一種與乳腺癌輔助診斷相關的snp標志物及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程及腫瘤學領域，公開了一種與乳腺癌輔助診斷相關的SNP標志物及其應用。該標志物為rs10152591、rs1037699、rs10487075、rs11645106、rs11663688、rs11768670、rs11910707、rs12972670、rs13038095、rs142255517、rs142895740、rs144600021、rs17128116、rs2053026、rs213212、rs2229300、rs2981582、rs35002951、rs3748140等32個SNP的組合。該標志物可用于制備乳腺癌輔助診斷試劑盒。
【專利說明】一種與乳腺癌輔助診斷相關的SNP標志物及其應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程及腫瘤學領域，涉及一種乳腺癌輔助診斷相關的SNP標志物及其應用。

【背景技術】
[0002]乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，嚴重威脅女性健康。據統計，2012年全球有168萬乳腺癌新發(fā)病例，約占女性所有惡性腫瘤新發(fā)病例的25.2%。我國乳腺癌的發(fā)病率雖低于西方發(fā)達國家，但近二十年來，其仍以每年3-5 %的速度遞增，遠高于0.5 %的世界平均增長水平。雖然乳腺癌的預后較好，但是由于其高發(fā)病率，仍然是女性惡性腫瘤死亡的首要原因。2012年，我國因乳腺癌死亡的女性達4.8萬人。因此，乳腺癌已成為威脅我國女性健康的首要惡性腫瘤，是亟待解決的重大公共衛(wèi)生問題。
[0003]目前，對乳腺癌的一級預防(病因預防)尚無明確、有效的預防措施，但是若能加強二級預防工作，如早期發(fā)現、早期診斷、早期治療，預后一般較好，能降低乳腺癌死亡率，提高患者生活質量。因此，爭取早期診斷是乳腺癌防治的一項基本策略。目前早期診斷乳腺癌的方式主要有乳腺增生患者的定期篩查、乳腺的自我檢查、乳腺影像學檢查(乳腺鑰靶X線攝影、乳腺彩色多譜勒超聲檢查、CT和磁共振等)以及乳腺癌的病理檢查(細胞學穿刺檢查和組織學檢查)。雖然乳腺癌的早期檢測手段在不斷進步發(fā)展，但是真正有較好應用前景的早期診斷方法尚有限，有些早期患者腫塊較小、邊界清楚且活動性好，不易與良性腫瘤相鑒別。一些年輕女性對乳腺檢查不夠重視并且存在一定的抗拒心理，也會阻礙乳腺癌的早期診斷。一旦延誤病情，發(fā)展至晚期，其預后往往較差。因此，亟需尋找更加明確而有效的生物標志物用于乳腺癌的早期明確診斷，實現患者早期治療，從而切實提高乳腺癌的預后。
[0004]研究表明，除了月經生育史以及一些其他環(huán)境暴露因素外，遺傳因素是引發(fā)乳腺癌的主要原因。其中，單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)發(fā)揮了重要作用。SNP是指單個核苷酸的改變而引起的DNA序列的改變，它是人類最常見的可遺傳變異，在人類基因組中廣泛存在。SNP賦予個體對環(huán)境暴露、藥物治療等的不同反應，從而產生不同的表型，因此SNP可能是導致個體疾病發(fā)生發(fā)展差異的重要遺傳基礎。利用疾病易感的SNP譜診斷疾病，具有快速、靈敏、準確等特點，因而應用前景廣闊。近年來，利用SNP診斷疾病的發(fā)生發(fā)展已成為臨床和科研工作者的研究熱點。
[0005]然而，目前還沒有將SNP應用于乳腺癌診斷的報道，若能篩選出乳腺癌易感的SNP作為生物標志物，并研制相應的診斷試劑盒，必將有力地推動我國乳腺癌早期診斷的現狀，并為其藥物篩選、藥效評價及靶向治療開辟新的途徑。


【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對上述技術問題，提出一種與乳腺癌輔助診斷相關的SNP標志物。
[0007]本發(fā)明的第二個目的是提供上述SNP標志物的特異性擴增引物。
[0008]本發(fā)明的第三個目的是提供上述SNP標志物的特異性延伸引物。
[0009]本發(fā)明的第四個目的是提供上述SNP標志物及其特異性擴增引物和特異性延伸引物在制備乳腺癌輔助診斷試劑盒中的應用。
[0010]本發(fā)明的第五個目的是提供乳腺癌輔助診斷試劑盒。
[0011]發(fā)明人通過分離和研究乳腺癌患者及與其年齡匹配的健康女性對照外周血DNA中的單核苷酸多態(tài)性，尋找一組與乳腺癌高度相關的高特異性和敏感性的SNP，并研制出可便于臨床應用的乳腺癌輔助診斷試劑盒，為乳腺癌的篩查和診斷提供數據支持。
[0012]本發(fā)明的目的是通過下列技術方案實現的:
[0013]一種與乳腺癌輔助診斷相關的SNP標志物，該標志物為rsl0152591、rsl037699、rsl0487075、rsll645106、rsll663688、rsll768670、rsll910707、rsl2972670、rsl3038095、rsl42255517、rsl42895740、rsl44600021、rsl7128116、rs2053026、rs213212、rs2229300、rs2981582、rs35002951、rs3748140、rs3757318、rs498114、rs549652、rs6433379、rs6932260、rs7833986、rs8190955、rs871545、rs905799、rs925946、rs9397426、rs9469578和rs9650315的組合。
[0014]所述的SNP標志物的特異性擴增引物，這些引物為:
[0015]rsl0152591 的擴增引物序列為 SEQ ID No:1 和 SEQ ID No:2 ；rsl037699 的擴增引物序列為SEQ ID No:4和SEQ ID No:5 ；rsl0487075的擴增引物序列為SEQ ID No:7和SEQ ID No:8 ;rsll645106 的擴增引物序列為 SEQ ID No:10 和 SEQ ID No:11 ；rsll663688的擴增引物序列為SE Q ID No:13和SEQ ID No:14 ;rsll768670的擴增引物序列為SEQ IDNo:16 和 SEQ ID No:17 ；rsll910707 的擴增引物序列為 SEQ ID No:19 和 SEQ ID No:20 ；rsl2972670的擴增引物序列為SEQ ID No:22和SEQ ID No:23 ;rsl3038095的擴增引物序列為 SEQ ID No:25和 SEQ ID No:26 ;rsl42255517 的擴增引物序列為 SEQ ID No:28和 SEQID No:29 ；rsl42895740 的擴增引物序列為 SEQ ID No:31 和 SEQ ID No:32 ；rsl44600021的擴增引物序列為SEQ ID No:34和SEQ ID No:35 ;rsl7128116的擴增引物序列為SEQ IDNo:37 和 SEQ ID No:38 ；rs2053026 的擴增引物序列為 SEQ ID No:40 和 SEQ ID No:41 ；rs213212的擴增引物序列為SEQ ID No:43和SEQ ID No:44 ；rs2229300的擴增引物序列為 SEQ ID No:46 和 SEQ ID No:47 ;rs2981582 的擴增引物序列為 SEQ ID No:49 和 SEQ IDNo:50 ；rs35002951 的擴增引物序列為 SEQ ID No:52 和 SEQ ID No:53 ；rs3748140 的擴增引物序列為SEQ ID No:55和SEQ ID No:56 ；rs3757318的擴增引物序列為SEQ ID No:58和 SEQ ID No:59 ；rs498114 的擴增引物序列為 SEQ ID No:61 和 SEQ ID No:62 ；rs549652的擴增引物序列為SEQ ID No:64和SEQ ID No:65 ;rs6433379的擴增引物序列為SEQ IDNo:67 和 SEQ ID No:68 ；rs6932260 的擴增引物序列為 SEQ ID No:70 和 SEQ ID No:71 ；rs7833986的擴增引物序列為SEQ ID No:73和SEQ ID No:74 ;rs8190955的擴增引物序列為 SEQ ID No:76 和 SEQ ID No:77 ；rs871545 的擴增引物序列為 SEQ ID No:79 和 SEQ IDNo:80 ；rs905799 的擴增引物序列為 SEQ ID No:82 和 SEQ ID No:83 ；rs925946 的擴增引物序列為SEQ ID No:85和SEQ ID No:86 ；rs9397426的擴增引物序列為SEQ ID No:88和SEQ ID No:89 ；rs9469578 的擴增引物序列為 SEQ ID No:91 和 SEQ ID No:92 ；rs9650315的擴增引物序列為SEQ ID No:94和SEQ ID No:95。
[0016]所述的SNP標志物的特異性延伸引物，這些引物為:
[0017]rsl0152591的延伸引物序列為SEQ ID No:3 ；rsl037699的延伸引物序列為SEQID No:6 ；rsl0487075的延伸引物序列為SEQ ID No:9 ；rsll645106的延伸引物序列為SEQID No:12 ;rsll663688的延伸引物序列為SEQ ID No:15 ;rsll768670的延伸引物序列為SEQ ID No:18 ;rsll910707的延伸引物序列為SEQ ID No:21 ;rsl2972670的延伸引物序列為 SEQ ID No:24 ;rsl3038095 的延伸引物序列為 SEQ ID No:27 ;rsl42255517 的延伸引物序列為 SEQ ID No:30 ；rsl42895740 的延伸引物序列為 SEQ ID No:33 ；rsl44600021 的延伸引物序列為SEQ ID No:36 ;rsl7128116的延伸引物序列為SEQ ID No:39 ;rs2053026的延伸引物序列為SEQ ID No:42 ;rs213212的延伸引物序列為SEQ ID No:45 ;rs2229300的延伸引物序列為SEQ ID No:48 ；rs2981582的延伸引物序列為SEQ ID No:51 ；rs35002951的延伸引物序列為SEQ ID No:54 ;rs3748140的延伸引物序列為SEQ ID No:57 ；rs3757318的延伸引物序列為SEQ ID No:60 ;rs498114的延伸引物序列為SEQ ID No:63 ；rs549652的延伸引物序列為SEQ ID No:66 ;rs6433379的延伸引物序列為SEQ ID No:69 ；rs6932260的延伸引物序列為SEQ ID No -J2 ;rs7833986的延伸引物序列為SEQ ID No:75 ；rs8190955的延伸引物序列為SE Q ID No:78 ;rs871545的延伸引物序列為SEQ ID No:81 ；rs905799的延伸引物序列為SEQ ID No:84 ；rs925946的延伸引物序列為SEQ ID No:87 ；rs9397426的延伸引物序列為SEQ ID No:90 ;rs9469578的延伸引物序列為SEQ ID No:93 ；rs9650315的延伸引物序列為SEQ ID No:96o
[0018]所述的SNP標志物在制備乳腺癌輔助診斷試劑盒中的應用。
[0019]所述的SNP標志物的特異性擴增引物在制備乳腺癌輔助診斷試劑盒中的應用。
[0020]所述的SNP標志物的特異性延伸引物在制備乳腺癌輔助診斷試劑盒中的應用。
[0021]一種乳腺癌輔助診斷試劑盒，該試劑盒用于檢測外周血DNA中rsl0152591、rsl037699、rsl0487075、rsll645106、rsll663688、rsll768670、rsll910707、rsl2972670、rsl3038095、rsl42255517、rsl42895740、rsl44600021、rsl7128116、rs2053026、rs213212、rs2229300、rs2981582、rs35002951、rs3748140、rs3757318、rs498114、rs549652、rs6433379、rs6932260、rs7833986、rs8190955、rs871545、rs905799、rs925946、rs9397426、rs9469578 和 rs9650315。
[0022]所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有上述SNP標志物的特異性擴增引物和/或特異性延伸引物。
[0023]所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有的SNP標志物的特異性擴增引物為:
[0024]rsl0152591 的擴增引物序列為 SEQ ID No:1 和 SEQ ID No:2 ；rsl037699 的擴增引物序列為SEQ ID No:4和SEQ ID No:5 ；rsl0487075的擴增引物序列為SEQ ID No:7和SEQ ID No:8 ;rsll645106 的擴增引物序列為 SEQ ID No:10 和 SEQ ID No:11 ；rsll663688的擴增引物序列為SEQ ID No:13和SEQ ID No:14 ;rsll768670的擴增引物序列為SEQ IDNo:16 和 SEQ ID No:17 ；rsll910707 的擴增引物序列為 SEQ ID No:19 和 SEQ ID No:20 ；rsl2972670的擴增引物序列為SEQ ID No:22和SEQ ID No:23 ;rsl3038095的擴增引物序列為 SEQ ID No:25和 SEQ ID No:26 ;rsl42255517 的擴增引物序列為 SEQ ID No:28和 SEQID No:29 ；rsl42895740 的擴增引物序列為 SEQ ID No:31 和 SEQ ID No:32 ；rsl44600021的擴增引物序列為SEQ ID No:34和SEQ ID No:35 ;rsl7128116的擴增引物序列為SEQ IDNo:37 和 SEQ ID No:38 ；rs2053026 的擴增引物序列為 SEQ ID No:40 和 SEQ ID No:41 ；rs213212的擴增引物序列為SEQ ID No:43和SEQ ID No:44 ；rs2229300的擴增引物序列為 SEQ ID No:46 和 SEQ ID No:47 ;rs2981582 的擴增引物序列為 SEQ ID No:49 和 SEQ IDNo:50 ；rs35002951 的擴增引物序列為 SEQ ID No:52 和 SEQ ID No:53 ；rs3748140 的擴增引物序列為SEQ ID No:55和SEQ ID No:56 ；rs3757318的擴增引物序列為SEQ ID No:58和 SEQ ID No:59 ；rs498114 的擴增引物序列為 SEQ ID No:61 和 SEQ ID No:62 ；rs549652的擴增引物序列為SEQ ID No:64和SEQ ID No:65 ;rs6433379的擴增引物序列為SEQ IDNo:67 和 SEQ ID No:68 ；rs6932260 的擴增引物序列為 SEQ ID No:70 和 SEQ ID No:71 ；rs7833986的擴增引物序列為SEQ ID No:73和SEQ ID No:74 ;rs8190955的擴增引物序列為 SEQ ID No:76 和 SEQ ID No:77 ；rs871545 的擴增引物序列為 SEQ ID No:79 和 SEQ IDNo:80 ；rs905799 的擴增引物序列為 SEQ ID No:82 和 SEQ ID No:83 ；rs925946 的擴增引物序列為SEQ ID No:85和SEQ ID No:86 ；rs9397426的擴增引物序列為SEQ ID No:88和SEQ ID No:89 ；rs9469578 的擴增引物序列為 SEQ ID No:91 和 SEQ ID No:92 ；rs9650315的擴增引物序列為SEQ ID No:94和SEQ ID No:95。
[0025]所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有的SNP標志物的特異性延伸引物為:
[0026]rsl0152591的延伸引物序列為SEQ ID No:3 ；rsl037699的延伸引物序列為SEQID No:6 ；rsl0487075的延伸引物序列為SEQ ID No:9 ；rsll645106的延伸引物序列為SEQID No:12 ;rsll663688的延伸引物序列為SEQ ID No:15 ;rsll768670的延伸引物序列為SEQ ID No:18 ;rsll910707的延伸引物序列為SEQ ID No:21 ;rsl2972670的延伸引物序列為 SEQ ID No:24 ;rsl3038095 的延伸引物序列為 SEQ ID No:27 ;rsl42255517 的延伸引物序列為 SEQ ID No:30 ；rsl42895740 的延伸引物序列為 SEQ ID No:33 ；rsl44600021 的延伸引物序列為SEQ ID No:36 ;rsl7128116的延伸引物序列為SEQ ID No:39 ;rs2053026的延伸引物序列為SEQ ID No:42 ;rs213212的延伸引物序列為SEQ ID No:45 ;rs2229300的延伸引物序列為SEQ ID No:48 ；rs2981582的延伸引物序列為SEQ ID No:51 ；rs35002951的延伸引物序列為SEQ ID No:54 ;rs3748140的延伸引物序列為SEQ ID No:57 ；rs3757318的延伸引物序列為SEQ ID No:60 ;rs498114的延伸引物序列為SEQ ID No:63 ；rs549652的延伸引物序列為SEQ ID No:66 ;rs6433379的延伸引物序列為SEQ ID No:69 ；rs6932260的延伸引物序列為SEQ ID No -J2 ;rs7833986的延伸引物序列為SEQ ID No:75 ；rs8190955的延伸引物序列為SEQ ID No:78 ;rs871545的延伸引物序列為SEQ ID No:81 ；rs905799的延伸引物序列為SEQ ID No:84 ；rs925946的延伸引物序列為SEQ ID No:87 ；rs9397426的延伸引物序列為SEQ ID No:90 ;rs9469578的延伸引物序列為SEQ ID No:93 ；rs9650315的延伸引物序列為SEQ ID No:96o
[0027]所述診斷試劑盒，該試劑盒還可以包括PCR反應常用的酶和試劑，如Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、去離子水等；還可以含有標準品和/或對照品。
[0028]具體地說，本發(fā)明解決問題的技術方案包括:(I)建立統一標準的標本庫和數據庫:以標準操作程序(SOP)采集符合標準的血液樣本，系統收集完整的人口學資料和臨床資料。(2)基因型檢測:選擇乳腺癌病例、與乳腺癌病例年齡匹配的健康女性對照，利用高密度SNP芯片，找出與乳腺癌相關的SNP。(3)對篩選出的陽性關聯SNP，進一步采用Sequenom MassARRAY基因分型平臺進行檢測,驗證其應用于臨床診斷的可重復性。(4)乳腺癌輔助診斷試劑盒的研制:根據乳腺癌病例和健康女性對照中基因型分布頻率有顯著差異的SNP開發(fā)SNP輔助診斷試劑盒。
[0029]本發(fā)明人以標準操作程序(SOP)采集符合標準的血液樣本，系統收集完整的人口學資料、臨床資料等，并米用了 Illumina ΙηΠη?ιιηι? Human Exome BeadChip進行掃描，Sequenom MassARRAY基因分型進行單個位點的檢測等。
[0030]具體來說研究的實驗方法主要包括以下幾個部分:
[0031]1.研究樣本的選擇
[0032](I)經病理學明確診斷的乳腺癌病例；
[0033](2)采血前未接受過放療或化療、無既往腫瘤病史；
[0034](3)與病例年齡匹配的健康女性對照
[0035]本研究共采用2137例符合標準的樣本進行研究。
[0036]2.酚-氯仿法提取外周血基因組DNA，按常規(guī)方法操作。通常能得到20_50ng/μ IDNA，純度(紫外 2600D:2800D)在 1.6-2.0。
[0037]3.全外顯子芯片檢測
[0038](I)取受試者全基因組DNA樣本；
[0039](2)在全外顯子芯片(Illumina公司，下同)上進行掃描；
[0040](3)檢測并比較各基因型在乳腺癌病例與健康女性對照中的分別差異。
[0041]4.單個 SNP 的 Sequenom MassARRAY 基因分型
[0042](I)取受試者DNA樣本；
[0043](2)設計單個SNP的特異性擴增引物和特異性延伸引物；
[0044](3)進行 PCR 反應；
[0045](4)檢測并比較乳腺癌病例與健康女性對照中不同基因型的分布差異。
[0046]5.診斷試劑盒制備方法
[0047]全外顯子芯片進行掃描和單個SNP檢測后確定乳腺癌病例與健康女性對照中基因型分布頻率有顯著差異的SNP，作為乳腺癌診斷的指標。篩選出的與乳腺癌發(fā)病有關的SNP 組成輔助診斷試劑盒(rsl0152591、rsl037699、rsl0487075、rsll645106、rsll663688、rsll768670、 rsll910707、 rsl2972670、 rsl3038095、 rsl42255517、 rsl42895740、rsl44600021、rsl7128116、rs2053026、rs213212、rs2229300、rs2981582、rs35002951、rs3748140、rs3757318、rs498114、rs549652、rs6433379、rs6932260、rs7833986、rs8190955、rs871545、 rs905799、rs925946、rs9397426、rs9469578 和 rs9650315)。診斷試劑可以包括這些SNP的特異性擴增引物和特異性延伸引物，以及Taq酶、dNTP等試劑。
[0048]6.統計分析方法
[0049]運用X 2檢驗(用于分類變量)或者student t檢驗(用于連續(xù)性變量)比較人口學特征等在研究對象組間分布的差異。用logistic回歸分析中的additive模型進行關聯分析。
[0050]為了進一步研究這32個SNP構成的綜合指征用于早期診斷的效果，我們構建了一個數學公式，綜合考慮每個SNP與乳腺癌發(fā)病的正、負關聯情況和聯系強度。具體來說，我們對每個SNP的三種基因型進行評分，野生純合型=“0”，雜合型=“1”，變異純合型= “2”，以單個SNP分析時的additive模型下的回歸系數為權重，綜合考慮每個SNP的情況給每個研究對象確定一個危險分值。危險分值的計算方法如下:危險分值=(0.63Xrsl0152591 的評分)+ (0.62Xrsl037699 的評分)+ (0.55Xrsl0487075 的評分)+ (-0.34Xrsl 1645106 的評分)+ (0.45 Xrsl 1663688 的評分)+ (0.5 Xrsl 1768670 的評分)+ (0.36 Xrsl 1910707 的評分)+ (-0.38 Xrsl2972670 的評分)+ (0.63 Xrsl3038095 的評分)+ (-0.67Xrsl42255517 的評分)+ (0.53Xrsl42895740 的評分)+ (0.59Xrsl44600021的評分)+ (0.39Xrsl7128116 的評分)+ (0.65Xrs2053026 的評分)+ (0.61Xrs213212 的評分) + (-0.49Xrs2229300 的評分) + (0.27Xrs2981582 的評分) + (0.52Xrs35002951的評分) + (-0.43Xrs3748140 的評分) + (0.28Xrs3757318 的評分) + (0.51Xrs498114的評分) + (0.59Xrs549652 的評分) + (0.63Xrs6433379 的評分) + (0.29Xrs6932260的評分) + (0.48Xrs7833986 的評分) + (0.43Xrs8190955 的評分) + (0.43Xrs871545的評分)+ (0.3Xrs905799) + (0.44Xrs925946 的評分)+ (-0.3Xrs9397426 的評分)+ (0.47 X rs9469578的評分)+ (0.49 X rs9650315的評分)，獲得的危險分值系數以及界限值被直接應用于關聯研究的2137例樣本中。(以rsl0152591為例:0.63為rsl0152591的回歸系數(見表1) ；rsl0152591的評分，野生純合型= “0”，雜合型=“ 1”，變異純合型=“2”，某個SNP的基因型由儀器檢測結果確定；某個樣本的總評分是這些個SNP分別評分的總和，單個SNP的基因型只是計算評分的一個中間過程，不需要知道具體基因型。)
[0051]統計學分析均通過專門的統計學分析軟件完成(PLINK1.07)。統計學顯著性水平P值設為0.05，所有統計學檢驗均為雙側檢驗。
[0052]以下是本發(fā)明進一步的說明:
[0053]在上述1064例符合條件的乳腺癌病例及1073例健康女性對照中，兩組年齡均衡可比。我們將這兩組人群經全外顯子芯片進行掃描獲得相關結果。
[0054]根據全外顯子芯片檢測，本發(fā)明人檢測到在“乳腺癌病例”組合“健康女性對照”組中基因型分布頻率存在差異的SNP包括:rsl0152591、rsl037699、rsl0487075、rsll645106、 rsll663688、 rsll768670、 rsll910707、 rsl2972670、 rsl3038095、rsl42255517、rsl42895740、rsl44600021、rsl7128116、rs2053026、rs213212、rs2229300、rs2981582、rs35002951、rs3748140、rs3757318、rs498114、rs549652、rs6433379、rs6932260、rs7833986、rs8190955、rs871545、rs905799、rs925946、rs9397426、rs9469578和 rs9650315o
[0055]根據上述檢測結果，我們將這32個與乳腺癌發(fā)病相關的SNP采用SequenomMassARRAY基因分型平臺進行了單個SNP的檢測，結果與芯片檢測一致。
[0056]單因素和多因素Logistic回歸分析結果均表明，這32個SNP與乳腺癌的發(fā)病存在著顯著關聯，其中26個SNP為危險因素，變異等位基因可增加乳腺癌的發(fā)病風險，6個為保護因素，變異等位基因可降低乳腺癌的發(fā)病風險。
[0057]進一步分析這32個SNP的組合用于乳腺癌診斷的效果，發(fā)現其組合能夠很好的區(qū)分病例與對照。
[0058]根據上述實驗結果，本發(fā)明人制備了一種能用于乳腺癌輔助診斷的試劑盒，包含測定受試者血標本DNA中上述SNP的特異性擴增引物、特異性延伸引物和其他檢測試劑。
[0059]具體而言，這32個SNP的組合，或者這32個SNP的特異性擴增引物及特異性延伸引物的組合構成的相關診斷試劑盒有助于乳腺癌的輔助診斷，為臨床醫(yī)生快速準確掌握患者的疾病狀態(tài)和病情嚴重程度，及時采取更具個性化的防治方案提供支持。
[0060]本發(fā)明有益效果:
[0061]本發(fā)明提供的SNP標志物作為乳腺癌輔助診斷的標志物的優(yōu)越性在于:
[0062](I)SNP是一種新型基因生物標志物，區(qū)別于傳統生物標志物,穩(wěn)定、微創(chuàng)、易于檢測，將大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，該類生物標志物的成功開發(fā)將為乳腺癌的診斷和治療開創(chuàng)全新局面，為其他疾病生物標志物的研制提供借鑒。
[0063](2) SNP試劑盒是一種系統、全面的診斷試劑盒，可用于乳腺癌的輔助診斷，有助于反映患者的疾病狀態(tài)，為臨床醫(yī)生快速準確掌握患者病情、及時采取更具個性化的防治方案提供支持。
[0064](3)采用嚴密的評價體系，本發(fā)明人初期采用全外顯子芯片掃描獲取了疾病相關的SNP譜，并采用Sequenom MassARRAY基因分型平臺進行驗證；以上方法和策略的應用加速和保證了 SNP生物標志物和診斷試劑盒在臨床上的應用，也為其他疾病生物標志物的研制提供方法和策略上的借鑒。
[0065]本發(fā)明通過控制年齡等對疾病發(fā)展的影響因素，研究SNP在乳腺癌輔助診斷的應用前景，闡述SNP對于乳腺癌進展的影響，揭示其診斷價值。因此，本發(fā)明獲得了乳腺癌發(fā)病相關SNP譜和特異性標志物；通過SNP生物標志物和診斷試劑盒的研制和應用，可使得乳腺癌的診斷更加方便易行，為臨床醫(yī)生快速準確掌握患者病情，為臨床治療效果評價奠定基礎，并為發(fā)現具有潛在治療價值的新型小分子藥物靶標提供幫助。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0066]圖1:顯示乳腺癌病例組對健康女性對照組為參照的ROC曲線。

【具體實施方式】
[0067]實施例1樣品的收集和樣品資料的整理
[0068]發(fā)明人于2004年I月至2010年4月在江蘇地區(qū)醫(yī)院收集了大量的新發(fā)乳腺癌患者血標本，通過對樣品資料的整理，發(fā)明人從中選擇了 2137例符合下列標準的樣本全外顯子芯片掃描和單個SNP Sequenom MassARRAY基因分型的實驗樣品:
[0069]1、經病理學明確診斷的乳腺癌病例；
[0070]2、采血前未接受過放療或化療、無既往腫瘤病史；
[0071]3、與病例年齡匹配的健康女性對照
[0072]并系統采集了這些樣本的人口學資料和臨床資料等情況。
[0073]實施例2外周血DNA中SNP的全外顯子組檢測
[0074]在上述符合條件的1064例乳腺癌患者和1073例健康女性對照中，兩組年齡均衡可比。將這兩組人群經全外顯子芯片檢測獲得相關結果。具體步驟為:
[0075]1、向儲存于2ml凍存管中的外周血加入溶血試劑(即裂解液，40份量配置方法如下:蔗糖219.72g、氯化鎂2.02g和曲拉通X-100 (amresco0694) 20ml混合后，用TrisHcl溶液定容至2000ml,下同),顛倒混勻后完全轉入。
[0076]2、去除紅細胞:用溶血試劑將5ml離心管補至4ml,顛倒混勻,4000rpm離心10分鐘，棄上清。向沉淀中加入4ml溶血試劑,再次顛倒混勻清洗一次，4000rpm離心10分鐘,棄上清。
[0077]3、抽提DNA:向沉淀中加Iml抽提液(每300ml中含有122.5ml0.2M氯化鈉，14.4ml0.5M乙二胺四乙酸，15mll0%十二烷基硫酸鈉，148.1ml雙蒸水，下同)和8μ I蛋白酶K，振蕩器上充分振蕩混勻，37°C水浴過夜。
[0078]4、去除蛋白質:加Iml飽和酹充分混勻(手輕搖15分鐘)，4000rpm離心10分鐘，取上清轉入新的5ml離心管中。在上清液中加入等體積氯仿與異戊醇混合液(氯仿:異戊醇=24:1, v/v,下同)，充分混勻后(手搖15分鐘)，4000rpm離心10分鐘,取上清(分入兩個1.5ml的離心管)。
[0079]5、DNA沉淀:在上清液中加入3M的醋酸鈉60 μ 1，再加入與上清液等體積的冰無水乙醇，上下輕搖，可見白色絮狀沉淀物，再以12000rpm離心10min。
[0080]6、DNA洗漆:在沉淀中加入冰無水乙醇1ml, 12000rpm離心1min,棄上清后真空抽干或置于清潔干燥環(huán)境中蒸干。
[0081]7、測量濃度:通常能得到20-50ng/ μ I DNA,純度(紫外2600D:2800D)在1.6_2.0 ο
[0082]8、在全外顯子芯片(Illumina公司，下同)上進行掃描。
[0083]9、數據分析與處理:在“乳腺癌病例”組和“健康女性對照”組中發(fā)現的基因型分布頻率有顯著差異的SNP在上文中已經羅列出，結果見表1。
[0084]表1病例組與對照組外顯子關聯分析結果
[0085]

【權利要求】
1.一種與乳腺癌輔助診斷相關的SNP標志物，其特征在于該標志物為rsl0152591、rsl037699、rsl0487075、rsll645106、rsll663688、rsll768670、rsll910707、rsl2972670、rsl3038095、rsl42255517、rsl42895740、rsl44600021、rsl7128116、rs2053026、rs213212、rs2229300、rs2981582、rs35002951、rs3748140、rs3757318、rs498114、rs549652、rs6433379、rs6932260、rs7833986、rs8190955、rs871545、rs905799、rs925946、rs9397426、rs9469578 和 rs9650315 的組合。
2.權利要求1所述的SNP標志物的特異性擴增引物，其特征在于該引物為: rsl0152591 的擴增引物序列為 SEQ ID No:1 和 SEQ ID No:2 ； rsl037699 的擴增引物序列為 SEQ ID No:4 和 SEQ ID No:5 ； rsl0487075 的擴增引物序列為 SEQ ID No:7 和 SEQ ID No:8 ； rsll645106 的擴增引物序列為 SEQ ID No:10 和 SEQ ID No:11 ； rsll663688 的擴增引物序列為 SEQ ID No:13 和 SEQ ID No:14 ； rsll768670 的擴增引物序列為 SEQ ID No:16 和 SEQ ID No:17 ； rs11910707 的擴增引物序列為 SEQ ID No:19 和 SEQ ID No:20 ； rsl2972670 的擴增引物序列為 SEQ ID No:22 和 SEQ ID No:23 ； rsl3038095 的擴增引物序列為 SEQ ID No:25 和 SEQ ID No:26 ； rsl42255517 的擴增引物序列為 SEQ ID No:28 和 SEQ ID No:29 ； rs 142895740 的擴增引物序列為 SEQ ID No:31 和 SEQ ID No:32 ； rsl44600021 的擴增引物序列為 SEQ ID No:34 和 SEQ ID No:35 ； rsl7128116 的擴增引物序列為 SEQ ID No:37 和 SEQ ID No:38 ； rs2053026 的擴增引物序列為 SEQ ID No:40 和 SEQ ID No:41 ； rs213212 的擴增引物序列為 SEQ ID No:43 和 SEQ ID No:44 ； rs2229300 的擴增引物序列為 SEQ ID No:46 和 SEQ ID No:47 ； rs2981582 的擴增引物 序列為 SEQ ID No:49 和 SEQ ID No:50 ； rs35002951 的擴增引物序列為 SEQ ID No:52 和 SEQ ID No:53 ； rs3748140 的擴增引物序列為 SEQ ID No:55 和 SEQ ID No:56 ； rs3757318 的擴增引物序列為 SEQ ID No:58 和 SEQ ID No:59 ； rs498114 的擴增引物序列為 SEQ ID No:61 和 SEQ ID No:62 ； rs549652 的擴增引物序列為 SEQ ID No:64 和 SEQ ID No:65 ； rs6433379 的擴增引物序列為 SEQ ID No:67 和 SEQ ID No:68 ； rs6932260 的擴增引物序列為 SEQ ID No:70 和 SEQ ID No:71 ； rs7833986 的擴增引物序列為 SEQ ID No:73 和 SEQ ID No:74 ； rs8190955 的擴增引物序列為 SEQ ID No:76 和 SEQ ID No:77 ； rs871545 的擴增引物序列為 SEQ ID No:79 和 SEQ ID No:80 ； rs905799 的擴增引物序列為 SEQ ID No:82 和 SEQ ID No:83 ； rs925946 的擴增引物序列為 SEQ ID No:85 和 SEQ ID No:86 ； rs9397426 的擴增引物序列為 SEQ ID No:88 和 SEQ ID No:89 ； rs9469578 的擴增引物序列為 SEQ ID No:91 和 SEQ ID No:92 ； rs9650315 的擴增引物序列為 SEQ ID No:94 和 SEQ ID No:95。
3.權利要求1所述的SNP標志物的特異性延伸引物，其特征在于該引物為: rsl0152591的延伸引物序列為SEQ ID No:3 ； rsl037699的延伸引物序列為SEQ ID No:6 ； rsl0487075的延伸引物序列為SEQ ID No:9 ； rsll645106的延伸引物序列為SEQ ID No:12 ； rsll663688的延伸引物序列為SEQ ID No:15 ； rsll768670的延伸引物序列為SEQ ID No:18 ； rs 11910707的延伸引物序列為SEQ ID No:21 ； rsl2972670的延伸引物序列為SEQ ID No:24 ； rsl3038095的延伸引物序列為SEQ ID No:27 ； rsl42255517的延伸引物序列為SEQ ID No:30 ； rs 142895740的延伸引物序列為SEQ ID No:33 ； rsl44600021的延伸引物序列為SEQ ID No:36 ； rsl7128116的延伸引物序列為SEQ ID No:39 ； rs2053026的延伸引物序列為SEQ ID No:42 ； rs213212的延伸引物序列為SEQ ID No:45 ； rs2229300的延伸引物序列為SEQ ID No:48 ； rs2981582的延伸引物序列為SEQ ID No:51 ； rs35002951的延伸引物序列為SEQ ID No:54 ； rs3748140的延伸引物序列為SEQ ID No:57 ； rs3757318的延伸引物序列為SEQ ID No:60 ； rs498114的延伸引物序列為SEQ ID No:63 ； rs549652的延伸引物序列為SEQ ID No:66 ； rs6433379的延伸引物序列為SEQ ID No:69 ； rs6932260的延伸引物序列為SEQ ID No:72 ； rs7833986的延伸引物序列為SEQ ID No:75 ； rs8190955的延伸引物序列為SEQ ID No:78 ； rs871545的延伸引物序列為SEQ ID No:81 ； rs905799的延伸引物序列為SEQ ID No:84 ； rs925946的延伸引物序列為SEQ ID No:87 ； rs9397426的延伸引物序列為SEQ ID No:90 ； rs9469578的延伸引物序列為SEQ ID No:93 ； rs9650315的延伸引物序列為SEQ ID No:96。
4.權利要求1所述的SNP標志物在制備乳腺癌輔助診斷試劑盒中的應用。
5.權利要求2所述的SNP標志物的特異性擴增引物在制備乳腺癌輔助診斷試劑盒中的應用。
6. 權利要求3所述的SNP標志物的特異性延伸引物在制備乳腺癌輔助診斷試劑盒中的應用。
7.一種乳腺癌輔助診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒用于檢測外周血DNA中rsl0152591、rsl037699、rsl0487075、rsll645106、rsll663688、rsll768670、rsll910707、rsl2972670、 rsl3038095、 rsl42255517、 rsl42895740、 rsl44600021, rsl7128116、rs2053026、 rs213212、 rs2229300、 rs2981582、 rs35002951、 rs3748140、 rs3757318、rs498114、rs549652、rs6433379、rs6932260、rs7833986、rs8190955、rs871545、rs905799、rs925946、rs9397426、rs9469578 和 rs9650315。
8.根據權利要求7所述的診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒含有權利要求2所述SNP標志物的特異性擴增引物和/或權利要求3所述SNP標志物的特異性延伸引物。
9. 根據權利要求7或8所述診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒還包括PCR技術常用的試劑。
【文檔編號】C12Q1/68GK104178567SQ201410351680
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年7月22日 優(yōu)先權日:2014年7月22日
【發(fā)明者】沈洪兵, 胡志斌, 馬紅霞, 靳光付, 陳佳萍, 何伊莎 申請人:南京醫(yī)科大學