專利名稱：一種乳腺癌的分子標志物hsa-miR-374a及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種乳腺癌的分子標志物hsa-miR-374a 及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，全球每年約有120萬的新增乳腺癌 病例，50萬的死亡病例，具有發(fā)病率高、死亡率高的特點。導(dǎo)致乳腺癌高死亡 率的其中一個原因就是乳腺癌的擴散轉(zhuǎn)移，易發(fā)的轉(zhuǎn)移部位包括肺、肝、腦、 骨、胸膜等。近年來，我國的乳腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，嚴重危害女性 的生命和健康。
微小RNA ( microRNA)是廣泛存在于真核生物中一組不編碼蛋白質(zhì)的短序 列RNA,長度為20-24個堿基，具有高度保守性、時序性和組織特異性。它 通過與耙基因的mRNA堿基特異性配對，促進mRNA的降解或抑制其翻譯，從 而實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控作用。已有研究表明，microRNA在調(diào)節(jié)細胞生長、 細胞凋亡、細胞運動、細胞分化以及胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。 microRNA自身表達的異常在包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤中已經(jīng)得到驗證， microRNA參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，提示它們在乳腺癌診斷、預(yù)后和治療 中可能具有廣闊的應(yīng)用前景。
現(xiàn)有技術(shù)的國內(nèi)外文獻檢索中至今未見有關(guān)hsa-miR-374a與乳腺癌的關(guān)系 的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種新的乳腺癌的分子標志物。
3本發(fā)明的乳腺癌的分子標志物為小分子非編碼RNA基因hsa-miR-374a。發(fā) 明人首先利用microRNA芯片技術(shù)檢測了 13例乳腺癌組織和兩個正常乳腺組織 中microRNA的表達鐠，選取了其中的hsa-miR-374a，在臨床切片中進一步驗證 hsa-miR-374a與乳腺癌的相關(guān)性，并在體外細胞培養(yǎng)水平進行深入的功能探討。
本發(fā)明提出以小分子非編碼RNA基因hsa-miR-374a作為乳腺癌的分子標志 物，該分子標志物能誘導(dǎo)乳腺癌上皮細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進乳腺癌 上皮細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移能力。本發(fā)明的小分子非編碼RNA基因hsa-miR-374a 在乳腺癌組織中的表達顯著高于正常乳腺組織，而且與乳腺癌的臨床分勤目關(guān)， 同時，hsa-miR-374a在體外培養(yǎng)的乳腺癌細胞系中的表達顯著高于正常的乳腺上 皮細胞以及永生化的正常乳腺上皮細胞，提示了該基因在乳腺癌的臨床診斷方 面可能成為 一種有效的標志物。該基因成熟體序列如SEQ ID NO. 1所示的序列
5 ，-UUAUAAUACAACCUGAUAAGUG誦3 ，。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的乳腺癌的分子標志物在制備抗乳腺癌腫瘤藥物中 的應(yīng)用，所述藥物包含有效量的阻斷劑，所述阻斷劑能阻斷小分子非編碼RNA 基因hsa-miR-374a的表達。hsa-miR-374a的核苷酸序列為SEQ ID NO.l所示的 序列。由于本發(fā)明的小分子非編碼RNA基因hsa-miR-374a可以誘導(dǎo)乳腺癌上皮 細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，可以促進乳腺癌上皮細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移能力，當阻斷 hsa-miR-374a在乳腺癌上皮細胞中的表達時，可能可以有效抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的 發(fā)生，甚至使已經(jīng)發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的細胞恢復(fù)上皮細胞特性，并且有效抑制 乳腺癌上皮細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移能力。
本發(fā)明為乳腺癌的診斷提供了一種新的分子標志物，即小分子非編碼RNA 基因hsa-miR-374a，而且利用寡義核苷酸技術(shù)開發(fā)出阻斷hsa-miR-374a在乳腺 癌上皮細胞中的表達的阻斷劑作為全新的抗乳腺癌腫瘤藥物，為乳腺癌的治療 提供新的有效途徑。hsa-miR-374a分子還可能參與了乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的其 他環(huán)節(jié)，如細胞生長、細胞凋亡、血管生成等等，以及參與了其他類型腫瘤的 發(fā)生發(fā)展過程。因此，本發(fā)明還對以后深入研究hsa-miR-374a的功能以及與其 他腫瘤的關(guān)系提供了 一定的經(jīng)驗和lJf出。


圖1是本發(fā)明實施例1中用實時定量RT-PCR方法檢測hsa-miR-374a的表 達水平；A:檢測hsa-miR-374a在不同乳腺癌組織和正常乳腺組織中的表達水平；
Nl、 N2表示2例正常乳腺組織，T1-T13表示13例乳腺癌組織；B: hsa-miR-374a 在體外培養(yǎng)的各種乳腺癌細胞系和正常的乳腺上皮細胞以及永生化的正常乳腺
上皮細胞中的表達水平；
圖2是本發(fā)明實施例2中用原位雜交技術(shù)對不同臨床級別的乳腺癌石蠟包 埋組織切片的染色圖3是本發(fā)明實施例3中hsa-miR-374a的過表達對乳腺上皮細胞MCF-7 形態(tài)的影響；A:建立穩(wěn)定it^達hsa-miR-374a的MCF-7細胞林(MCF-7-374a); B: MCF-7過表達hsa-miR-374a后由上皮細胞形態(tài)向間質(zhì)細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，并由 克隆性生長向散落性生長轉(zhuǎn)變；
圖4是本發(fā)明實施例4中用western blotting檢測上皮細胞和間質(zhì)細胞標志 物的表達水平；
圖5是本發(fā)明實施例5中相對于MCF-7,檢測MCF-7-374a浸潤和轉(zhuǎn)移能 力的變化；A:過表達hsa-miR-374a顯著增強MCF-7在基質(zhì)膠中的浸潤能力； B:過表達hsa-miR-374a顯著增強MCF-7在穿過小室中的遷移能力。
具體實施例方式
為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng) 理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實施例 中未提及的具體實驗方法，通常按照常規(guī)實驗方法進行。
實施例1 hsa-m股-374a表達水平的檢測
經(jīng)過中山大學(xué)倫理委員會及病人家屬的同意，收集臨床上13例乳腺癌組織 和2例正常乳腺組織的新鮮標本，用Trizol法提取組織RNA，利用ABI 7500熒光 定量PCR儀器系統(tǒng)檢測hsa-miR-374a的表達水平，每個樣品有三個復(fù)孔。各組織中hsa-miR-374a的表達以其中的1例正常乳腺組織RNA做為標準化內(nèi)參。實驗結(jié)
果見圖1中的圖A，圖1A為檢測hsa-miR-374a在不同乳腺癌組織和正常乳腺組織
中的表達水平；Nl、 N2表示2例正常乳腺組織，Tl-T13表示13例乳腺癌組織；
可以看出，hsa-miR-374a在乳腺癌組織中的表達顯著高于正常乳腺組織，提示
hsa-miR-374a可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。
體外培養(yǎng)的各種乳腺癌細胞系和正常的乳腺上皮細胞以及永生化的正常乳
腺上皮細胞利用同樣的Trizol法提取RNA,并檢測在各種細胞系中hsa-miR-374a 的表達水平。實驗結(jié)果見圖1B,圖lB顯示了hsa-miR-374a在體外培養(yǎng)的各種乳 腺癌細胞系和正常的乳腺上皮細胞以及永生化的正常乳腺上皮細胞中的表達水 平?？梢钥闯觯琱sa-miR-374a^體外培養(yǎng)的乳腺癌細胞系中的表達均顯著高于正 常的乳腺上皮細胞以及永生化的正常乳腺上皮細胞。提示hsa-miR-374a可能與乳 腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。
實施例2利用原位雜交技#測不同臨床鈒別的乳腺癌石蠟包埋組織切片 中hsa-miR-374a的表達
隨意選取不同臨床級別的乳腺癌石蠟包埋組織切片，烤箱45。C烤片2hrs, 二甲苯脫蠟，100%、 100%、 75%、 50%、 25%梯度酒精及清水清洗二甲苯，各 5mins; 0.2M HC1 5mins; PBS 5mins; 40|ig/ml蛋白酶K25。C 20mins; 0.2%甘 氨^BS 5mins; PBS 5mins， 2次；4%曱醛10mins; PBS 5mins, 2次；無水醋 紛三乙醇胺5mins; PBS 5mins，4次；5 x SSC, 5mins，2次；預(yù)雜交，2hrs;孵 育探針40hrs左右；5 x SSC， 5mins,2次；50%甲酰胺，2 x SSC 30mins， 2次； 0.1%PBST， 5mins,5次；封閉液(Roche)封閉2hrs;抗DIG抗體(Roche), 16hrs，4 °C; 0.1%PBST, 10mins,4次；染色液，10mins， 2次；孵育NBT/BCIP， 12hrs; PBST終止反應(yīng)；25%、 50%、 75%、 100%酒精；37。C干燥，封片。顯微鏡觀察， 采用雙盲方法打分，結(jié)杲見圖2。可以看出，相對于正常的乳腺組織，hsa-miR-374a 在乳腺癌組織中呈強陽性表達，而且，隨著乳腺癌組織臨床分級增加， hsa-miR-374a表達增強。實施例3穩(wěn)定it^達hsa-miR-374a對乳腺癌上皮細胞MCF-7形態(tài)的影響
建立穩(wěn)定過表達hsa-miR-374a的細胞林
磷酸鈣轉(zhuǎn)染制備逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染前24h，將293FT傳代至所需盤數(shù)；轉(zhuǎn)染 當天將需要感染的細胞(MCF-7 )傳代至所需的密度；轉(zhuǎn)染時，將20昭(l|ig^l) pMSCV-puro、 20jug (ljug/pl)包裝質(zhì)粒pIK、 380^1 lxTE、2M CaCl2混勻 后逐滴緩慢加入480nl 2xHEPES，室溫靜止30min后將混合液均勻加入24h前 傳代的293FT的培養(yǎng)基內(nèi)，加入氯喹5)Lil并輕柔混勻。置入37。C、 5%C02、恒 溫、恒濕細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h后用lx溶液A ( 1L溶液A中含7.149g HEPES， 1.802gD-葡萄糖、0.2236gKCl、 7.697g NaCl、 0.142g NaHC03)洗細胞2次， 小心加入適量培養(yǎng)基后置入37°C、 5%C02、恒溫、恒濕細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)；次日 8時、12時、16時、20時、24時收集病毒液并用0.22nm孔徑濾器過濾，其中 8時、12時、16時、20時收集的病毒液加入聚凝胺(polybrane) (lpl/ml)立 即感染待感染細胞，24時收集的病毒液凍存于-80。C以備病毒液不足時使用。24 時將感染的細胞的培養(yǎng)基換為正常培養(yǎng)基過夜。連續(xù)感染三天；感染結(jié)束后用 含有嘌呤霉素(0.5嗎/ml)的培養(yǎng)基篩選陽性細胞；待細胞生長穩(wěn)定后收集細胞 的RNA,用實時定量RT-PCR檢測hsa-miR-374a的表達情況。
圖3是hsa-miR-374a的過表達對乳腺上皮細胞MCF-7形態(tài)的影響。其中， 圖3A是建立穩(wěn)定過表達hsa-miR-374a的MCF-7細胞林(MCF-7-374a)，該圖 說明了細胞林MCF-7-374a的hsa-miR-374a的表達量比正常表達的細胞抹 MCF-7-V的hsa-miR-374a的表達量要高出很多；圖3B是MCF-7過表達 hsa-miR-374a后由上皮細胞形態(tài)向間質(zhì)細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，并由克隆性生長向散落性 生長轉(zhuǎn)變的顯微鏡觀察圖片。
實施例4檢測上皮細胞和間質(zhì)細胞標志物的表達
細胞生長密度達到80%后棄去培養(yǎng)液;用4。C預(yù)冷的lxPBS洗2次；每P100 培^jnL中加入400pl lx細胞裂解液(10%甘油、3%SDS、 lx上層Tris);迅速覆蓋整個培養(yǎng)皿并混勻；將培養(yǎng)孤傾斜用細胞刮將混合液刮向一邊；充分吸出混 合液并移入1.5ml離心管，超聲波破碎打斷DNA后-20。C保存或立即測蛋白濃 度；SDS變性蛋白質(zhì)后電泳，10.5%的分離膠和5%的濃縮膠，電泳時，分離膠 用100V電壓，濃縮膠用80V電壓；約2小時后，20%的甲醇轉(zhuǎn)膜緩沖液轉(zhuǎn)膜， 70V電壓；3小時后，PVDF膜浸入封閉液中，37。C平緩搖動1小時；孵育一抗， 4。C過夜，上皮細月包的才示志物有E曙cadherin、 a-catenin、 ！3-catenin、 y-catenin， 間 質(zhì)細胞標志物有vimentin、 N-cadherin、 fibronectin; 0.1%PBS/T漂洗10min,共 3次；孵育二抗，37。C平緩搖動1小時；0.1%PBS/T漂洗10min，共3次；ECL 化學(xué)發(fā)光及膠片曝光。western blotting的檢測結(jié)果見圖4，圖4是用western blotting檢測上皮細胞和間質(zhì)細胞標志物的表達水平的結(jié)果。其中，MCF-7-V是 非過量表達hsa-miR-374a的細月包才朱，MCF-7-374a是過量表達hsa-miR-374a的細 胞株。該結(jié)果表明，MCF-7過表達hsa-miR-374a后，間質(zhì)細胞標志物表達顯著 增加，上皮細胞標志物顯著減少。結(jié)果提示了 hsa-miR-374a能促進乳腺癌細胞 系的浸潤和轉(zhuǎn)移的能力。
實施例5細胞浸潤實驗和細胞遷移實驗
細胞浸潤實驗基質(zhì)膠置于冰中，4°C，過夜至完全融解；以9份無血清培 養(yǎng)基和l份基質(zhì)膠稀釋，充分混合，每個穿過小室中加入5(^1稀釋液，鋪滿孔 底，37。C3-4小時；消化計數(shù)細胞，用無血清重懸細胞，混勻，每個小室中加入 200ul懸液，含50000個細胞，勿產(chǎn)生氣泡；孔外加入10%FBS培養(yǎng)基500pl， 觀察后力t^v37。C孵育箱；24小時后，取出小室，吸出孔內(nèi)的基質(zhì)膠，lxPBS洗 2次；用棉簽小心擦拭小室孔內(nèi)殘留的細胞和基質(zhì)膠；3份的甲醇和1份的水醋 酸固定膜上細胞，常溫放置10-15mins; lxPBS—次；蘇木素復(fù)染；自來水沖洗； 觀察，任意取十個視野計算細胞數(shù)，并拍照。細胞遷移實驗過程與細胞浸潤 實驗相同，但是整個過程不用加基質(zhì)膠。圖5的實驗結(jié)果顯示了相對于MCF-7， MCF-7-374a浸潤和轉(zhuǎn)移能力的變化；其中圖A顯示了過表達hsa-miR-374a顯著 增強MCF-7在基質(zhì)膠中的浸潤能力；圖B顯示了過表達hsa-miR-374a顯著增強MCF-7在穿過小室中的遷移能力。結(jié)果表明了 hsa-miR-374a能促進乳腺癌細胞 系的浸潤和轉(zhuǎn)移的能力。
綜上實驗結(jié)杲，hsa-miR-374a在乳腺癌組織中的表達顯著高于乳腺正常組 織，在體外培養(yǎng)的各種乳腺癌細胞系中，其表達顯著高于正常乳腺上皮細胞以 及永生化的正常乳腺上皮細胞，過表達hsa-miR-374a能誘導(dǎo)乳腺癌上皮細胞發(fā) 生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進其浸潤和轉(zhuǎn)移能力。因此，實驗表明hsa-miR-374a有望 成為臨床上乳腺癌診斷中的有效標志物。
最后所應(yīng)當說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本 發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而 不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。序列表
< 120>—種乳腺癌的分子標志物及其應(yīng)用
<160> 1 <210> 1 <211>22 <212>RNA <213>人工序列 <222>(1)...(22) <400> 1
uuauaauaca accugauaag ug 2權(quán)利要求
1、一種乳腺癌的分子標志物，其特征在于，所述乳腺癌的分子標志物為小分子非編碼RNA基因hsa-miR-374a。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乳腺癌的分子標志物，其特征在于，所述 hsa-miR-374a的核苷^列為SEQIDNO.l所示的序列。
3、 權(quán)利要求1所述的乳腺癌的分子標志物在制備抗乳腺癌腫瘤藥物中的應(yīng) 用，其特征在于，所述藥物包含有效量的阻斷劑，所述阻斷劑能阻斷小分子非 編碼RNA基因hsa-miR-374a的表達。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述hsa-miR-374a的核苷酸 序列為SEQ ID NO. 1所示的序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的乳腺癌的分子標志物，即小分子非編碼RNA基因hsa-miR-374a作為乳腺癌的分子標志物，該分子標志物在乳腺癌組織中的表達顯著高于正常乳腺組織，而且與乳腺癌的臨床分級相關(guān)，hsa-miR-374a在體外培養(yǎng)的乳腺癌細胞系中的表達顯著高于正常的乳腺上皮細胞以及永生化的正常乳腺上皮細胞。本發(fā)明還提供了該乳腺癌的分子標志物在制備抗乳腺癌腫瘤藥物中的應(yīng)用，該藥物包含有效量的阻斷劑，能阻斷小分子非編碼RNA基因hsa-miR-374a的表達。本發(fā)明為乳腺癌的診斷及治療提供新的有效途徑。本發(fā)明還對以后深入研究hsa-miR-374a的功能以及與其他腫瘤的關(guān)系提供了一定的經(jīng)驗和基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/11GK101633922SQ20091004200
公開日2010年1月27日 申請日期2009年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月24日
發(fā)明者吳玨珩, 雋 李, 蔡俊超, 潔 袁, 黃勇波, 黎孟楓 申請人:中山大學(xué)