白質(zhì)序列。SEQ ID NO39-由甜菜(Beta vulgaris)擴(kuò)增的498bp NIM-樣DNA片段，它是24個(gè)序列的共有區(qū)且與鼠耳芥NIM1基因序列具有66％的序列同一性。SEQ ID NO40-由SEQ ID NO39編碼的蛋白質(zhì)序列。SEQ ID NO41-由向日葵(向日葵A)擴(kuò)增的498bp NIM-樣DNA片段，它是9個(gè)序列的共有區(qū)且與鼠耳芥NIM1基因序列具有61％的序列同一性。SEQ ID NO42-由SEQ ID NO41編碼的蛋白質(zhì)序列。SEQ ID NO43-由向日葵(向日葵B)擴(kuò)增的498bp NIM-樣DNA片段，它是10個(gè)序列的共有區(qū)且與鼠耳芥NIM1基因序列具有59％的序列同一性。SEQ ID NO44-由SEQ ID NO43編碼的蛋白質(zhì)序列。SEQ ID NO45-由馬鈴薯(馬鈴薯A)擴(kuò)增的653bp NIM-樣DNA片段，它是15個(gè)序列的共有區(qū)且與鼠耳芥NIM1基因序列具有68％的序列同一性。SEQ ID NO46-由SEQ ID NO45編碼的蛋白質(zhì)序列。SEQ ID NO47-由馬鈴薯(馬鈴薯B)擴(kuò)增的498bp NIM-樣DNA片段，它是3個(gè)序列的共有區(qū)且與鼠耳芥NIM1基因序列具有61％的序列同一性。SEQ ID NO48-由SEQ ID NO47編碼的蛋白質(zhì)序列。SEQ ID NO49-由馬鈴薯(馬鈴薯C)擴(kuò)增的477bp NIM-樣DNA片段，它是2個(gè)序列的共有區(qū)且與鼠耳芥NIM1基因序列具有62％的序列同一性。SEQ ID NO50-由SEQ ID NO49編碼的蛋白質(zhì)序列。SEQ ID NO51-由歐洲油菜(Canola A)擴(kuò)增的501bp NIM-樣DNA片段，它是5個(gè)序列的共有區(qū)且與鼠耳芥NIM1基因序列具有59％的序列同一性。SEQ ID NO52-由SEQ ID NO51編碼的蛋白質(zhì)序列。SEQ ID NO53-由歐洲油菜(Canola B)擴(kuò)增的501bp NIM-樣DNA片段，它是5個(gè)序列的共有區(qū)且與鼠耳芥NIM1基因序列具有58％的序列同一性。SEQ ID NO54-由SEQ ID NO53編碼的蛋白質(zhì)序列。SEQ ID NO55-由歐洲油菜(Canola C)擴(kuò)增的498bp NIM-樣DNA片段，它與鼠耳芥NIM1基因序列具有56％的序列同一性。SEQ ID NO56-由SEQ ID NO55編碼的蛋白質(zhì)序列。SEQ ID NO57-由歐洲油菜(Canola D)擴(kuò)增的498bp NIM-樣DNA片段，它與鼠耳芥NIM1基因序列具有73％的序列同一性。SEQ ID NO58-由SEQ ID NO57編碼的蛋白質(zhì)序列。SEQ ID NO59-PCR引物NIM 3A。SEQ ID NO60-PCR引物NIM 3B。SEQ ID NO61-由番茄(番茄B)擴(kuò)增的148bp NIM-樣DNA片段，它是3個(gè)序列的共有區(qū)且與鼠耳芥NIM1基因序列具有72％的序列同一性。SEQ ID NO62-由SEQ ID NO61編碼的蛋白質(zhì)序列。SEQ ID NO63-來自甜菜(Beta vulgaris)的NIM1同源物的全長cDNA序列，它與SEQ ID NO39的PCR片段一致。SEQ ID NO64-由SEQ ID NO62編碼的甜菜NIM1同源物的蛋白質(zhì)序列。SEQ ID NO65-來自向日葵(向日葵B)的NIM1同源物的全長cDNA序列，它與SEQ ID NO43的PCR片段一致。SEQ ID NO66-由SEQ ID NO65編碼的向日葵NIM1同源物的蛋白質(zhì)序列。SEQ ID NO67-與鼠耳芥NIM-樣基因組序列AtNMLc2(SEQ ID NO15)一致的cDNA序列。SEQ ID NO68-由SEQ ID NO67編碼的蛋白質(zhì)序列。SEQ ID NO69-與鼠耳芥NIM-樣基因組序列AtNMLc4-1(SEQ ID NO17)一致的cDNA序列。SEQ ID NO70-由SEQ ID NO69編碼的蛋白質(zhì)序列。SEQ ID NO71-與鼠耳芥NIM-樣基因組序列AtNMLc4-2(SEQ ID NO19)一致的cDNA序列。SEQ ID NO72-由SEQ ID NO71編碼的蛋白質(zhì)序列。SEQ ID NO73-來自煙草(煙草B)的NIM1同源物的全長cDNA序列，它與SEQ ID NO31的PCR片段一致。SEQ ID NO74-由SEQ ID NO73編碼的煙草NIM1同源物的蛋白質(zhì)序列。寄存根據(jù)有關(guān)國際公認(rèn)的用于專利程序目的的微生物寄存布達(dá)佩斯條約，已經(jīng)將下列材料寄存在Agricultural Research Service，PatentCulture Collection(NRRL)，1815 North University Street，Peoria，lllinois 61604，USA。對所寄存材料的可得到性的所有限制在專利授權(quán)后最終將被取消。
克隆 保藏號 寄存日pNOV1203 NRRL B-30049 1998年8月17日pNOV1204NRRL B-300501998年8月17日pNOV1206NRRL B-300511998年8月17日AtNMLc5 NRRL B-301391999年5月25日參考文獻(xiàn)本文引入的參考文獻(xiàn)表示本領(lǐng)域中目前的狀況。將下列各文獻(xiàn)引入本公開說明書中作為參考。
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aag ctt ctt ttg acc gag 49Ala Leu Asp Ser Asp Asp Val Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Thr Glu1 5 10 15tca gat atc act cta gat gaa gcc aat ggt ctg cat tac tca gtg gtg 97Ser Asp Ile Thr Leu Asp Glu Ala Asn Gly Leu His Tyr Ser Val Val20 25 30tat agt gat ccc aaa gtt gtt gca gag ata ctt gcc ctt ggt tta ggt 145Tyr Ser Asp Pro Lys Val Val Ala Glu Ile Leu Ala Leu Gly Leu Gly35 40 45gat gtc aat cac aga aac tca cgt ggc tac tcg gtt ctt cat ttc gct 193Asp Val Asn His Arg Asn Ser Arg Gly Tyr Ser Val Leu His Phe Ala50 55 60gcc atg cgt aga gag cct tcc atc atc ata tct ctt ctc aag gaa ggc 241Ala Met Arg Arg Glu Pro Ser Ile Ile Ile Ser Leu Leu Lys Glu Gly65 70 75 80gcc aat gcg tct agc ttc act ttt gat gga cgc agt gcg gtt aat ata 289Ala Asn Ala Ser Ser Phe Thr Phe Asp Gly Arg Ser Ala Val Asn Ile85 90 95tgt agg aga ctg aca act cca aag gat tat cat aca aag aca tcc aaa 337Cys Arg Arg Leu Thr Thr Pro Lys Asp Tyr His Thr Lys Thr Ser Lys100 105 110aag agg gaa gct agt aaa gca agg ctg tgc ata gat ctc ttg gaa aga 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2673<210>74<211>369<212>PRT<213>煙草<400>74Met Ala Cys Ser Ala Glu Pro Ser Ser Ser Ile Ser Phe Thr Ser Ser1 5 10 15Ser Ile Thr Ser Asn Gly Ser Ile Gly Val Gly Gln Asn Thr His Ala20 25 30Tyr Gly Gly Ser Glu Thr Gly Ser Ser Tyr Glu Ile Ile Ser Leu Ser35 40 45Lys Leu Ser Asn Asn Leu Glu Gln Leu Leu Ser Asp Ser Ser Ser Asp50 55 60Phe Thr Asp Ala Glu Ile Val Val Glu Gly Val Ser Leu Gly Val His65 70 75 80Arg Cys Ile Leu Ala Ala Arg Ser Lys Phe Phe Gln Asp Leu Phe Arg85 90 95Lys Glu Lys Gly Ser Cys Gly Lys Glu Gly Lys Pro Arg Tyr Ser Met100 105 110Thr Asp Ile Leu Pro Tyr Gly Lys Val Gly Tyr Glu Ala Phe Val Thr
115 120 125Phe Leu Ser Tyr Leu Tyr Ser Gly Lys Leu Lys His Phe Pro Pro Glu130 135 140Val Ser Thr Cys Met Asp Thr Ile Cys Ala His Asp Ser Cys Arg Pro145 150 155 160Ala Ile Asn Phe Ser Val Glu Leu Met Tyr Ala Set Ser Met Phe Gln165 170 175Val Pro Glu Leu Val Ser Leu Phe Leu Arg Arg Leu Ile Asn Phe Val180 185 190Gly Lys Ala Leu Val Glu Asp Val Ile Pro Ile Leu Arg Val Ala Phe195 200 205His Cys Gln Leu Ser Glu Leu Leu Thr His Ser Val Asp Arg Val Ala210 215 220Arg Ser Asp LeuGlu Ile Thr Cys Ile Glu Lys Glu Val Pro Phe Glu225230 235 240Val Ala Glu Asn Ile Lys Leu Leu Trp Pro Lys Cys Gln Val Asp Glu245 250 255Ser Lys Val Leu Pro Val Asp Pro Leu His Glu Lys Arg Lys Asn Arg260 265 270Ile Tyr Lys Ala Leu Asp Ser Asp Asp Val Glu Leu Val Lys Leu Leu275 280 285Leu Ser Glu Ser Asn Ile Ser Leu Asp Glu Ala Tyr Ala Leu His Tyr290 295 300Ala Val Ala Tyr Cys Asp Pro Lys Val Val Thr Glu Val Leu Gly Leu305 310 315 320Gly Val Ala Asp Val Asn Leu Arg Asn Thr Arg Gly Tyr Thr Val Leu325 330 335His Ile Ala Ser Met Arg Lys Glu Pro Ala Val Ile Val Ser Leu Leu340 345 350Thr Lys Gly Ala Arg Ala Ser Glu Thr Thr Leu Asp Gly Gln Ser Ala355 360 365Val
權(quán)利要求
1.一種分離的核酸分子，它包括(a)編碼SEQ ID NO2、4、6、8、16、18、20、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、62、64、66、68、70、72或74的核苷酸序列；(b)SEQ ID NO1、3、5、7、15、17、19、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、61、63、65、67、69、71或73；(c)包括在序列中與SEQ ID NO1、3、5、7、15、17、19、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、61、63、65、67、69、71或73中的至少20個(gè)連續(xù)堿基對部分相同的至少20個(gè)連續(xù)堿基對部分的核苷酸序列；(d)可以使用應(yīng)用表示為SEQ ID NO9和10、SEQ ID NO21和24、SEQ ID NO22和24、SEQ ID NO25和28、SEQ ID NO26和28或SEQ ID NO59和60的引物對的聚合酶鏈反應(yīng)從番茄DNA文庫擴(kuò)增的核苷酸序列；(e)可以使用應(yīng)用表示為SEQ ID NO22和24或SEQ ID NO26和28的引物對的聚合酶鏈反應(yīng)從甜菜DNA文庫擴(kuò)增的核苷酸序列；(f)可以使用應(yīng)用表示為SEQ ID NO26和28的引物對的聚合酶鏈反應(yīng)從向日葵DNA文庫擴(kuò)增的核苷酸序列；(g)可以使用應(yīng)用表示為SEQ ID NO21和24、SEQ ID NO21和23、SEQ ID NO22和24、SEQ ID NO25和28或SEQ ID NO26和28的引物對的聚合酶鏈反應(yīng)從馬鈴薯DNA文庫擴(kuò)增的核苷酸序列；(h)可以使用應(yīng)用表示為SEQ ID NO9和10或SEQ ID NO26和28的引物對的聚合酶鏈反應(yīng)從歐洲油菜DNA文庫擴(kuò)增的核苷酸序列；(i)可以使用應(yīng)用表示為SEQ ID NO13和14、SEQ ID NO21和24或SEQ ID NO22和24的引物對的聚合酶鏈反應(yīng)從鼠耳芥DNA文庫擴(kuò)增的核苷酸序列；(j)可以使用應(yīng)用表示為SEQ ID NO9和10、SEQ ID NO11和12、SEQ ID NO21和24、SEQ ID NO22和24、SEQ ID NO25和28或SEQ ID NO26和28的引物對的聚合酶鏈反應(yīng)從煙草DNA文庫擴(kuò)增的核苷酸序列；或(k)可以使用應(yīng)用引物對的聚合酶鏈反應(yīng)從植物DNA文庫擴(kuò)增的核苷酸序列，所述的引物對包括SEQ ID NO1、3、5、7、15、17、19、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、61、63、65、67、69、71或73編碼序列(CDS)的前20個(gè)核苷酸和最后20個(gè)核苷酸的反向補(bǔ)體。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1的分離的核酸分子，它包括編碼SEQ IDNO2、4、6、8、16、18、20、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、62、64、66、68、70、72或74的核苷酸序列。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1的分離的核酸分子，它包括SEQ ID NO1、3、5、7、15、17、19、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、61、63、65、67、69、71或73。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1的分離的核酸分子，它包括一種核苷酸序列，該核苷酸序列包括在序列中與SEQ ID NO1、3、5、7、15、17、19、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、61、63、65、67、69、71或73中的至少20個(gè)連續(xù)堿基對部分相同的至少20個(gè)連續(xù)堿基對部分。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求1的分離的核酸分子，它包括可以使用應(yīng)用表示為SEQ ID NO9和10、SEQ ID NO21和24、SEQ ID NO22和24、SEQ ID NO25和28、SEQ ID NO26和28或SEQ ID NO59和60的引物對的聚合酶鏈反應(yīng)從番茄DNA文庫擴(kuò)增的核苷酸序列。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求1的分離的核酸分子，它包括可以使用應(yīng)用表示為SEQ ID NO22和24或SEQ ID NO26和28的引物對的聚合酶鏈反應(yīng)從甜菜DNA文庫擴(kuò)增的核苷酸序列；
7.一種根據(jù)權(quán)利要求1的分離的核酸分子，它包括可以使用應(yīng)用表示為SEQ ID NO26和28的引物對的聚合酶鏈反應(yīng)從向日葵DNA文庫擴(kuò)增的核苷酸序列；
8.一種根據(jù)權(quán)利要求1的分離的核酸分子，它包括可以使用應(yīng)用表示為SEQ ID NO21和24、SEQ ID NO21和23、SEQ ID NO22和24、SEQ ID NO25和28或SEQ ID NO26和28的引物對的聚合酶鏈反應(yīng)從馬鈴薯DNA文庫擴(kuò)增的核苷酸序列；
9.一種根據(jù)權(quán)利要求1的分離的核酸分子，它包括可以使用應(yīng)用表示為SEQ ID NO9和10或SEQ ID NO26和28的引物對的聚合酶鏈反應(yīng)從歐洲油菜DNA文庫擴(kuò)增的核苷酸序列；
10.一種根據(jù)權(quán)利要求1的分離的核酸分子，它包括可以使用應(yīng)用表示為SEQ ID NO13和14、SEQ ID NO21和24或SEQ ID NO22和24的引物對的聚合酶鏈反應(yīng)從鼠耳芥DNA文庫擴(kuò)增的核苷酸序列；
11.一種根據(jù)權(quán)利要求1的分離的核酸分子，它包括可以使用應(yīng)用表示為SEQ ID NO9和10、SEQ ID NO11和12、SEQ ID NO21和24、SEQ ID NO22和24、SEQ ID NO25和28或SEQ ID NO26和28的引物對的聚合酶鏈反應(yīng)從煙草DNA文庫擴(kuò)增的核苷酸序列。
12.一種根據(jù)權(quán)利要求1的分離的核酸分子，它包括可以使用應(yīng)用引物對的聚合酶鏈反應(yīng)從植物DNA文庫擴(kuò)增的核苷酸序列，所述的引物對相當(dāng)于SEQ ID NO1、3、5、7、15、17、19、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、61、63、65、67、69、71或73編碼序列(CDS)的前20個(gè)核苷酸和最后20個(gè)核苷酸的反向補(bǔ)體。
13.一種包括在植物中具有活性的與上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的核酸分子可操作地連接的啟動(dòng)子的嵌合基因。
14.一種包括權(quán)利要求13所述的嵌合基因的重組載體。
15.一種包括權(quán)利要求13所述的嵌合基因的宿主細(xì)胞。
16.一種包括權(quán)利要求13所述的嵌合基因的植物。
17.權(quán)利要求16所述的植物，它選自下列植物水稻、小麥、大麥、黑麥、玉米、馬鈴薯、canola、向日葵、胡蘿卜、甘薯、甜菜、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、甘藍(lán)、花椰菜、嫩莖花椰菜、蕪菁、蘿卜、菠菜、蘆筍、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、南瓜、南瓜、黃瓜、蘋果、梨、溫柏、甜瓜、洋李、櫻桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、鳳梨、鱷梨、番瓜、杧果、香蕉、大豆、煙草、番茄、高粱和糖甘蔗。
18.來自權(quán)利要求16的植物的種子。
19.一種增加植物中SAR基因表達(dá)的方法，該方法包括在所述植物中表達(dá)權(quán)利要求13所述的嵌合基因。
20.一種提高植物中病害抗性的方法，該方法包括在所述植物中表達(dá)權(quán)利要求13所述的嵌合基因。
21.一種PCR引物，它選自SEQ ID NO9-14、21-28、59和60組成的組。
22.一種用于分離與可導(dǎo)致植物中系統(tǒng)獲得性抗性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)相關(guān)的NIM1同源物的方法，該方法包括使用應(yīng)用引物對的聚合酶鏈反應(yīng)從植物DNA文庫擴(kuò)增DNA分子，所述的引物對相當(dāng)于SEQ ID NO1、3、5、7、15、17、19、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、61、63、65、67、69、71或73編碼序列(CDS)的前20個(gè)核苷酸和最后20個(gè)核苷酸的反向補(bǔ)體；或所述的引物對表示為SEQ ID NO9和10、SEQ ID NO11和12、SEQ ID NO13和14、SEQ ID NO21和24、SEQ ID NO22和24、SEQ ID NO21和23、SEQID NO25和28、SEQ ID NO26和28或SEQ ID NO59和60。
23.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的植物DNA文庫是煙草、番茄、歐洲油菜、鼠耳芥、甜菜、向日葵或馬鈴薯的DNA文庫。
全文摘要
本發(fā)明涉及從煙草(Nicotiana tabacum)、番茄(Lycopericon esculentum)、歐洲油菜(Brassica napus)、鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)、甜菜(Beta vulgaris)、向日葵(Helianthusannuus)和馬鈴薯(Solanum tuberosum)中分離與可導(dǎo)致系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)相關(guān)的鼠耳芥屬NIM1基因同源物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)NIM1同源物以便增加SAR基因表達(dá)并提高廣譜病害抗性的轉(zhuǎn)化載體和方法。
文檔編號A01P21/00GK1355847SQ00806161
公開日2002年6月26日 申請日期2000年3月7日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月9日
發(fā)明者J·M·薩爾米隆, L·J·威斯羅, M·G·威利茲, T·曼吉斯特 申請人:辛根塔參與股份公司