腫瘤血清標(biāo)志物ca153、cea、hcg乳腺癌三聯(lián)診斷試劑盒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)療檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及腫瘤血清標(biāo)志物CA153、CEA、HCG乳腺癌三聯(lián) 診斷試劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在目前乳癌發(fā)病機(jī)理不清楚的情況下，最好辦法就是早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷與早期 治療，這是提高乳腺癌療效的關(guān)鍵。乳腺癌是世界上最常見的上皮細(xì)胞腫瘤，對(duì)人類的健康 和生存構(gòu)成重大威脅，是世界各國(guó)面臨的最重要的社會(huì)問(wèn)題之一。時(shí)至今日，乳腺癌占全身 惡性腫瘤的7% -10%，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，自1980年以來(lái)每年以3%的速度增長(zhǎng)， 特別是北美、西歐等發(fā)達(dá)國(guó)家，表現(xiàn)的尤為明顯。全世界每年約有120萬(wàn)婦女發(fā)生乳腺癌， 其中，有50萬(wàn)婦女死于乳腺癌。2006美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)，國(guó)際癌癥學(xué)會(huì)和國(guó)際乳腺癌聯(lián)合體有 關(guān)乳腺癌的統(tǒng)計(jì)資料顯示：在女性人口中，每8位就有1位將遭受乳腺癌的威脅。平均每2 分半鐘就有1位女性被診斷為乳腺癌患者。在2006年，平均每13分鐘就有1位女性死于 乳腺癌。僅在2006年，有212920位女性受到乳腺癌的侵襲，大約有40970位患者將面臨死 亡。
[0003] 腫瘤標(biāo)記物是指腫瘤細(xì)胞直接合成和分泌的腫瘤相關(guān)抗原、活性蛋白、激素、受 體、酶或同工酶，它們當(dāng)中的一些可以通過(guò)循環(huán)進(jìn)入血液或體液。血液和體液中的腫瘤標(biāo)志 物可通過(guò)生物化學(xué)反應(yīng)、放免法、酶免法、電化學(xué)發(fā)光等方法檢測(cè)出來(lái)。發(fā)現(xiàn)腫瘤標(biāo)記物對(duì) 腫瘤診斷、治療、監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)、判斷療效和抗癌藥物設(shè)計(jì)有十分重要的意義。當(dāng)前，醫(yī)院通常使 用的腫瘤標(biāo)記物多達(dá)數(shù)十種，如血清中的AFP(甲胎蛋白）、CEA(癌胚抗原）、CA125 (糖類抗 原125)、CA199 (糖類抗原199)、CA153 (糖類抗原153)、CA50 (糖類抗原50)、CA242 (糖類 抗原242)、CA72-4 (糖類抗原72-4)、NSE(神經(jīng)原特異性烯醇化酶）、SCC(鱗癌相關(guān)抗原）、 HTG(甲狀腺球蛋白）、TPS(組織多肽特異性抗原）、PSA(前列腺特異抗原）、fPSA(游離前列 腺特異抗原）、cPSA(結(jié)合型前列腺特異抗原）、FT3 (三碘甲狀腺原氨酸）、FT4 (甲狀腺素）、 TSH(促甲狀腺素）、CT(降鈣素）、PTH(甲狀旁腺素）、HCG(絨毛膜促性腺激素）、E2 (雌二 醇）、P(孕酮）、LH(黃體生成素）、FSH(促卵泡生成素）、PRL(催乳素）、GH(生長(zhǎng)激素）、 ACTH(促腎上腺皮質(zhì)激素）、VMA(尿香草扁桃酸）等，但這些標(biāo)記物的特異性和識(shí)別范圍并 不十分理想，腫瘤的不同時(shí)期和腫瘤細(xì)胞的類型差別會(huì)出現(xiàn)不同的預(yù)后結(jié)果。在腫瘤檢測(cè) 中，由于單項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物敏感性和特異性不能滿足臨床診斷的需要，通常采用有針對(duì)性的 聯(lián)合檢測(cè)才能為臨床診斷提供有價(jià)值的數(shù)據(jù)；例如，檢測(cè)肝癌時(shí)通常聯(lián)合檢測(cè)AFP、CEA、SF 和CA199,檢測(cè)大腸癌時(shí)測(cè)CEA、SF、CA199和CA50,檢測(cè)卵巢癌時(shí)測(cè)CEA、AFP和CA125,檢測(cè) 肺癌時(shí)測(cè)CEA、CA50和CY211，檢測(cè)乳腺癌時(shí)測(cè)CEA、SF、CA153和CA50,檢測(cè)前列腺癌時(shí)測(cè) PSA和FPSA。這樣勢(shì)必導(dǎo)致患者為獲得對(duì)臨床診斷有意義的數(shù)據(jù)需要檢測(cè)多項(xiàng)生理指標(biāo)， 而檢査這些指標(biāo)時(shí)通常需付千元以上的檢測(cè)費(fèi)，對(duì)患者本人和社會(huì)均帶來(lái)很大的負(fù)擔(dān)。所 以，研發(fā)新的檢測(cè)瘤標(biāo)志物試劑盒是當(dāng)前許多著名研宄機(jī)構(gòu)和制藥企業(yè)的重點(diǎn)研宄課題。
[0004] CA153是一種與腫瘤相關(guān)的粘蛋白抗原，其分子是0-連接的低聚糖蛋白，分子量 很大。目前，已知由人類MUC-I基因編碼的與乳腺癌相關(guān)的抗原分別有MAM6、乳汁粘蛋白、 和CA153。用這些抗原制備的單克隆抗體，能夠不同程度地定量檢查患II期或III期乳腺 癌婦女的癌癥復(fù)發(fā)情況。據(jù)有關(guān)資料報(bào)道，腫瘤相關(guān)抗原CA153對(duì)預(yù)測(cè)II期或III期乳腺 癌病人復(fù)發(fā)情況具有較高的特異性。美國(guó)食品和藥品管理局（FDA)近期已批準(zhǔn)使用CA153。 臨床上，通常用40U/ml(RIA)作為正常值的上限。對(duì)乳腺癌和卵巢癌轉(zhuǎn)移的病人，特別是經(jīng) 治療后臨床上無(wú)疾病癥狀的病人，在定期進(jìn)行血清CA153檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)，測(cè)定值大于40U/ml 的病人比測(cè)定值小于40U/ml或等于40U/ml的病人，其存活率要低得多。
[0005] 組織多肽特異抗原CEA，血清中組織多肽特異抗原含量的高低是衡量腫瘤細(xì)胞分 裂和增殖活性的一個(gè)較為特異的指標(biāo)。研宄表明，組織多肽特異抗原在腫瘤的早期診斷、預(yù) 測(cè)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、評(píng)價(jià)預(yù)后方面有獨(dú)特的價(jià)值。與傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物如甲胎蛋白、癌胚抗原等 不同的是，組織多肽特異抗原是"腫瘤活性依賴型"的，它在血清中含量的高低與正在分裂、 增殖的腫瘤細(xì)胞的數(shù)目有關(guān)，即與腫瘤的活性有關(guān)；而甲胎蛋白、癌胚抗原等則是"腫瘤容 量依賴型"的，與腫瘤的瘤體負(fù)荷即腫瘤細(xì)胞的數(shù)目有關(guān)。因此，在腫瘤的早期，在出現(xiàn)肉眼 復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移之前，由于腫瘤細(xì)胞數(shù)目較少，那些反映腫瘤容量的標(biāo)志物的血清水平往往是 很低的，而此時(shí)腫瘤細(xì)胞分裂、增殖活躍，因而組織多肽特異抗原含量可以很高，從而有利 于早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和防治。
[0006] HCG在正常情況下無(wú)表達(dá)或低表達(dá)，作為一種新的上皮來(lái)源性質(zhì)的腫瘤標(biāo)志物，近 幾年來(lái)在腫瘤臨床的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，在許多上皮性癌如肺癌、鼻咽癌等都有不同程度的 檢出率；文獻(xiàn)報(bào)道乳腺癌患者血清HCG水平與臨床分期有關(guān)，但其陽(yáng)性率不高，但與良性腫 瘤組差異有顯著性，HCG陽(yáng)性率隨臨床分期及有無(wú)轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的程度增加而上升。因此HCG 的檢測(cè)亦可出現(xiàn)假陽(yáng)性，這需要結(jié)合臨床資料及通過(guò)追蹤觀察加以排除。
[0007] 單獨(dú)檢測(cè)上述某一腫瘤標(biāo)志物指標(biāo)，并不能提供更多的信息，檢測(cè)靈敏度和特異 性都比較低，很難檢測(cè)出早期或復(fù)發(fā)乳腺癌患者，容易出現(xiàn)誤診或漏診。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明目的在于提供一種新的乳腺癌診斷試劑盒，相比于現(xiàn)有的乳腺癌診斷試劑 盒，本發(fā)明乳腺癌診斷試劑盒具有更高的靈敏度高和更強(qiáng)的特異性強(qiáng)。
[0009] 針對(duì)CA153對(duì)乳腺癌診斷具有特異性高的特點(diǎn)，CEA在腫瘤的早期診斷、預(yù)測(cè)復(fù)發(fā) 和轉(zhuǎn)移、評(píng)價(jià)預(yù)后方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，HCG在乳腺癌臨床分期有關(guān)及區(qū)分惡性與良性腫瘤方 面的特性，本發(fā)明應(yīng)用免疫層析法將以上三種抗原聯(lián)合使用，從而大大提高了乳腺癌臨床 檢測(cè)的靈敏度及特異性，相對(duì)于單檢試劑具有靈敏度高及特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，同時(shí)，每種腫瘤 標(biāo)志物的顯色顏色不同，結(jié)果判斷更加直觀。
[0010] 具體的，本發(fā)明目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：
[0011] 一種乳腺癌膠體金三聯(lián)檢診斷試劑盒，包括反應(yīng)卡、吸滴管、血清加樣杯和一次性 注射器，其中，所述的反應(yīng)卡自下而上依次由樣品墊、膠體金標(biāo)記的結(jié)合墊、硝酸纖維素膜 和吸水墊連接在一起后固定于背襯上而組成；
[0012] 其中，所述的膠體金標(biāo)記的結(jié)合墊按照以下方法制備得到：將CA153單克隆抗體、 CEA單克隆抗體和HCG單克隆抗體分別用金溶膠粒標(biāo)記后，將其混合，包被于玻璃纖維上， 即得；
[0013] 更優(yōu)選的，所述的膠體金標(biāo)記的結(jié)合墊按照以下方法制備得到：以氯金酸-檸檬 酸三鈉還原法（Frens法）制備不同直徑的膠體金溶液，用0. 2MK2C03調(diào)至pH7. 5,分別將 CA153單抗用粒徑為24. 5nm的金溶膠粒標(biāo)記，CEA單抗用粒徑為41nm的金溶膠粒標(biāo)記， HCG5單抗用粒徑為71nm的金溶膠粒標(biāo)記，標(biāo)記是時(shí)間分別為30分鐘，加入終濃度為10mg/ ml牛血清白蛋白（BSA)，lmg/mlPVP封閉20min，12000r/m離心30分鐘，棄上清，沉淀分別用 工作液進(jìn)行復(fù)溶，將金溶膠粒標(biāo)記的3種單抗溶液混合后（優(yōu)選為等比例混合），包被于玻 璃纖維上，即得。
[0014] 在本發(fā)明進(jìn)