乳腺癌聯(lián)合診斷標(biāo)志物及檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物化學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及乳腺癌聯(lián)合診斷標(biāo)志物及檢測(cè) 試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 中國(guó)癌癥負(fù)擔(dān)在不斷增加，每年有160萬(wàn)人被診斷為癌癥，120萬(wàn)人死于癌癥。和 其他很多國(guó)家一樣，乳腺癌是中國(guó)女性最常見(jiàn)的癌癥，在全球范圍內(nèi)，中國(guó)占據(jù)新診斷乳腺 癌病例的12. 2%，占據(jù)乳腺癌死亡的9. 6%。
[0003] 乳腺癌屬于全身性疾病，發(fā)病率呈逐年上升、發(fā)病年齡呈逐漸年輕化的趨勢(shì)，作 為一種高度異質(zhì)性腫瘤，早期可出現(xiàn)淋己或血行轉(zhuǎn)移，是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。
[0004] 雖然目前中國(guó)乳腺癌發(fā)病率低，但是從90年代W來(lái)，中國(guó)的乳腺癌發(fā)病率增長(zhǎng)速 度是全球的兩倍多，城市地區(qū)尤為顯著。目前，乳腺癌是中國(guó)女性發(fā)病率最高的癌癥，癌癥 死亡原因位居第六。截至2008年，中國(guó)總計(jì)169452例新發(fā)浸潤(rùn)性乳腺癌，44908例死于乳 腺癌，分別占到全世界的12. 2%和9. 6%。
[0005] 中國(guó)乳腺癌全年檢出人數(shù)是歐洲（2008年共計(jì)332000例，總?cè)丝谒膬| 九千八百萬(wàn)）的一半，與美國(guó)（2008年共計(jì)182000例，總?cè)丝讦畠|零四百萬(wàn)）基本相當(dāng)。 如果運(yùn)一趨勢(shì)保持不變，到2021年，中國(guó)乳腺癌患者將高達(dá)250萬(wàn)，發(fā)病率將從不到60例 /10萬(wàn)女性（年齡在55歲到69歲之間）增加到超過(guò)100例/10萬(wàn)女性?；痑ncet化col 2014 ；15(7):e279-e289)
[0006] 目前，國(guó)際上對(duì)乳腺癌的預(yù)警和早期診斷的技術(shù)主要有W下Ξ種：
[0007] 1.臨床體格檢查：定期接受臨床體格檢查是早期發(fā)現(xiàn)乳腺癌的有效方法之一。始 于1963年紐約的健康保險(xiǎn)計(jì)劃化IP)，歷經(jīng)18年研究發(fā)現(xiàn)，接受定期臨床體格檢查的婦女 乳腺癌死亡率比對(duì)照組低23%。我國(guó)也開(kāi)展了一系列乳腺癌的預(yù)防工作，但是，乳腺癌普查 耗資巨大，成本/效果比高。
[0008] 2.影像學(xué)診斷法：影像學(xué)檢查是W鋼祀X線攝片為主要手段，輔W超聲掃描和MRI 掃描。鋼祀X線攝片方法能發(fā)現(xiàn)細(xì)小巧化點(diǎn)，如果表現(xiàn)為泥沙樣巧化或細(xì)顆粒樣巧化，或者 每lcm2內(nèi)< 0. 5mm的超過(guò)5枚則可提示乳腺癌。但對(duì)于不典型的病變，尤其是致密型乳腺 內(nèi)的病變及近胸壁的病變易漏診。2014年2月11日發(fā)表在著名的《英國(guó)醫(yī)學(xué)雜志》上一 項(xiàng)研究報(bào)告40~59歲女性的每年乳腺鋼祀X線檢查并不能降低乳腺癌的死亡率，也不優(yōu) 于普通體檢的診斷率，而且有22%的女性因?yàn)槿橄黉撿隭線檢查被過(guò)度診斷了度ritish MedicalJournal, 2014, 348.)。另外，我國(guó)女性乳腺小而致密，運(yùn)也會(huì)降低患者接受鋼祀檢 查的陽(yáng)性率。
[0009] 3.生物祀標(biāo)早期檢測(cè)：包括乳腺癌相關(guān)基因普查，例如BRCA1和BRCA2的突變分 析；乳頭溢液特異物檢測(cè)及血清腫瘤標(biāo)志物的測(cè)定。Her-2/neu癌基因在乳腺癌中過(guò)度表 達(dá)，在血清中可W檢測(cè)到化r-2蛋白片斷。通過(guò)酶聯(lián)免疫反應(yīng)測(cè)定血清化r-2水平，可W作 為診斷乳腺癌的指標(biāo)之一。但目前分子診斷研究大多關(guān)注基因多態(tài)性與乳腺癌的關(guān)系，只 能給出患者的易感風(fēng)險(xiǎn)，不適用于臨床疾病的診斷。
[0010] 因此，本領(lǐng)域迫切需要建立新的乳腺癌檢查技術(shù)，能夠早期客觀、靈敏和穩(wěn)定的診 斷乳腺癌，W便進(jìn)行及時(shí)、有針對(duì)性的治療，提高患者的生存質(zhì)量和生存率，降低醫(yī)療成 本，節(jié)約社會(huì)資源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)手段的上述缺陷，提供新的乳腺癌聯(lián)合診斷 標(biāo)志物。
[0012] 本發(fā)明的另一目的是提供基于上述標(biāo)志物制備的檢測(cè)試劑盒，與常規(guī)診斷方法相 比，本發(fā)明試劑盒檢測(cè)方法具有創(chuàng)傷小、檢測(cè)快速、高通量、靈敏性和特異性好等特點(diǎn)，能更 好地進(jìn)行乳腺癌的早期診斷及療效評(píng)價(jià)。
[0013] 本發(fā)明提供了RECQLRECQL4及RECQL5基因作為聯(lián)合標(biāo)志物在制備乳腺癌檢測(cè)和 /或療效評(píng)價(jià)試劑中的應(yīng)用。
[0014] 人類(lèi)RecQ旋解酶是一種多功能DNA旋解酶，能利用水解Ξ憐酸核巧（NTPs)產(chǎn)生 的能量分離雙核巧酸鏈，在DNA代謝的多個(gè)方面發(fā)揮重要作用，參與各種類(lèi)型的DNA修復(fù)， 包括錯(cuò)配修復(fù)、核巧酸切除修復(fù)和直接修復(fù)酶。
[0015]RECQLRECQL4及RECQL5基因均是RecQDNA解旋酶家族的成員。研究表明RECQL 基因突變與腫瘤易感性密切相關(guān)，如：乳腺癌、骨肉瘤及可切除膜腺癌等。RECQL4廣泛參與 DNA的復(fù)制和損傷修復(fù)。早期研究證實(shí)，RECQL4突變會(huì)導(dǎo)致RTS，BGS和RAPA3種綜合癥， 其中RTS和BGS患者都有很高的骨肉瘤和淋己瘤發(fā)生傾向。此外，RECQL4還可通過(guò)維持 線粒體和端粒的基因穩(wěn)定避免多種腫瘤發(fā)生，RECQL4也被認(rèn)為與血液惡性腫瘤爆發(fā)相關(guān)。 最近的一項(xiàng)研究表明，RECQL5基因位點(diǎn)突變與乳腺癌相關(guān)燈umorBiol. 2014 ;35:12201 -12204)。上述基因作為腫瘤的易感基因，目前的研究重點(diǎn)為DM位點(diǎn)突變與疾病的相關(guān)性， 但是易感基因位點(diǎn)突變多用來(lái)提供某種疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)，只檢測(cè)易感基因的位點(diǎn)突變并不 適用于臨床進(jìn)行疾病的診斷和療效評(píng)估?；诖?，我們對(duì)上述易感基因的表達(dá)量與乳腺癌 的關(guān)系進(jìn)行了考察。
[0016] 我們發(fā)現(xiàn)并通過(guò)研究證實(shí)外周血單核細(xì)胞中和尿液游離的RECQLRECQL4及 RECQL5基因的mRNA表達(dá)水平在患者體液尤其是外周血單核細(xì)胞和尿液中發(fā)生顯著變化， 并且運(yùn)種變化與乳腺癌的發(fā)生和治療密切相關(guān)，RECQLRECQL4及RECQL5基因的mRNA表達(dá) 可W作為乳腺癌早期診斷及療效評(píng)價(jià)的生物標(biāo)志物。
[0017] 本發(fā)明還提供乳腺癌檢測(cè)和/或療效評(píng)價(jià)的特異性RT-PCR引物和探針，包括 RECQLRECQL4及RECQL5基因的特異性擴(kuò)增引物及探針，探針的核巧酸序列5'端連接有巧 光報(bào)告基團(tuán)，非5'端連接有巧光澤滅基團(tuán)，其中
[001引 REC化擴(kuò)增引物組的核巧酸序列如沈QIDN01~2所示，
[0019]REC化特異性探針的核巧酸序列如SEQIDNO: 3所示；
[0020]RECQL4擴(kuò)增引物組的核巧酸序列如沈QIDNO:4~5所示，
[0021]RECQL4特異性探針的核巧酸序列如SEQIDN0:6所示；
[002引 RECQL5擴(kuò)增引物組的核巧酸序列如沈QIDNO:7~8所示，
[0023] RECQL5特異性探針的核巧酸序列如SEQIDN0:9所示。
[0024] 本發(fā)明篩選的上述引物及探針序列，能夠高效特異地?cái)U(kuò)增相應(yīng)基因，只需采取待 檢測(cè)者的外周血和晨尿即可，可廣泛運(yùn)用于乳腺癌患者RECQLRECQL4及RECQL5基因擴(kuò)增 水平的檢測(cè)，采用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行Ξ個(gè)祀基因的定量測(cè)定，具有特異性和靈敏度高、操作 簡(jiǎn)單及易于大通量篩查的優(yōu)點(diǎn)。
[00巧]優(yōu)選地，上述乳腺癌檢測(cè)和/或療效評(píng)價(jià)的特異性RT-PCR引物和探針，還包括內(nèi) 參基因GAPDH的特異性擴(kuò)增引物及探針，
[002引 GAPDH擴(kuò)增引物組的核巧酸序列如沈Q ID NO: 10~11所示，
[0027] GAPDH特異性探針的核巧酸序列如SEQ ID NO: 12所示；
[0028] 探針的核巧酸序列5'端連接有巧光報(bào)告基團(tuán)，非5'端連接有巧光澤滅基團(tuán)。
[0029] GAPDH主要目的是作為內(nèi)參，W矯正檢測(cè)偏差，進(jìn)一步提高引物組的檢測(cè)精準(zhǔn)度。
[0030] 優(yōu)選地，上述任一乳腺癌檢測(cè)和/或療效評(píng)價(jià)的特異性RT-PCR引物和探針，探針 的核巧酸序列5'端連接有巧光報(bào)告基團(tuán)FAM，3'端連接有巧光澤滅基團(tuán)TAMRA。FAM即6-簇 基巧光素，TAMRA即6-簇基四甲基羅丹明。
[0031] 本發(fā)明還提供一種乳腺癌檢測(cè)和/或療效評(píng)價(jià)試劑盒，包括W上任一所述的檢測(cè) 乳腺癌的特異性RT-PCR引物和探針。
[0032] 優(yōu)選地，上述乳腺癌檢測(cè)和/或療效評(píng)價(jià)試劑盒中，還包括陽(yáng)性模板，陽(yáng)性模板包 括純化后的：REC化基因擴(kuò)增產(chǎn)物、RECQL4基因擴(kuò)增產(chǎn)物、RECQL5基因擴(kuò)增產(chǎn)物和GAPDH基 因擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0033] 該四種基因擴(kuò)增產(chǎn)物的陽(yáng)性模板，主要用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，方便對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn) 行定量分析。
[0034] 優(yōu)選地，上述乳腺癌檢測(cè)和/或療效評(píng)價(jià)試劑盒，分為RECQL、RECQL4、RECQL5和 GAPDH運(yùn)4個(gè)基因的實(shí)時(shí)巧光定量PCR反應(yīng)體系和運(yùn)4個(gè)基因的陽(yáng)性模板體系，其中，
[003引每個(gè)基因的實(shí)時(shí)巧光定量PCR反應(yīng)體系19.0化，包括PCR反應(yīng)緩沖液10化、 濃度10μΜ的該基因擴(kuò)增引物各0.8 濃度2μΜ的該基因特異性探針1.0μL和 RNase-freewater7. 2μL;
[0036] 每個(gè)基因的陽(yáng)性模板體系包括濃