專利名稱：：包括hccr-1的乳腺癌預后標志物和誘導肥胖的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及乳腺癌標志物和/或誘導肥胖的組合物，其中所述標志物和所述組合物包括HCCR-1。
背景技術(shù)：
：乳腺癌的預后主要通過存在腋窩下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移來確定。然而，自局灶或局部治療10年后，在大約三分之一淋巴結(jié)陰性的女性乳腺癌患者中乳腺癌復發(fā)，并且在三分之一淋巴結(jié)陽性的患者中不復發(fā)。近年來，在早期診斷出的乳腺癌的比例在不斷增加。通常對這些患者進行的全身治療經(jīng)常引起治療過度。根據(jù)St.Gallen和NIH的共識，在I期和II期大約7080%的患者不顯示遠處轉(zhuǎn)移，不需要輔助治療，并且可能一直遭受副作用的痛苦。這個事實表明需要更靈敏的和特異的預后分析，該分析能夠顯著地減少接受不必要治療的患者的數(shù)量。在一些研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)腫瘤大小、或淋巴結(jié)或血管侵襲具有重要的預后價值。諸如核型、DNA含量和增殖活性的定量病理學特征使得能夠區(qū)分具有高微轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤。即使影響患者結(jié)果的已知分子的遺傳改變包括Her2/NEU過表達、DNA擴增、p53突變、ER/PR狀態(tài)等等，由于轉(zhuǎn)移級聯(lián)牽涉許多復雜步驟，因此僅采用這些因素仍不足以對預后進行評估。當開發(fā)諸如用于高脂血癥的食療食品或飲料或療法的產(chǎn)品時，誘導肥胖實驗小鼠和類似動物也可用來用作評價這些產(chǎn)品的功效所必需的誘導肥胖小鼠和類似動物。
發(fā)明內(nèi)容根據(jù)上述觀點作出本發(fā)明。因此，本發(fā)明的目的是提供乳腺癌的預后標志物。本發(fā)明的另一目的是提供誘導肥胖的組合物。為了達到上述目的，本發(fā)明提供了用作乳腺癌預后標志物的組合物，3其中所述組合物包括HCCR-1蛋白。對于本發(fā)明，優(yōu)選所述組合物進一步包括選自但不限于ER、PR、p53基因型和HER2蛋白的一種或多種藥劑。對于本發(fā)明，所述HCCR-1蛋白也可能是與包括如SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列的蛋白基本上等同的任意蛋白。在上下文中，"基本上等同"是指通過SEQIDNO:1中所示的蛋白序列的某些部分的取代、缺失、添加等而已經(jīng)突變但保留了HCCR-1的特性的任意蛋白及其片段。本發(fā)明也提供了誘導肥胖的組合物，其中所述組合物包括HCCR-1蛋白。本發(fā)明也提供了已經(jīng)用HCCR-1蛋白轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因肥胖非人哺乳動物。在本發(fā)明中，所述動物優(yōu)選但不限于，選自小鼠、大鼠、兔、綿羊、牛、山羊和豬的轉(zhuǎn)基因肥胖非人哺乳動物。所述HCCR-1蛋白可能是與包括如SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列的蛋白基本上等同的任意蛋白。在上下文中，"基本上等同"旨在包括通過SEQIDNO:1中所示的蛋白序列的某些部分的取代、缺失、添加等而已經(jīng)突變但保留了HCCR-1的特性的任意蛋白及其片段。下面將詳細地描述本發(fā)明。圖1顯示了HCCR-1表達以及HCCR-1和ApoE之間的關(guān)系。(a)人乳腺癌的ER、PR、HER2、p53和HCCR-1表達的免疫組織化學染色。所有乳腺癌阻滯來源于經(jīng)病理學證實的浸潤性導管癌。癌細胞顯示在核中ER、PR和p53的免疫染色陽性，并且在細胞質(zhì)中HCCR-1的免疫染色陽性(上部圖板)。HER2免疫組織化學染色顯示了癌細胞的完全的、強的膜染色(3+)(上部圖板)。在乳腺癌中ER、PR、p53、HER2和HCCR-1的免疫染色陰性(下部圖板)。底片放大倍數(shù)，X100。(b)HCCR-1和ApoE之間的蛋白相互作用。HCCR-1結(jié)合ApoE(左側(cè)圖板)，并且ApoE結(jié)合HCCR-1(右側(cè)圖板)。從產(chǎn)生HCCR-1和ApoE的轉(zhuǎn)染MCF-7細胞執(zhí)行免疫共沉淀。使用抗-V5mAb或抗-MycmAb進行免疫沉淀。分別用抗-MycmAb和抗-V5mAb檢測沉淀物中的蛋白。(c)在MCF-7細胞中HCCR-1和ApoE的定位和共存。c代表原生質(zhì)，N代表核，并且M代表線粒體。HCCR-1(上部圖板)及其結(jié)合蛋白ApoE(下部圖板)的亞細胞定位。設(shè)計cDNA構(gòu)建物使得V5(上部圖板)和c-Myc(下部圖板)分別被標記至HCCR-1和ApoE,上。電壓依從性陰離子通道l(VDAC1)用作線粒體標志物。(d)熒光顯微鏡。采用LipofectAMINE2000(Invitrogen，Carlsbad,CA)使用pEGFP-HCCR-l和pEGFP-ApoE瞬時轉(zhuǎn)染細胞。然后，細胞與25nMMitoTrackerOrange(MolecularProbes,Eugene,OR)—起孵育。對于GFP染色，使用ProLongGoldAntifadeReagents(MolecularProbes,Eugene,OR)固定細胞。使用Bio-RadMRC-1024MP激光掃描共聚焦顯樣i鏡(Bio-Rad,Hercules,CA)分析熒光圖像。圖2顯示在乳腺癌組織中HCCR-1和ApoE是相互調(diào)節(jié)的。在人乳腺組織和細胞系中HCCR-l(a)和ApoE(b)的表達譜。在乳腺癌細胞系(BT-474,MCF-7和MDA-MB-231)、新鮮的原發(fā)性乳腺癌組織及其相應的正常細胞或組織中HCCR-1mRNA的表達的比較。'N，代表正常乳腺組織，并且'C，代表原發(fā)性乳腺癌組織。人p肌動蛋白cDNA用作對照探針(下部圖板)。(c,d)人組織和細胞系中ApoE的表達語。用;j丈射標記的ApoEcDNA(上部圖板)或用人(3肌動蛋白cDNA對照探針(下部圖板)探測人癌細胞系多重Northern印跡(c)或正常的12-道多組織Northern印跡(d)。(e,f)這些圖片顯示ApoE在乳腺癌中的作用是腫瘤抑制因子。(e)此圖顯示了ApoE在MCF-7乳腺癌細胞中的生長抑制作用。顯示了在用僅載體、HCCR-1和ApoE轉(zhuǎn)染，以及共轉(zhuǎn)染后MCF-7細胞的存活率。數(shù)據(jù)表示在孵育10天期間活細胞的數(shù)量，并且代表三次實驗的均數(shù)士標準差。(f)在乳腺癌細胞中ApoEcDNA轉(zhuǎn)染誘導凋亡。來自用僅載體、HCCR-1和ApoE轉(zhuǎn)染，以及用后兩種基因共轉(zhuǎn)染的細胞的DNA進行電泳分析。用載體或基因轉(zhuǎn)染的細胞將育1、3、5和7天。在2%瓊脂糖凝膠中分析DNA,并且用溴化乙咬染色。(g,h)由MCF-7細胞分泌的ApoE。通過ELISA法測量來自MCF-7細胞的ApoE。結(jié)果代表三次實驗的均數(shù)士標準差。使用市售試劑盒(MBLApoE4/Pan-ApoEELISA試劑盒，MBLCo.,Woburn,MA)通過夾心ELISA法測定ApoE濃度。使用MBLApoE4/Pan-ApoEELISA試劑盒(MBLCo.,Woburn,MA)通過夾心ELISA法測定人Pan-ApoE(g)或ApoE4(li)。圖3顯示在HCCR-1轉(zhuǎn)基因肥胖小鼠中的表型分析以及HCCR-1和ApoE的表達譜。(a)轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生。使用標準原核顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠。對于顯微注射，轉(zhuǎn)基因片段，CMV-HCCR-l-bGH被顯微注射進來自C57BL/6N(CharlesRiverJapan)的單細胞期受精胚胎的原核中。轉(zhuǎn)基因(T/G)雄性和非-T/G對照雄性小鼠(左側(cè)圖板)。T/G雌性和非-T/G對照雌性小鼠(右側(cè)圖板)。(b)來自肥胖和對照小鼠的腹膜、肝臟、胰腺和心臟的蘇木素-伊紅(HE)染色。雄性T/G肥胖小鼠(上部圖板)、雌性T/G肥胖小鼠(中間圖板)和對照非-T/G小鼠(下部圖板)。底片放大倍數(shù)，X200。(c)在肥胖和對照小鼠的各個器官中ApoE和HCCR-l的表達水平。使用抗人類器官ApoE的氨基酸126-191的ApoE(A1.4)小鼠單克隆抗體(SantaCmzbiotechnology)。(d)在肥胖和對照小鼠中ApoE、瘦素(leptin)、膽固醇、甘油三酯、胰島素和葡萄糖的血清水平。結(jié)杲代表三次實驗的均數(shù)士標準差。具體實施例方式在30個原發(fā)性侵襲性乳腺導管癌中HCCR-1與其他已知的預后標志物諸如類固醇受體(ER和PR)的表達水平、p53突變體和較高的HER2活性的正相關(guān)性進一步證實了HCCR-1作為乳腺癌的預后因子的價值。HCCR-1的表達也抑制ApoE的分泌。與此相一致的是，靶向HCCR-1的合成siRNA阻斷了HCCR-1對ApoE分泌的抑制作用。因此，與脂質(zhì)代謝的主要調(diào)節(jié)劑ApoE相互作用的HCCR-1，誘發(fā)了轉(zhuǎn)基因小鼠品系中的肥胖癥。肥胖小鼠的重量約為正常小鼠的3倍。盡管肥胖小鼠顯示ApoE或瘦素沒有增加，但它們顯示嚴重的高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥和血內(nèi)胰島素不足。肥胖小鼠還具有腹膜、肝臟、胰腺和心臟方面的病理問題。因此，HCCR-1的表達可與已知的預后因子結(jié)合被用作新的預后標志物。HCCR-1經(jīng)物理相互作用負調(diào)節(jié)ApoE的功能，并且與ApoE相互作用的HCCR-1通過抑制ApoE的降膽固醇活性來誘導肥胖。為了了解是否在原發(fā)性乳腺癌中HCCR-1蛋白的表達與其他生物標志物諸如ER、PR、p53基因型和HER2狀態(tài)有聯(lián)系，本發(fā)明的發(fā)明人對30個乳腺癌組織圖板以及其正常的對應組織測定了HCCR-1水平(表1和圖la)。觀察到HCCR-1的表達水平以下列順序增加具有(￡11+/11+/突變型p53/高水平HER2)的乳腺癌組織、具有(￡11+/11+/野生型p53/中等水平HER2)的乳腺癌組織以及具有(￡11+/11+/野生型p53/低水平HER2)的乳腺癌組織(表l和圖la;上部圖板)。在具有(￡11-/^*53-/低水平HER2)的乳腺癌組織中沒有檢測到HCCR-1(表l和圖la;下部圖板)。因此，這些結(jié)果表明HCCR-1的表達可用來預測乳腺癌的預后。[表l]<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>在上表中，所有乳腺癌組織均來自經(jīng)病理證實的侵襲性導管癌。在酵母雙雜交篩選中鑒定的HCCR-1和ApoE在體外通過免疫沉淀進行確認(圖lb)。為了通過免疫共沉淀實驗確認HCCR-1和ApoE之間的相互作用，本發(fā)明的發(fā)明人將ApoE-Myc融合構(gòu)建物轉(zhuǎn)染進表達融合了V5標記的HCCR-1的MCF-7細胞中。在共轉(zhuǎn)染的MCF-7細胞中，HCCR-1蛋白特異性地與ApoE—起被免疫共沉淀(圖lb)。而且，在MCF-7細胞溶胞產(chǎn)物中也表達HCCR-1和ApoE蛋白，其中所述MCF-7細胞已經(jīng)用HCCR-1和ApoE進行了轉(zhuǎn)染(圖1b)。這些結(jié)果證明ApoE與HCCR-1蛋白相互作用。本發(fā)明的發(fā)明人檢測了MCF-7細胞中HCCR-1的線粒體定位(圖lc)。另一方面，僅在細胞液部分中發(fā)現(xiàn)有ApoE(圖lc;下部圖板)。但，對其中有HCCR-1和ApoE共表達的MCF-7細胞的分組分析表明在線粒體組分中發(fā)現(xiàn)有這兩種蛋白，并且在細胞液中僅發(fā)現(xiàn)有極微量的ApoE(圖lc;下部圖板)。這些結(jié)果表明在共表達的細胞中，ApoE蛋白從細胞質(zhì)移行至線粒體；這些數(shù)據(jù)進一步證實了它們的相互作用。熒光圖像也顯示，HCCR-1存在于線粒體中(圖Id;上部圖板)，并且ApoE存在于細胞液中(圖Id;第二圖板)。為了進一步證實HCCR-1和ApoE在線粒體中的共存，共轉(zhuǎn)染的細胞用MitoTracker(紅)染色(圖ld)。染色的細胞用共聚焦顯微鏡進行分析。當細胞用HCCR-1和ApoE共轉(zhuǎn)染時，ApoE從細胞液遷移至線粒體(圖Id;下部圖板)。這些結(jié)果表明兩種蛋白共存于線粒體中。下一步，本發(fā)明的發(fā)明人研究了HCCR-1或ApoE在人類正常組織、癌組織和細胞系中的表達i普。Northern印跡分析顯示與正常組織相比，原發(fā)性乳腺癌組織的HCCR-1表達增加(圖23)。8丁-474(￡1^+/11+/突變型p53/到豐富的HCCR-1,而在MDA-MB-231(ER-/PR-/口53-/低水平HER2)細胞中沒有檢測到(圖2a)。在MCF-7細胞中HCCR-1的表達水平高于BT-474細胞(圖2a)。與HCCR-1在乳腺癌組織或細胞中的過度表達(圖2a)相反，其中觀察到的ApoE表達很少(圖2b)。在其他8個癌細胞系中也沒有檢測到ApoE表達(圖2c)。Northern印跡分析顯示，在12個被檢測的正常組織中僅在肝臟和腎臟中有特異性的ApoE高表達(圖2d)。為了確定ApoE的生長抑制作用，ApoE被轉(zhuǎn)染進乳腺癌細胞系中。與僅用載體轉(zhuǎn)染的對照細胞相比，ApoE轉(zhuǎn)染7天后導致了87%的生長抑制(圖2e)。另一方面，與僅用載體轉(zhuǎn)染的對照細胞相比，HCCR-1轉(zhuǎn)染的MCF-7細胞的生長速率7天后增加了45%(圖2e)。如果HCCR-l-轉(zhuǎn)染細胞用ApoE共轉(zhuǎn)染，則生長速率降低為66%(圖2e)。這種抑制作用與凋亡(如DNA斷裂)有關(guān)(圖2f)。在乳腺癌中ApoE的作用是肺瘤抑制因子，但如果HCCR-1過度表達則這種作用被逆轉(zhuǎn)(圖2e和2f)。8為了研究在MCF-7細胞中HCCR-1對ApoE分泌的作用，本發(fā)明的發(fā)明人進行了ApoE-轉(zhuǎn)染MCF-7細胞中Pan-ApoE分泌的比較。通過ApoE4/Pan-ApoEELISA試劑盒(MBL,Woburn，MA)測定細胞培養(yǎng)基中分泌的ApoE。此試劑盒基于夾心ELISA，并且能夠測定Pan-ApoE或ApoE4。與DMEM孵育24h后，收集在兩側(cè)的收集培養(yǎng)基以測定Pan-ApoE的濃度。在野生型細胞中發(fā)現(xiàn)小量的(28.4±0.1ng/ml)Pan-ApoE,而在轉(zhuǎn)染細胞中Pan-ApoE的量則增加(33.0士0.6ng/ml)(圖2g)(P<0.05)。使用HiPerformance算法(QiagenGmbH,Germany)設(shè)計的耙向HCCR-1的合成siRNA(HCCR-1siRNA2)在MCF-7乳腺癌細胞中誘導Pan-ApoE分泌(圖2h)。HCCR-1siRNA-2對應于HCCR-1的第5外顯子內(nèi)的579-600核苷酸，其分別在野生型MCF-7細胞和ApoE-轉(zhuǎn)染MCF-7細胞中誘導Pan-ApoE分泌(圖2h)。與對照的非沉默siRNA(33.0士0.3ng/ml)相比，HCCR1siRNA-2極大地增加了ApoE-轉(zhuǎn)染MCF-7細胞中的Pan-ApoE分泌(54.5±0.2ng/ml)(圖2h)(P<0.05)。在野生型MCF-7細胞中，HCCR-1siRNA-2轉(zhuǎn)染誘導Pan-ApoE大量的分泌(42.4士0.3ng/ml),而在對照siRNA轉(zhuǎn)染中的分泌則降低(28.3士0.3ng/ml)(圖2h)(P<0.05)。通過與諸如飲食的生活習慣，或肥胖癥，或生物因子相聯(lián)系，ApoE蛋白可調(diào)節(jié)乳腺癌的風險。肥胖癥正在全球性地急劇地增加。盡管肥胖癥引起或促進癌癥的機制隨著癌癥部位的變化而變化，但流行病學研究顯示在肥胖癥和許多類型癌癥之間存在一定的聯(lián)系。已知在絕經(jīng)后女性中肥胖癥增加乳腺癌發(fā)病率30-50%(Ballard-Barbash,etal.AmJClinNutr63(Suppl.3),437-441(1996);Trentham-Dietz,A.etal.AmJEpidemiol145,1011-1119(1997))。肥胖癥影響內(nèi)源性雌激素代謝和生物利用度，并因此影響乳腺癌的風險。在轉(zhuǎn)基因小鼠中HCCR-1誘發(fā)嚴重的肥胖癥。肥胖小鼠繁殖3代以上，其重量顯示是相同性別和年齡的小鼠的3倍(圖3a)。特別地，觀察到在雄性轉(zhuǎn)基因小鼠中(圖3a;左側(cè)圖板)比在同齡雌性轉(zhuǎn)基因小鼠中(圖3a;右側(cè)圖板)肥胖癥更為顯著。與同齡正常小鼠(24.5土1.0g)相比，雄性肥胖小鼠重量為62.2士3.7g(圖3;左側(cè)圖板)(P<0.0001)。在雌性肥胖小鼠(43.1士1.3g)和同齡正常小鼠(21.7士1.5g)之間也存在顯著的體重差異(圖3a;右側(cè)圖板)(P<0.0001)。肥胖小鼠顯示的病理狀況包括腹膜、肝臟、胰腺和心臟(圖3b)。在轉(zhuǎn)基因雄性小鼠中，腹膜顯示大量的脂肪和脂肪細胞肥大(圖3b;上部圖板)。肝臟顯示在肝細胞中散布有微嚢泡和巨嚢泡脂肪改變(圖3b;上部圖板)。轉(zhuǎn)基因雄性小鼠的胰腺顯示胰島細胞增生，其中其數(shù)量和大小均增加(圖3b;上部圖板)。心瓣膜顯示輕度的粘液狀改變和肥大(圖3b;上部圖板)。與轉(zhuǎn)基因雄性小鼠相比，轉(zhuǎn)基因雌性小鼠顯示中等程度的細胞大小和體積的腹膜，脂肪改變較少，僅有小量的空泡改變(圖3b;第二圖板)。它們顯示的胰島細胞增生和心瓣膜粘液狀改變的程度也較小(圖3b;第二圖板)。在正常對照雄性小鼠中沒有觀察到上述異常(圖3b;下部圖板)。HCCR-1和ApoE表達語通過由來源于對照和轉(zhuǎn)基因小鼠的幾種組織組成的Western印跡相互進行比較(圖3c)。例如，在對照小鼠的組織如腦、肺、肝臟、腎臟、腸、腹膜腔中ApoE高度表達，而在來源于轉(zhuǎn)基因小鼠的相同組織中ApoE的表達微弱或不表達。另一方面，盡管在轉(zhuǎn)基因雄性和雌性小鼠中HCCR-1水平過度表達，但在對照小鼠的相應組織中表達微弱或不表達。HCCR-1和ApoE的這些互斥的表達譜使人想起了圖2a和2b中顯示的數(shù)據(jù)，表明它們通過不同的但導致相反的生物學結(jié)果的信號通路以協(xié)同的方式來形態(tài)學地調(diào)節(jié)。與同齡的正常對照小鼠相比，在雄性肥胖小鼠中，總膽固醇、HDL膽固醇、LDL膽固醇和甘油三酯的水平大大增加(P<0.05)。在雄性肥胖小鼠中，HCCR-1轉(zhuǎn)基因雄性小鼠中的總膽固醇(184.8士5.4mg/dl)、HDL膽固醇(152.9士0.4mg/dl)、LDL膽固醇(46.7土0.7mg/dl)和甘油三酯(21.9土2.3mg/dl)的水平分別比正常小鼠增加4.2倍、4.0倍、3.8倍和2.7倍(圖3d)(P<0.05)。在正常雄性小鼠中，總膽固醇、HDL膽固醇、LDL膽固醇和甘油三酯的水平分別為43.8±1.0mg/dl、38.4±1.0mg/dl、12.3±0.6mg/dl和8.0±0.1mg/dl。然而，就同齡的肥胖小鼠和正常小鼠之間的ApoE和瘦素水平而言，沒有大的差異(圖3d)。在雄性肥胖小鼠、雌性肥胖小鼠和正常對照小鼠中ApoE水平分別為0.9±0.1mg/dl、0.9±0.1mg/dl和1.4±0.3mg/dl(圖3d)。并且，在雄性肥胖小鼠、雌性肥胖小鼠和正常對照小鼠中瘦素水平分別為0.3土0.1ng/dl、0.3土0.1ng/dl和0.3士0.1ng/dl(圖3d)。就轉(zhuǎn)基因肥胖小鼠和對10而言，沒有差異(圖3d)。在雄性肥胖小鼠、雌性肥胖小鼠和正常對照小鼠中胰島素水平分別為2.3±0.6plU/ml、2.0士0.3plU/ml和2.0±0.6plU/ml。從上面的結(jié)果，很顯然HCCR-1可與其他已知的預后標志物一起用作新的乳腺癌預后標志物。也可見HCCR-1蛋白通過與ApoE直接結(jié)合而抑制抗增殖作用，這樣會引起肺瘤，因此所述蛋白負性地抑制ApoE活性。更重要的是，可見肥胖癥發(fā)生在HCCR-1轉(zhuǎn)基因小鼠中，尤其是雄性小鼠。結(jié)合為證明各種類型的癌癥和肥胖癥之間的關(guān)系而生成的證據(jù)，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)HCCR-1和與膽固醇從周圍細胞向肝臟的清除有關(guān)的ApoE相互作用，并且HCCR-1轉(zhuǎn)基因小鼠表明了與肥胖癥以及乳腺癌有關(guān)的病理學缺陷。因此，本發(fā)明能為經(jīng)常發(fā)生在女性中的乳腺癌和肥胖癥建立治療策略，尤其是能開發(fā)靶向HCCR-ApoE相互作用的藥物。下面將通過非限制性實施例來更詳細地說明本發(fā)明。實施例實施例1:組織和細胞系在外科手術(shù)期間獲取人正常組織和癌組織。所有患者簽署知情同意書。組織樣品的使用經(jīng)醫(yī)院的倫理委員會批準。哺乳動物細胞系獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)(ATCC;Manassas,VA)。BT-474、MCF-7和MDA-MB-231是來自乳腺的人乳腺癌細胞系。MCF-7和MDA-MB-231細胞顯示低水平的HER2表達，而BT-474細胞顯示高水平的HER2表達。BT-474和MCF-7細胞是ER-陽性和PR-陽性的。MDA-MB-231是ER-陰性和PR-陰性細胞系。MCF-7細胞具有野生型p53，而MDA-MB-231細胞具有缺失型p53。BT-474細胞具有突變型p53。實施例2:表達載體i殳計和DNA轉(zhuǎn)染如下設(shè)計包括HCCR-1或ApoE的編碼區(qū)的表達載體。首先從包括HCCR-1或ApoEcDNA的原核表達載體pCEV-LAC中分離Sail片段。然后，pcDNA3.1-V5-His(Invitrogen,CA)或pcDNA3.1-Myc-His用Bamffl和Sail處理以建立具有Sail的配伍末端。含有HCCR-1或ApoE編碼序列的Sail片段被插入進XhoI-消化的pcDNA3丄Lipofectamine2000(GibcoBRL,Rockville,MD)中，后者用于將HCCR-1或ApoE表達載體導li入進乳腺癌細胞中。簡言之，2x105細胞被接種在60mm組織培養(yǎng)皿(Costar,Cambridge,MA)中。在濕化5%C02孵箱中孵育過夜后，所述細胞用包括15ml脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑和5mgDNA的150ml脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺-DNA復合物處理。選擇對0.6mg/mlG418有抗性的各種細胞。所選擇的轉(zhuǎn)染物通過Western印跡篩選HCCR-1或ApoE表達。實施例3:酵母雙雜交篩選和(3-半乳糖普酶分析MATCHMAKERLexA雙雜交系統(tǒng)用于鑒定來自人胎腦MATCHMAKERcDNA文庫(Clontech,PaloAlto,CA)中可與HCCR-1融合蛋白結(jié)合的蛋白。所有實驗在表達lacZ和leu基因作為報告子的用p8op-lacZ轉(zhuǎn)化的酵母^朱EGY48(Clontech)中進行。本發(fā)明的發(fā)明人將HCCR-1cDNA片段插入進包含LexADNA-結(jié)合域的酵母雙雜交載體(pLexA)(Clontech)中。表達LexA-HCCR-1的酵母細胞用表達B42AD融合蛋白的人胎腦cDNA文庫(lnvitrogen)轉(zhuǎn)化。文庫轉(zhuǎn)化后，細胞被接種在選擇誘飾(HCCR-1)和AD/文庫質(zhì)粒兩者的人工合成極度缺陷型非誘導培養(yǎng)基(minimalsyntheticdropoutnon-inductionmedium)(Sigma)中以提高檢觀'JAD融合蛋白的可能性。為了證實HCCR-1和結(jié)合蛋白ApoE之間的相互作用，表達HCCR-1和ApoE兩者的質(zhì)粒^皮共轉(zhuǎn)化至酵母細胞中。實施例4:共轉(zhuǎn)染和免疫沉淀用編碼HCCR-1-V5-His(Invitrogen)融合蛋白和ApoE-Myc-His(Invitrogen)的pcDNA3.1(Invitrogen,Carlsbad,CA)轉(zhuǎn)染細胞。48小時后，收集細胞并在裂解緩沖液中溶解細胞。溶胞產(chǎn)物用免疫前血清(小鼠)和蛋白A-瓊脂糖凝膠在4°C下預清除30分鐘。使用BCA蛋白測定試劑試劑盒(BCAProteinAssayReagentKit)(PIERCE,Rockford,IL)，以牛血清白蛋白作為標準品測定蛋白濃度。等分試樣(lmg)的被預清除的細胞溶胞產(chǎn)物與抗-V5(Invitrogen)的1:500稀釋液或抗-Myc(Invitrogen)mAb的1:250稀釋液以及40ml1:1的蛋白A-瓊脂糖凝膠珠(AmershamBiosciences,Uppsala，Sweden)漿料在PBS中在4°C下畔育16小時。通過離心(2,000xg,5min，4°C下)收集免疫復合物，用ll沖液(20mMTris,pH7.5,1mMEDTA,1mMEGTA,150mMNaCl，2mMNa3V04,10%甘油和1%NonidetP-40)洗滌4次，進行SDS-PAGE，并且用抗-Myc抗體的1:1000TBS稀釋液或抗-V5抗體的1:3000TBS稀釋液進行Western印跡處理。實施例5:亞細J包定位使用線粒體分離試劑盒(Pierce,Rockford,IL)進行亞細胞定位。簡言之，通過以850xg離心2分鐘收集細胞；沉淀物懸浮在800試劑A中，然后在水上準確地保持2分鐘。將10^試劑B加入至懸浮溶液中，并在以每分鐘最大轉(zhuǎn)速渦旋的同時將所得溶液在冰上保持5分鐘。將800W試劑C加入至所述溶液中，并將試管倒轉(zhuǎn)數(shù)次以混合該溶液。溶液以700xg在4。C下離心10分鐘，并將沉淀物用作粗制的核部分。上清液以12,000g在4。C下離心10分鐘，并將上清液轉(zhuǎn)移至新的試管中作為胞液部分。沉淀物用500W試劑C洗滌，并用作分離的線粒體部分。每個部分用BCA蛋白測定試劑試劑盒(Pierce)定量。通過標準步驟將在樣品緩沖液中的煮沸提取物進行SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。膜用含有0.05%Tween20的5。/。脫脂奶/TBS(pH7.4)封閉，并且與用于線粒體定位標志物的一4元、4元-V5(Invitrogen,Carlsbad,CA)、4元-Myc(SantaCruzBiotechnology:SantaCruz,CA)或抗-VDACl(SantaCmzBiotechnology)—起孵育。實施例6:免疫熒光和熒光顯微鏡蓋玻片在HC1、蒸餾水(3x)和100。/。乙醇(2x)中洗滌。然后，將干燥的蓋玻片用5t/g/ml聚左旋賴氨酸(Poly-L-Lysine)(Sigma-AldrichCorp.,MO)在37°C下包被過夜。MCF-7細胞接種在6孔板中的預包被蓋玻片上。然后，在孵育1天后，使用LipofectAMINE2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)將細胞用pEGFP-HCCR-1和pEGFP-ApoE瞬時轉(zhuǎn)染。繼續(xù)孵育24-28小時后，細胞與25nMMitoTrackerOrange(MolecularProbes,Eugene,OR)在37。C下孵育15分鐘。細胞在2mlPBS中洗滌3次然后固定。然后，用含有4%蔗糖的4%多聚甲醛將蓋玻片上的細胞在4"C下固定10分鐘。細胞用100%曱醇在-20。C下處理1分鐘，并在PBS中洗滌3次。對于GFP染色，細胞用ProLongGoldAntifadeReagent(MolecularProbes,Eugene,OR)固定。<吏用Bio-RadMRC-1024MP激光掃描共聚焦顯樣i鏡(Bio-Rad,Hercules,CA)獲取熒光圖像并分析。實施例7:免疫化學染色試驗和染色判讀對于免疫化學染色試驗，使用人正常乳腺組織和乳腺癌組織的石蠟切13片(5卿厚)。石蠟切片與親和純化的多克隆抗-HCCR-l抗體孵育2小時。氨乙基。f唑(AEC)用作色原。免疫染色后，石蠟切片用蘇木素染色。由病理學家在ER、PR和p53最活3夭的染色區(qū)內(nèi)計^:至少500個腫瘤細胞。ER、PR和p53的染色陽性被規(guī)定為核染色。根據(jù)普遍接受的截斷值，10%肺瘤細胞染色陽性被用作ER、PR和p53的陽性結(jié)果。根據(jù)染色標準規(guī)定HER2免疫化學染色結(jié)果。HER2染色陽性被規(guī)定為膜染色。細胞質(zhì)染色色(評分為l+)的肺瘤細胞被認為是陰性的。當在10%或更多的腫瘤細胞中觀察到完全的微弱的至中等程度的膜染色(弱陽性；評分為2+)或完全的強膜染色(強陽性評分為3+)時，HER2被認為是陽性的。實施例8:Northern印跡分析使用HCCR-1cDNA或954-bp全長ApoEcDNA執(zhí)行Northern印跡分析以研究在多種人組織中HCCR-1或ApoE表達。通過與p-肌動蛋白的表達水平比較來定量mRNA表達水平。實施例9:通過夾心ELISA檢測培養(yǎng)上清液中的ApoE為了研究乳腺癌細胞的增殖期期間ApoE產(chǎn)生的動力學，在75-cm2中在含有FBS(10。/。)的DMEM中106細胞生長8天。在8天中每24小時收集等分試樣的50ml培養(yǎng)基，并且保持在-2(TC直至進行ApoE濃度測定。通過夾心ELISA使用市售試劑盒(MBLApoE4/Pan-ApoEELISA試劑盒，MBLCo.,Woburn，MA)測定ApoE濃度。通過MBLApoE4/Pan-ApoEELISA試劑盒(MBLCo.,Woburn,MA)測定人ApoE4或Pan-ApoE。親和純化的抗ApoE多克隆抗體和抗ApoE4單克隆抗體用于該分析。實施例10:DNA斷裂分析HCCR-l-或ApoE-轉(zhuǎn)染的乳腺癌細胞、僅用pcDNA3.1-轉(zhuǎn)染的細胞和野生型細胞分別孵育3、5和7天，并收集。細胞在含有100w/ml蛋白酶K的裂解緩沖液中在48°C下被裂解并消化過夜。加入1/5體積的5MNaCl和等體積的異丙醇以沉淀DNA。DNA沉淀再溶解在TE緩沖液中，并用0.1mg/mlRNaseA在37°C下處理1小時。對于每個樣品，10〃gDNA在2%瓊脂糖凝膠中分級分離，用溴化乙錠染色，并在紫外線下顯影。實施例11:轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生14如Vatten,L丄&Foss,O.P.CancerRes50,2341-2346(1990)中所述，使用標準的原核微注射法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠。為了進行微注射，通過Nrul和XmnI雙重消化，從pcDNA3.1-V5-His的載體主鏈上分離游離出轉(zhuǎn)基因的片段-HCCR-1。使用電洗脫和透析分離并純化要注射的片段CMV-HCCR-l-bGH,稀釋至終濃度為2ng/mlDNA注射緩沖液(10mMTns/0.lmMEDTA,pH7.4)，并且樣i注射至來源于C57BL/6N(CharlesRiverJapan)的單細胞期受精胚胎的原核中。然后在注射后2-3小時或在第二天如所述的那樣將在微注射后存活的20-25個已注射DNA的受精卵植入至一個受體CD-1(CharlesRiverJapan)小鼠的輸卵管中。潛在轉(zhuǎn)基因建立動物在3周齡時斷奶，并通過用PCR對采用標準實驗方案制備的鼠尾基因組DNA篩選鑒定HCCR-1轉(zhuǎn)基因的存在，并使其以野生型的方式生長以培育持久系(persistentline)。實施例12:統(tǒng)計學分析體重和ApoE、總膽固醇、HDL、LDL、甘油三酯、瘦素和胰島素的血清濃度表示為均數(shù)±標準差。t-檢驗和Dunnett多重比較用于所有的統(tǒng)計學分析。如此前所述，本發(fā)明的HCCR-1作為乳腺癌標志物和/或誘導肥胖的組合物具有優(yōu)異的效果。權(quán)利要求1.一種用作乳腺癌預后標志物的組合物，包括HCCR-1蛋白。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物進一步包括選自ER、PR、p53基因型和HER2蛋白的一種或多種藥劑。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述HCCR-1蛋白的序列是如SEQIDNO:l中所示的序列。4.一種誘導肥胖的組合物，包括HCCR-1蛋白。5.—種轉(zhuǎn)基因肥胖非人哺乳動物，其中所述哺乳動物已經(jīng)用HCCR-1蛋白進行了轉(zhuǎn)化。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因肥胖非人動物，其中所述哺乳動物選自小鼠、大鼠、兔、綿羊、牛、山羊和豬。7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的組合物或哺乳動物，其中所述HCCR-1蛋白的序列是如SEQIDNO:l中所示的序列。全文摘要本發(fā)明提供了乳腺癌預后標志物和誘導肥胖的組合物，其中所述標志物和所述組合物包括HCCR-1。文檔編號G01N33/68GK101512345SQ200780033474公開日2009年8月19日申請日期2007年7月6日優(yōu)先權(quán)日2006年7月7日發(fā)明者金弦起,金振宇申請人:金弦起