一種環(huán)狀rna在結(jié)直腸癌檢驗(yàn)標(biāo)志物中的應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種環(huán)狀RNA(Circular RNA\circRNA)(FAT1-circRNA)在結(jié)直腸癌檢驗(yàn)標(biāo)志物中的應(yīng)用，這種環(huán)狀RNA(FAT1-circRNA)長(zhǎng)3284bp，位于人類(lèi)的第4條染色體上，F(xiàn)AT1是該circRNA的覆蓋基因。本發(fā)明可用于鑒別結(jié)直腸癌手術(shù)對(duì)象的病理分型，再或者確定先前經(jīng)手術(shù)的對(duì)象的手術(shù)預(yù)后的方法。本發(fā)明制備了篩查這種環(huán)狀RNA(FAT1-circRNA)的引物。所述方法包括檢測(cè)來(lái)自所述對(duì)象的癌癥和癌旁組織樣品中的FAT1-circRNA的量，其中較高量的FAT1-circRNA與所述對(duì)象結(jié)直腸癌預(yù)后不良的可能性增加相關(guān)。具有制備臨床結(jié)直腸癌檢驗(yàn)標(biāo)志物的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
-種環(huán)狀RNA在結(jié)直腸癌檢驗(yàn)標(biāo)志物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于天然核糖核巧酸的用途，設(shè)及環(huán)狀核糖核巧酸（FATl-circRNA)的用 途，尤其設(shè)及FATl-circRNA結(jié)直腸癌患者的新的檢驗(yàn)標(biāo)記中的用途，用于鑒別結(jié)直腸癌及 更不良預(yù)后的對(duì)象。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)直腸癌又稱(chēng)大腸癌，是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤。結(jié)腸癌在早期并無(wú)明顯癥狀， 直到發(fā)病中晚期發(fā)現(xiàn)。提高結(jié)直腸癌的早期診斷率對(duì)于及時(shí)治療和改善預(yù)后至關(guān)重要。 如通過(guò)在結(jié)直腸癌中出現(xiàn)的FATl-circRNA所證明的，已知在結(jié)直腸癌組織中有異常的 FATl-circRNA表達(dá)?？紤]到FATl-circRNA表達(dá)量在結(jié)直腸癌中可升高或降低，因此提供了 疾病進(jìn)展的病理學(xué)指征。
[0003] circRNA廣泛存在于各種生物細(xì)胞中，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、豐度高和組織特異性表達(dá) 等特征。是基因組DNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)過(guò)程中，環(huán)化成環(huán)形RNA，的一類(lèi)非編碼RNA。研究表明， 一些circRNA作為競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA(ceRNA)來(lái)發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)控的作用。circRNA利用其 microRNAOniRNA)應(yīng)答元件結(jié)合miRNA，W阻斷miRNA對(duì)其祀標(biāo)基因表達(dá)的抑制作用，從而 調(diào)控其他相關(guān)mRNA的表達(dá)水平。circRNA在基因表達(dá)調(diào)控中重要作用的發(fā)現(xiàn)提示circRNA 在藥物開(kāi)發(fā)和疾病診治中具有良好的應(yīng)用前景。
[0004] circRNA作為一種調(diào)控性RNA(Regulato巧RNA)近幾年成為腫瘤研究的熱點(diǎn)領(lǐng) 域。circRNAs其表達(dá)具備組織特異性。circRNA中既有一部分作為競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA(ceRNA) 來(lái)發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)控的作用。Thomas B. Hansen等人通過(guò)對(duì)人AGO蛋白和miR-7的分析研 究，證明了 CircRNA作為高效的microRNA海綿的作用。circRNAs在腫瘤和正常組織中的表 達(dá)水平差別十分顯著，甚至能達(dá)到數(shù)百甚至數(shù)千倍，運(yùn)種顯著的差異使得其在成為候選標(biāo) 志物上具有明顯優(yōu)勢(shì)。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽(yáng)0〇5] 本發(fā)明的目的是提供環(huán)狀RNA (Circular RNA\circRNA) FATl-circRNA在結(jié)直腸癌 檢驗(yàn)標(biāo)志物中的應(yīng)用，英文名FATl-circRNA，F(xiàn)ATl-circRNA位于人類(lèi)的第4條染色體上， FATl-circRNA的堿基序列結(jié)構(gòu)，F(xiàn)AT1是該circRNA的覆蓋基因。
[0006] 本發(fā)明提供了鑒別可能患有結(jié)直腸癌的對(duì)象或結(jié)直腸癌的分期，再或者對(duì)先前經(jīng) 鑒別患有結(jié)直腸癌的對(duì)象的預(yù)后進(jìn)行確定的方法及其引物序列結(jié)構(gòu)、PCR產(chǎn)物識(shí)別序列。 陽(yáng)007] 所述方法包括檢測(cè)來(lái)自所述對(duì)象的樣品中的FATl-circRNA量，其中較高量的 FATl-circRNA與所述對(duì)象患有結(jié)直腸癌的可能性增加或者結(jié)直腸癌預(yù)后不佳的可能性增 加相關(guān)。
[0008] 本發(fā)明的有益效果有：1)提出了 FATl-circRNA的用途；2)本發(fā)明的研究表明異 常的量的FATl-circRNA與所述結(jié)直腸癌手術(shù)對(duì)象的分型或者可能提示結(jié)直腸癌預(yù)后不 佳。3) circRNA具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、豐度高和組織特異性表達(dá)等特征。且circRNA在結(jié)直腸癌病 人的癌組織和癌旁組織中表達(dá)量存在差異，因此FATl-circRNA具有成為結(jié)直腸癌檢驗(yàn)標(biāo) 志物的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0009] 圖1為FATl-circRNA的PCR識(shí)別序列與PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果的對(duì)比圖。
[0010] 圖2為使用FATl-circRNA篩查引物對(duì)癌癥細(xì)胞系表達(dá)量篩查的結(jié)果圖。
[0011] 圖3為使用FATl-circRNA篩查引物對(duì)病人組織樣品表達(dá)量篩查的結(jié)果圖。 陽(yáng)01引 圖4為FATl-circRNA的簡(jiǎn)易結(jié)構(gòu)及引物位置圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)步驟對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述。
[0014] 1)實(shí)驗(yàn)材料；
[0015] 臨床樣品：8株細(xì)胞系由北京基因組研究所提供；1例結(jié)直腸癌病人的癌組織和癌 旁組織樣品由301醫(yī)院所提供。
[0016] 試劑：FATl-circRNA篩查引物由生工生物工程（上海）股份有限公司北京引物 合成部合成；Trizol (貨號(hào)15596-018)購(gòu)自Invitrogen;氯仿（貨號(hào)20100927)購(gòu)自北京 化工，異丙醇（貨號(hào)1205031)購(gòu)自西晚化工，乙醇（貨號(hào)101860)購(gòu)自北化經(jīng)銷(xiāo)；Random primers(貨號(hào) Cl 181)，M-MLV(貨號(hào) M1705)，RNasin? Ribonuclease Inhibitor (貨 號(hào) 2511)，Nuclease-Free Water(貨號(hào) 2511)，dNTP mix(貨號(hào) P1195)均購(gòu)自 Promega; SYBR? Premix Ex TaqTM II (貨號(hào) DRR081A)購(gòu)自 Takara Mineral oil (貨號(hào) D7295)購(gòu) 自 Sigma。
[0017] 2)實(shí)驗(yàn)方法;
[0018] A、細(xì)胞系/結(jié)直腸癌癌變組織/癌旁組織RNA提取
[0019] 稱(chēng)取1克組織材料，液氮研磨后，轉(zhuǎn)移至1. 5毫升RNase-化ee的離屯、管中，混勻 后室溫靜置5分鐘左右。加入200微升的氯仿，混勻。11000轉(zhuǎn)每分鐘離屯、10分鐘。取上 清加入200微升的氯仿抽提，11000轉(zhuǎn)每分鐘離屯、10分鐘。取上清加入500微升的異丙 醇，-20°C沉淀10分鐘。11000轉(zhuǎn)每分鐘離屯、15分鐘，將沉淀轉(zhuǎn)移至1. 5毫升RNase-化ee 離屯、管中，預(yù)冷的75 %乙醇洗涂2遍，驚干，RNase-化ee水溶解（根據(jù)情況適當(dāng)溶解，一般 是20-35微升）。Nano化op測(cè)算所得粗提液的0D值W及濃度。
[0020] B、表達(dá)量篩查
[0021] l.cDNA 合成
[0022] 1-2微克RNA到14微升RNase-free水中，再加1微升random primer輕柔混勻后 加入0. 2毫升PCR管中。PCR儀70°C解育5分鐘?？焖俜旁诒?分鐘。
[0023] 配置反應(yīng)混合物：
[0024]
[0025] 42°C解育1小時(shí)，70°C解育15分鐘，4°C保溫。
[0026] 2. Real-time PCR
[0027] cDNA中加入50微升的d地2〇。
[0028] 在冰上制備QPCR混合物：
[0029]
[0030] 每管中加入10微升礦物油。離屯、機(jī)1000轉(zhuǎn)每分鐘離屯、1分鐘。將樣品放置入 QPCR儀中運(yùn)行，程序如下：
[0031] 陽(yáng)0巧 如實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
陽(yáng)03引參見(jiàn)圖1和圖2,圖1為FATl-circRNA的PCR識(shí)別序列與PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果的 對(duì)比圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FATl-circRNA的PCR識(shí)別序列與PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果比對(duì)成功， FATl-circRNA在結(jié)直腸癌病人的癌組織和癌旁組織中表達(dá)。圖2為使用FATl-circRNA篩 查引物對(duì)癌癥細(xì)胞系組織樣品表達(dá)量篩查的結(jié)果圖。結(jié)果中細(xì)胞系C0L0-320和NCI-H716 的FATl-circRNA表達(dá)量下降了，NCI-H716下降到了肥K293細(xì)胞的0. 1269462倍，LoVo、 SW480、肥T116和HT29的表達(dá)量增加了，尤其W LoVo表達(dá)量增加的最大到達(dá)了肥K293細(xì) 胞的4. 530092倍。圖3為使用FATl-circRNA篩查引物對(duì)病人組織樣品表達(dá)量篩查的結(jié)果 圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FATl-circRNA在結(jié)直腸癌病人的癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異較大， 癌組織相對(duì)于癌旁組織下調(diào)0. 6171415倍。如此大的表達(dá)差異給了 FATl-circRNA作為結(jié) 直腸癌檢驗(yàn)標(biāo)志物的應(yīng)用前景。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種環(huán)狀RNA (Circular RNA\circRNA)FATl_circRNA在制備結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物 中的應(yīng)用，其特征在于，所述FATl-circRNA長(zhǎng)3284bp，位于人類(lèi)的第4條染色體上，所述 FATl-circRNA的堿基序列如SEQ ID NO :1所示。2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其包括檢測(cè)來(lái)自可能患有結(jié)直腸癌的對(duì)象的樣品中的 FATl-circRNA量，其中較高量的FATl-circRNA與所述對(duì)象患有結(jié)直腸癌的可能性增加或 者結(jié)直腸癌預(yù)后不佳的可能性增加相關(guān)。3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，在結(jié)直腸癌治療后較低水平的FATl-circRNA表示治療起 作用。4. 如權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，所述FATl-circRNA的量是樣品中癌組織與癌旁組織 的絕對(duì)量。5. 如權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其中所述FATl-circRNA的量是從來(lái)自對(duì)象的血清樣 品中確定的。6. 如權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其中所述FATl-circRNA的量是從來(lái)自對(duì)象的血漿樣 品中確定的。7. -種檢測(cè)結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物的引物，其特征在于，所述引物用于鑒定 FATl-circRNA，所述FATl-circRNA長(zhǎng)3284bp，位于人類(lèi)的第4條染色體上，所述 FATl-circRNA的堿基序列如SEQ ID NO :1所示。8. 如權(quán)利要求7所述的檢測(cè)引物，其用于獲得癌組織與癌旁組織的FATl-circRNA表達(dá) 量，通過(guò)將二者對(duì)比來(lái)指示對(duì)象中患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)增加或預(yù)后不良。9. 一種檢測(cè)結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物的試劑盒，其特征在于，包括用于鑒定FATl-circRNA 的引物、探針、引物組合或探針組合，所述FATl-circRNA長(zhǎng)3284bp，位于人類(lèi)的第4條染色 體上，所述FATl-circRNA的堿基序列如SEQ ID NO :1所示。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK106047989SQ201510160145
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2015年4月8日
【發(fā)明人】張悅, 栗世鈾, 賈寶慶, 劉洪 , 劉洪一, 宋福海, 黃亮
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所