專利名稱：一種包含hBD3乳腺特異性表達載體的重組牛胎兒成纖維細胞的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于轉基因克隆動物技術領域，涉及轉基因克隆胚的核供體細胞 的構建，特別涉及一種包含hBD3乳腺特異性表達載體的牛胎兒成纖維細胞。
背景技術：
乳房炎是奶牛中很常見的疾病，這種炎癥是由多種病原微生物引起的， 以大腸桿菌(E. coli)和葡萄球菌(S. aureus)為主(NOTEBAERT S, DEMON D, VANDEN BERGHE T et al. Inflammatory mediators in Escherichia coli-induced mastitis in mice [J] Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, 2008,31(6): 551-565; ZHEN YH, JIN LJ, LI XY et al. Efficacy of specific egg yolk immunoglobulin (IgY) to bovine mastitis caused by Staphylococcus aureus[J].Veterinary Microbiology, 2009， 133(4):317-322.)。乳房 炎對奶業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，目前，治療乳房炎仍以抗生素的投放為主， 但抗生素價格昂貴；而且長期使用抗生素會使細菌產(chǎn)生抗藥性，所以尋求一 種新的治療乳房炎的方法迫在眉睫。
自身能夠特異性的在乳房攜帶或者分泌抗乳房炎的因子，是解決奶牛乳 房炎的理想方法，而這需要依賴于現(xiàn)代生物技術來構建轉基因奶牛來實現(xiàn)。 轉基因動物的生產(chǎn)可以追溯到20世紀70年代中葉，用原核顯微注射生產(chǎn)轉 基因動物持續(xù)了 20多年(BOWEN RA, REED ML, SCHNIEKE A, et al. Transgenic cattle resulting from biopsied embryos: expression of c-ski in a transgenic calf[J]. Biol Reprod， 1994,50:664~8.)，但外源基因的隨機整合和配 子系傳送外源基因的不確定性限制了這種技術的廣泛應用。在小鼠上，胚胎 干細胞可以代替原核注射(BRANDON EP, IDZERDA RL， MCKNIGHT GS. Targeting the mouse genome: a compendium of knockouts (Part II) [J].Curr Biol，1995,5:758~65.)，但胚胎干細胞系還沒有在家畜上建立(SHIM H， GUTIERREZ-AD AN A, CHEN LR, et al. Isolation of pluripotent stem cells from cultured porcine primordial germ cells[J]. Biol Reprod， 1997,57:1089)。
而應用體細胞克隆技術生產(chǎn)轉基因動物已表現(xiàn)出強大的生命力(GOOJ， BHUIYAN M.M.U.， HYUN Y J, et al. An approach for producing transgenic cloned cows by nuclear transfer of cells transfected with human alpha 1-antitrypsin gene[J]. Theriogenology, 2006， 65(9): 1800-1812.)，其突出的優(yōu)點 是將基因轉移步驟提前到體細胞培養(yǎng)階段，直接利用已確定的整合有目的基 因的體細胞為核供體進行體細胞核移植(SCNT)，這樣體細胞核移植前供體 細胞的選擇不但可以提高轉基因動物的出生率還可以降低其生產(chǎn)成本 (WHEELER MB， WALTERS EM.Transgenic technology and applications in swine[J]. Theriogenology,2001,56:1345 - 69.)。
人p-防御素3 (hBD3)是人體產(chǎn)生的一種大小為4-5KD的抗菌肽，由 45個氨基酸組成，它具有廣譜、強效的抗多種微生物感染的作用，特別是對 金黃色葡萄球菌等陽性菌有強烈殺傷作用(CHENA H ， XUA ZN, LI P et al. Recent advances in the research and development of human defensins[J]. Peptides, 2006， 27(4):931-940.)。目前已有從扁桃體組織、人新鮮包皮組織、新鮮的人 肝癌組織等組織中克隆到了 hBD3的cDNA,并構建了各種hBD3表達載體， 在大腸桿菌、人的某些細胞中得到表達(LiCL,YuanH，ChenZHetal.Expre ssion of Recombinant Human |3-Defensin 3 in E.coli and Its Antimicrobial Activ ity Analysis [J]. Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology,2005, 21(5):705-708.; Tuo XY，Chai JK,Jiang W et al. Fusion expression of human p-defensin 3 and bactericidal/permeability increasing protein in P. pastoris [J]. Journal of the Fourth Military Medical University，2007，28(7):648-650.)。但是， 以hBD3作為目標基因，以動物細胞為宿主細胞，特別是奶牛的體細胞為宿主細胞的表達載體，還未見報道；也沒有以hBD3作為目標基因構建基因克 隆胚的核供體細胞細胞系的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明解決的問題在于提供hBD3乳腺特異性表達載體，以及基于該載 體的，作為核供體細胞的包含hBD3乳腺特異性表達載體的牛胎兒成纖維細 胞系，為克服奶牛乳房炎的轉基因奶牛提供堅實的基礎。
本發(fā)明是通過以下技術方案來實現(xiàn)
一種hBD3乳腺特異性表達載體，包含目的基因hBD3，分別在hBD3 基因的5'端插入如SEQ.ID.NO.2所示的序列，3'端插入如SEQ.ID.N0.3所示 的序列，作為調控元件。
所述的hBD3乳腺特異性表達載體，還包含抗生素篩選基因和標記基因， 所述的抗生素篩選基因為neo基因，所述的標記基因為EGFP基因。
所述的hBD3乳腺特異性表達載體為pEBB表達載體，通過多克隆位點 Xbal和Nhel將hBD3基因克隆到pEBB載體。
一種包含目的基因hBD3的牛胎兒成纖維細胞，其宿主細胞為牛胎兒成 纖維細胞，通過轉染外源性表達載體pEBB，將目的基因hBD3整合到牛胎 兒成纖維細胞的基因組。
所述的宿主細胞為1-3代的牛胎兒成纖維細胞。
所述的牛胎兒成纖維細胞通過脂質體法轉染外源性表達載體pEBB。
所述牛胎兒成纖維細胞為包含目的基因hBD3的荷斯坦奶牛胎兒成纖維 細胞，該細胞保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC C 200939。
所述的包含目的基因hBD3的牛胎兒成纖維細胞作為核移植構建轉基因 克隆胚的核供體細胞的應用。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益的技術效果
1、本發(fā)明構建了一種hBD3乳腺特異性表達載體，通過在hBD3基因兩端克隆牛P-酪蛋白基因的5'和3'調控區(qū)，牛P-酪蛋白基因的5'和3'調控區(qū)能 夠指導目的基因在牛的乳腺組織中特異的高效表達。
2、 本發(fā)明將目的基因hBD3克隆到基礎載體pBCP上，構建了hBD3乳 腺特異性表達載體pEBB，將其轉染到牛胎兒成纖維細胞，構建轉基因的牛 胎兒成纖維細胞系；熒光顯微觀察標記基因EGFP的表達情況，并經(jīng)G418 篩選獲得陽性細胞，并進行PCR鑒定證實目的基因hBD3整合到牛胎兒成纖 維細胞的基因組。
3、 以包含目的基因hBD3的牛胎兒成纖維細胞作為核移植構建轉基因克 隆胚的核供體細胞，通過SCNT獲得轉基因克隆胚，將這些胚胎移入受體牛 的子宮有望生產(chǎn)出轉hBD3基因的奶牛。
4、 將轉基因克隆胚移入64頭受體牛子宮，獲得21頭妊娠3個月的轉基 因克隆胚胎受體牛。
保藏說明
本發(fā)明所述的包含目的基因hBD3的荷斯坦奶牛胎兒成纖維細胞，進行 了下述保藏
保藏時間2009年5月20日；保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，
保藏號為CCTCCC 200939。


圖1是乳腺特異性表達載體pEBB的質粒圖譜；
圖2是BamHI和Xbal分別單酶切鑒定陽性重組質粒pBBD;
圖3是Sacl、 Sail雙酶切鑒定陽性重組質粒pEBB;
圖4是熒光顯微鏡觀察pEBB載體陽性表達的牛胎兒成纖維細胞的報告 基因EGFP表達的結果圖5是對pEBB載體陽性表達的牛胎兒成纖維細胞基因組的hBD3基因 擴增之后的瓊脂糖凝膠電泳的檢測結果圖；圖6是包含hBD3基因的重組胚的囊胚發(fā)育圖7是對包含hBD3基因的重組胚的基因組的hBD3基因擴增之后的瓊 脂糖凝膠電泳的檢測結果圖。
具體實施例方式
本發(fā)明首先構建含有hBD3和綠色熒光蛋白(EGFP)基因的乳腺特異性 表達載體pEBB，其次用脂質體法將外源性表達載體pEBB導入牛胎兒成纖 維細胞，熒光顯微觀察標記基因EGFP的表達情況，并經(jīng)G418篩選獲得陽 性細胞，進行PCR鑒定，證實目的基因hBD3整合到牛胎兒成纖維細胞的基 因組；最后，將轉染hBD3基因的牛胎兒成纖維細胞作為核供體移入牛去核 卵母細胞，獲得轉基因克隆胚，并進行PCR鑒定，將轉基因克隆胚移入64 頭受體牛子宮，獲得21頭妊娠3個月的轉基因克隆胚胎受體牛。
具體所涉及的試劑如下G418、DMEM培養(yǎng)基和LipofectamineTM2000 均購自美國GIBCO(Invitrogen)公司，EDTA和Trypsin購自美國Sigma公 司，胎牛血清為國產(chǎn)杭州四季青，細胞培養(yǎng)板和培養(yǎng)皿為丹麥Nunclon公司 產(chǎn)品，質粒提取試劑盒和細胞基因組提取試劑盒均購自天根公司。TaqDNA 聚合酶購自Takara公司。
下面結合附圖和實驗對本發(fā)明作進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明解 釋的而不是限定。
1、乳腺特異性表達載體pEBB的構建
a、目的基因hBD3的克隆
根據(jù)GeneID: 55894所公布的hBD-3基因序列設計引物Pl和P2，以人 基因組為模板用引物P1、 P2進行PCR擴增，引物序列如下-前向引物P1: agcagctatg aggatccatt atctt 25 后向引物P2: ttttatttct ttcttcggca gcatt 25
50pL的PCR反應體系為10 XPCR Buffer : 5 ^L， dNTPs(2.5 mmol/L):4|_iL，Pl(10iimol/L): 1 nL，P2(10pmol/L): 1 |iL， rTaq聚合酶(5 U/pL): 0.25 pL，模板l|iL， Mg2+(25 mmol/L)化L，加超純水至50jliL。
PCR反應條件為94-C預變性5min， 94"C變性30s， 58.9'C退火30 s， 72。C延伸lmin30s， 31個PCR循環(huán)，72。C再延伸7min;
PCR產(chǎn)物與pMD-18T Vector 4°C連接過夜，轉化感受態(tài)細胞E.coli DH5a,通過a-互補的藍白斑篩選挑選重組子，經(jīng)Xbal酶切鑒定陽性重組質 粒pTMBD3并送交上海生物工程技術服務有限公司測序。hBD3基因測序結 果如SEQ.ID.NO. 1所示，與公布的hBD-3基因序列(GeneID: 55894)同源 性為99%，因此所克隆的基因為人p-防御素3基因。
b、 pEBB的載體結構
如圖l所示，本發(fā)明具體以pBCP載體和pEGFP-Cl載體構建包含目的基因 hBD3的乳腺特異性表達載體pEBB 。
pBCP載體是一種乳腺特異性表達載體，其中包括牛P-酪蛋白基因的5'和 3'調控區(qū)(BBC5和BBC3)，以及它們之間的多克隆位點；牛P-酪蛋白是奶牛 乳汁中主要的蛋白質，牛p-酪蛋白基因具有很強的表達活性，在泌乳激素的 刺激下，牛|3-酪蛋白基因的5'和3'調控區(qū)能夠指導目的基因在牛乳腺組織中特 異的高效表達。
pBCP載體的構建如下將SEQ.ID.N0.2所示的BBC5片段TA克隆到 pMD-18T載體(購自大連寶生物公司)上，獲得的載體命名為pBBC5;將片 段SEQ.ID.N0.3所示的BBC3片段TA克隆至UpMD-18T載體(購自大連寶生物公 司)上，獲得的載體命名為pBBC3; Acc65和BamHI分別雙酶切pBBC5和 pBBC3，將酶切pBBC5的大片段和酶切pBBC3的小片段連接就得到了pBCP 載體。
pEGFP-C 1載體包含G418抗性篩選基因neor和帶有CMV啟動子的標記基 因EGFP;標記基因EGFP可在哺乳動物細胞中高表達并產(chǎn)生熒光；pEGFP-Cl載體商購就可以獲得。
本發(fā)明通過多克隆位點XbaI和NheI將目的基因hBD3插入到pBCP上的多 克隆位點，利用牛(3-酪蛋白基因的調控序列來調控hBD3基因在牛乳腺上皮細 胞中特異性的表達。在目的基因hBD3兩端構建的調控元件，包括2.2 kb的牛p-酪蛋白基因5'調控區(qū)(BBC5，包括1.7kb的包含有啟動子的上游調控序列以 及5'不翻譯區(qū)中的第一外顯子和部分第一內含子)，以及0.6kb的3'端調 控區(qū)(BBC3,包含CSN2基因最后一個內含子的小部分、最后一個不翻譯的 外顯子及150 bp的側翼區(qū))，3'調控區(qū)還包含polyA加尾信號及控制轉錄終 止的G/T簇，這些序列結構對mRNA的轉錄、在細胞質內的穩(wěn)定性及介導其翻 譯調控起到重要的作用。牛卩-酪蛋白基因的5'調控區(qū)的核苷酸序列如 SEQ.ID.N0.2所示，3'調控區(qū)的核苷酸序如SEQ.ID.N0.3所示。
牛j3-酪蛋白基因的5'調控區(qū)和3'調控區(qū)對目的基因的調節(jié)還表現(xiàn)為， 在合理因素誘導下，如泌乳激素的剌激，兩者可以協(xié)同發(fā)揮分子內的長程互 作，使外源基因hBD3按牛P-酪蛋白內源轉錄方式進行轉錄(石統(tǒng)東，吳玉章， 朱錫華.真核mRNA3'非翻譯區(qū)在基因表達中的作用[J].生物化學與生物物理 進展，1998，25(3):195-197.)。牛P-酪蛋白基因的調控功能己在前期的研究中 得到了證實，能夠用來調控外源基因的表達。(劉金龍.人瘦蛋白乳腺表達載 體的構建及細胞表達的初步研究[D].陜西灑北農(nóng)林科技大學，2004.;何小寧.
人溶菌酶基因乳腺特異性表達載體的構建及其在小鼠乳腺癌細胞中的表達 [D].陜西:西北農(nóng)林科技大學,2006.) c、 pEBB載體的構建
用NheI和BamHI雙酶切載體pBCP,膠回收大片段，Klenow Fragment補 平后待用。用Xbal單酶切pTAhBD3載體，膠回收小片段，Klenow Fragment補 平。將回收的大、小片段用T4DNA連接酶4 °C連接過夜，并轉化感受態(tài)細 胞E.coliDH5a,經(jīng)Bamffl和XbaI分別單酶切鑒定陽性重組質粒，如圖2所示，其中，泳道l Marker;泳道2為Xbal單酶切鑒定，可以看到4480bp和2376bp的 兩條條帶；泳道3為Bamffl單酶切鑒定，可以看到一條約為6856的條帶，說明 hBD3通過Xbal酶切位點克隆到了載體pBCP上，將獲得的重組質粒命名為 pBBD。
以pBBD為模板用引物進行PCR擴增，其中，引物對為 前向引物P3: a議agctcta atgagaaaag ggaaatgttg aatgg 3 5
后向弓I物P4: gtcgtcgact ttccacagct ctttttaaca tc 32 上下游引物劃線部分分別為Sacl和Sail酶切位點，PCR反應條件為94 。C預變性4min; 94 。C變性30s， 59 。C退火45 s， 72 。C延伸4min， 35個 PCR循環(huán)；72t:再延伸10min。
將上述以pBBD為模板的PCR產(chǎn)物膠回收純化后，以Sacl、 Sail雙酶切 后克隆入用同樣酶雙切的載體pEGFP-Cl中，Sacl、 Sail雙酶切鑒定陽性克 隆載體，如圖3所示，其中，泳道l為Marker;泳道2為Sacl、 Sail雙酶切 鑒定，可以看到4700bp和3800bp的兩條條帶；說明包含目的hBD3和調節(jié) 元件的片段通過SacI、 SalI雙酶切位點克隆到了載體pEGFP-Cl上，將獲得 的陽性重組質粒命名為pEBB。
由于質粒在大腸桿菌中增殖，用普通的質粒提取方法容易將細菌內毒素 帶到終產(chǎn)物中，細菌內毒素的存在會影響質粒轉染效率和細胞生長，所以本 研究使用了去內毒素的質粒提取試劑盒，以減少內毒素對試驗結果的負面影 響。用天根公司的去內毒素的質粒純化試劑盒提取質粒后用核酸蛋白測定儀 測定質粒的濃度和純度，經(jīng)測定，質粒的濃度為308.9 ng/pl， OD260/280為 2.01，說明質粒較純，可用于轉染。
2、 pEBB表達載體轉染牛胎兒成纖維細胞構建核供體細胞系 d、牛胎兒成纖維細胞的培養(yǎng)
從液氮中取一管荷斯坦奶牛的牛胎兒成纖維細胞于38X:解凍，加0.8ml的DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media)細胞培養(yǎng)液離心，棄上清，加 細胞培養(yǎng)液重懸，取3 ml細胞懸浮液接種于直徑6cm的培養(yǎng)皿中，置于C02 培養(yǎng)箱中38.5'C條件下培養(yǎng)。
待牛胎兒成纖維細胞達到80%匯合時，吸棄培養(yǎng)液，用無Ca2+ 、 Mg2+ 的PBS沖洗細胞，加入胰酶與EDTA混合消化液，消化細胞。在倒置顯微 鏡下觀察細胞，待大多數(shù)細胞回縮、變圓、細胞間隙擴大時，用含10%胎 牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液終止消化，用移液器吹打后，離心收集，懸浮， 按1 : 3的比例接種于24孔板，放入C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1-3代的牛胎兒成 纖維細胞，培養(yǎng)至細胞達到卯％匯合用于轉染。
本發(fā)明以G418作為篩選藥物，由于表達載體pEBB的骨架上有G418 抗性基因neor，外源基因pEBB得到表達的牛胎兒成纖維細胞能夠在含有一 定濃度G418的培養(yǎng)液中存活下來，而未轉染的正常細胞會在該濃度下死亡， 因此需要確定正常細胞G418的最小致死濃度來作為篩選濃度。
G418最小致死濃度的測定在牛胎兒成纖維細胞培養(yǎng)液(DMEM細胞 培養(yǎng)液)中分別加入濃度梯度的G418篩選1周，測定正常細胞的G418最 小致死濃度。當細胞培養(yǎng)液中G418的濃度^60(Hig/ml時，在顯微鏡下可見 細胞全部死亡，所以G418的最小致死濃度為600pg/ml。
e、 pEBB表達載體轉染牛胎兒成纖維細胞
轉基因的方法有很多種，包括電穿孔法、顯微注射法、基因槍法、病毒 載體法、受體介導法等。本發(fā)明具體采用脂質體轉染法，用表達載體pEBB 轉染牛胎兒成纖維細胞，脂質體轉染試劑lipofectamineTM2000與DNA通過 離子間相互作用，形成單層陽離子脂質包裹DNA的類脂-DNA復合物顆粒,通 過細胞膜將外源DNA送到細胞內。用脂質體進行基因轉移與其它方法相比， 操作簡便、重復性好、不受DNA大小限制、無組織特異性和免疫原性。具 體為接種前一天，將第1代牛胎兒成纖維細胞以1X1()s接種于12孔板中， 培養(yǎng)過夜使細胞達到70-80%匯合。對于每孔細胞，分別將g的pEBB表 達載體和9jli 1的脂質體加入到含有100 pl無血清DMEM培養(yǎng)液的兩個200 pi 離心管中，5min內將兩個離心管中的液體混合，室溫孵育20min后，緩慢 將其加入到不含血清的DMEM細胞培養(yǎng)液中；5-6 h后，轉換為含血清的正 常DMEM細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后加入G418至終濃度600p g/ml。
f、 pEBB載體陽性表達的細胞篩選
pEBB轉染牛胎兒成纖維細胞24 h后，在熒光顯微鏡下觀察報告基因 EGFP的表達情況，并在含血清的DMEM細胞培養(yǎng)液中添加600p g/ml的最 小致死濃度的G418篩選；以未轉染pEBB的牛胎兒成纖維細胞為陰性對照， 其細胞培養(yǎng)液加有同樣濃度的G418 (600jiig/ml)。
pEBB轉染細胞24h后，在熒光顯微鏡下可以看到綠色熒光，如圖4所 示，轉基因的牛胎兒成纖維細胞發(fā)出綠色熒光，說明pEBB已經(jīng)進入細胞并 且陽性表達；pEBB轉染細胞7d后，對照組的細胞全部死亡，將包含pEBB 轉染陽性的細胞組的G418濃度減半持續(xù)篩選直到細胞長滿皿底，可見到陽 性細胞形成島嶼狀細胞群，在熒光顯微鏡下仍然可以看到綠色熒光；然后消 化細胞用不加G418的正常培養(yǎng)液擴大培養(yǎng)。
本發(fā)明篩選的陽性細胞都是穩(wěn)定轉染pEBB的細胞，目的基因pEBB整 合到細胞的基因組上，而不是游離于基因組之外；在穩(wěn)定轉染的過程中，質 粒pEBB上攜帶的基因會整合到宿主細胞的基因組上，整合的位置是隨機的； 通過G418篩選7天再半劑量持續(xù)篩選來達到穩(wěn)定轉染的目的，表現(xiàn)為報告 基因在被轉染的陽性細胞內持續(xù)表達，因此篩選的陽性細胞持續(xù)發(fā)出綠色熒 光并呈現(xiàn)G418抗性。
以上構建的通過整合pEBB載體到細胞基因組，得到包含目的基因 hBD3的荷斯坦奶牛胎兒成纖維細胞，該細胞保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCC 200939。
g、 pEBB載體陽性表達細胞的PCR鑒定
取擴大培養(yǎng)后的pEBB陽性表達的牛胎兒成纖維細胞，提取細胞基因組 DNA，以基因組DNA為模板，PCR鑒定hBD3基因是否整合到細胞基因組 中，陰性對照為未轉染的正常牛胎兒成纖維細胞，PCR鑒定所用引物對為P1 禾口P2;
PCR反應條件為94X:預變性5min， 94。C變性30 s， 58.9。C退火30 s， 72。C延伸lmin30 s， 31個PCR循環(huán)，72。C再延伸7min;回收PCR產(chǎn)物進 行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，撿測結果如圖5所示，其中，泳道1為DNA MarkerIV，泳道2為pEBB轉染的牛胎兒成纖維細胞，泳道3為未轉染的牛 胎兒成纖維細胞，泳道2與3相比，明顯可以看到一條1200bp左右的條帶， 而目的基因hBD3為1156bp，而作為陰性對照的泳道3并沒有看到，說明目 的基因hBD3整合到了宿主細胞牛胎兒成纖維細胞的基因組。
hBD3基因整合到了宿主細胞牛胎兒成纖維細胞的基因組，與之相連的 牛卩-酪蛋白基因的5'和3'調控區(qū)與目的基因hBD3也會一起整合到牛胎兒成 纖維細胞的基因組。
3、以上述基因組整合了目的基因hBD3的牛胎兒成纖維細胞(CCTCC C 200939)作為核供體細胞，構建轉基因克隆胚
h、卵母細胞的成熟培養(yǎng)
卵巢采自西安市牛屠宰場，無菌采取荷斯坦奶牛卵巢，2-3小時內運回實 驗室，抽取3 8mm直徑的卵泡，收集卵母細胞卵丘復合體，實體顯微鏡下 挑選具有完整的三層以上卵丘細胞，胞質均勻的卵母細胞用于成熟培養(yǎng)。卵 母細胞的成熟培養(yǎng)液為TCM199 (Gibaco)加10%胎牛血清，10ng/ml的 表皮生長因子，培養(yǎng)條件為..38.5°C， 5%C02、 95%空氣的氣體環(huán)境，飽和 濕度；成熟培養(yǎng)20h后用0.2%透明質酸酶去除卵丘細胞，以第一極體排放作為卵母細胞成熟的判定標準，挑選成熟卵母細胞用于核移植試驗。 i轉基因克隆胚的構建
本方面采用體細胞核移植(SCNT)技術將供體核轉移到去除細胞核的 成熟卵母中，其中，整合有外源基因的供體細胞是關鍵，本發(fā)明將供體細胞 控制到10代以內，這主要考慮減少體外培養(yǎng)導致的突變在培養(yǎng)過程中的積累。
核移植具體為顯微操作液為含10。/。FBS, 5 pg/ml細胞松弛素B的PBS， 用內徑20p m的去核管在顯微操作儀上吸出第一極體及部分胞質，以10)li g/ml Hoechst 33342染色10 min，在熒光顯微鏡下挑出完全去核的卵母細胞；
釆用電融合法進行體細胞核移植,過程如下在顯微鏡下挑選直徑為15 |Ll m左右的供體細胞注射到透明帶下，并使之與卵母細胞質膜緊密接觸，注射 后的細胞-卵胞質重組體以微電極擠壓融合法進行融合；
融合前先將細胞-卵胞質重組體放入融合液(含0.3mol/L甘露醇、0.05 mol/L氯化轉、0. 1 mol/L硫酸鎂、0.27mol/L組氨酸、0. 1%BSA)中預平 衡4 6min;用與顯微操作儀連接的微電極的尖部排列重組體，使膜接觸面 與兩電極的連線垂直，用微電極尖輕輕壓住重組體，給予2次電脈沖進行電融 合(28V、 10|is)。融合后的細胞-卵胞質重組體放入含10。/。FBS (fetal boving serum，購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司)的M199 (購自GIBCO 公司)中，38.5 °C、 5%C02 、飽和濕度下培養(yǎng)，0.5 lh后觀察融合情 況。
j、轉基因克隆胚的激活及體外培養(yǎng)
融合的重組胚(細胞-卵胞質重組體)在含10。/。FBS的M199中平衡2h后, 用含5nmol/L離子霉素(Ionomycin，購自SIGMA公司)的mSOFaa培養(yǎng)液(購 自SIGMA公司)處理5min，然后在含2mmol/L 二甲基氨基嘌呤(6-DMAP) 的mSOFaa培養(yǎng)液內培養(yǎng)5h，洗3次后轉移到mSOF aa微滴中培養(yǎng)，培養(yǎng)密度 為5(iL每個重組胚，在38.5。C、 5%C02 、飽和濕度下培養(yǎng)，每48h半量換液l次，第7 9天檢査囊胚發(fā)育情況，如圖6所示，克隆胚正常發(fā)育至囊胚，圖中 黑色部分為內細胞團，外圍為滋養(yǎng)層細胞。
k、轉基因克隆胚PCR鑒定目的基因hBD3
重組胚胎基因組DNA的提取將重組胚胎樣品放入100 滅菌的離心管 中，加入20nl滅菌雙蒸水，煮沸5min后稍離心，置于-20 "保存或直接 用于PCR。
以提取的重組克隆胚的基因組為模板，PCR鑒定目的基因hBD3， PCR反 應反應體系和過程同步驟g的hBD3PCR擴增相同，以未轉基因的克隆胚為 陰性對照。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳，以DNAMarkerIV為分子 質量標準，獲得了大小為1156bp的擴增帶，與預期大小相符，如圖7所示， 其中，泳道l為DNAMarkerIV，泳道2為重組克隆胚，泳道3為未轉基因的克 隆胚，泳道2與3相比，明顯可以看到一條1200bp左右的條帶，而目的基因hBD3 為1156bp，而作為陰性對照的泳道3并沒有看到，說明目的基因hBD3整合到 胚胎基因組中。
1、轉基因克隆胚的胚胎移植和妊娠鑒定
第7天的囊胚用非手術法移入自然發(fā)情后第七天的荷斯坦受體牛子宮內， 每個受體牛移植2枚囊胚。受體牛移植后觀察其返情情況，對未返情的在移植 后30d用B超做懷孕檢查。以后每隔一月檢查一次，以觀察妊娠維持情況。
本發(fā)明共移植轉hBD3基因克隆胚胎到64頭同期發(fā)情的受體奶牛體內，一 個月后有57頭建立妊娠，3個月后有21頭維持妊娠并將繼續(xù)被監(jiān)測。核苷酸序列表
<110>西北農(nóng)林科技大學
<120> —種包含hBD3乳腺特異性表達載體的重組牛胎兒成纖維細胞
<160>3
<210> 1
<211> 1156
<212>DNA
<213>人卩-防御素3 (hBD3) <400> 1
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<212>DNA
<213>牛p-酪蛋白基因的5'調控區(qū) <400>2
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1、一種hBD3乳腺特異性表達載體，包含目的基因hBD3，其特征在于，分別在hBD3基因的5′端插入如SEQ.ID.NO.2所示的序列，3′端插入如SEQ.ID.NO.3所示的序列，作為調控元件。
2、 如權利要求1所述的hBD3乳腺特異性表達載體，其特征在于，所述 hBD3乳腺特異性表達載體還包含抗生素篩選基因和標記基因。
3、 如權利要求2所述的hBD3乳腺特異性表達載體，其特征在于，所述 的抗生素篩選基因為neor基因，所述的標記基因為EGFP基因。
4、 如權利要求1所述的hBD3乳腺特異性表達載體，其特征在于，所述 hBD3乳腺特異性表達載體為pEBB表達載體，通過多克隆位點Xbal和Nhel 將hBD3基因克隆到pEBB表達載體。
5、 一種包含目的基因hBD3的牛胎兒成纖維細胞，其特征在于，宿主細 胞為牛胎兒成纖維細胞，通過轉染外源性表達載體pEBB，將目的基因hBD3 整合到牛胎兒成纖維細胞的基因組。
6、 如權利要求5所述的包含目的基因hBD3的牛胎兒成纖維細胞，其特 征在于，所述的宿主細胞為1-3代的牛胎兒成纖維細胞。
7、 如權利要求5所述的包含目的基因hBD3的牛胎兒成纖維細胞，其特 征在于，牛胎兒成纖維細胞通過脂質體法轉染外源性表達載體pEBB。
8、 如權利要求5所述的包含目的基因hBD3的牛胎兒成纖維細胞，其特 征在于，所述牛胎兒成纖維細胞為包含目的基因hBD3的荷斯坦奶牛胎兒成 纖維細胞，該細胞保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC C 200939。
9、 權利要求5所述的包含目的基因hBD3的牛胎兒成纖維細胞作為核移 植構建轉基因克隆胚的核供體細胞的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種包含hBD3乳腺特異性表達載體的牛胎兒成纖維細胞，包括一種hBD3乳腺特異性表達載體，包含目的基因hBD3，分別在hBD3基因的5′端和3′端插入調控元件；所述的hBD3乳腺特異性表達載體為pEBB表達載體。一種包含目的基因hBD3的牛胎兒成纖維細胞，其宿主細胞為牛胎兒成纖維細胞，通過轉染外源性表達載體pEBB，將目的基因hBD3整合到牛胎兒成纖維細胞的基因組。以包含目的基因hBD3的牛胎兒成纖維細胞作為核移植構建轉基因克隆胚的核供體細胞，通過SCNT獲得轉基因克隆胚，將這些胚胎移入受體牛的子宮有望生產(chǎn)出轉hBD3基因的奶牛。
文檔編號C12N15/85GK101591672SQ20091002266
公開日2009年12月2日 申請日期2009年5月22日 優(yōu)先權日2009年5月22日
發(fā)明者軍 劉, 松 華, 涌 張, 權富生, 王勇勝, 鄭月茂, 馬晶晶 申請人:西北農(nóng)林科技大學