專利名稱：高效表達山羊生長激素gh的乳腺特異性表達載體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種高效表達山羊生長激素GH的乳腺特異性表達載體，屬于生物技 術領域，具體地講涉及促進乳腺導管發(fā)育、提高奶產量的生長激素GH。
背景技術：
羊奶是我國奶業(yè)的重要組成部分，羊奶脂肪顆粒體積小，蛋白質、礦物質、維生素 和生物活性物質含量豐富。羊奶和牛奶相比，脂肪顆粒大小只有牛奶中的1/3，羊奶中脂肪 顆粒大小均勻，不飽和脂肪酸含量高，且呈良好的乳化狀態(tài)，羊奶乳蛋白中含量高，蛋白質 結構與母乳相同，蛋白凝塊細而軟，更利于人體吸收，我國雖是奶山羊飼養(yǎng)大國，但奶產量 低，難以滿足市場需求。研究表明，羊奶產量和泌乳期的乳腺上皮細胞的數量和泌乳能力密切相關。生長 激素是一種由垂體前葉腺分泌產生的一種蛋白質激素，能夠直接或間接刺激細胞分裂，促 進細胞增殖。對乳腺組織來說，生長激素最明顯的作用就是促進乳腺導管形成，與乳腺基質 細胞上的生長激素受體結合促進山羊的乳腺上皮細胞的增殖，維持乳腺上皮細胞數量，延 長泌乳期。Knight CH等發(fā)現在泌乳的奶山羊乳腺中，生長激素表現出維持乳腺上皮細胞數 量的功能。Capuco等研究也發(fā)現，生長激素能夠通過乳腺導管促進乳腺細胞的增殖，進而 延長泌乳維持期。皮下或肌肉注射生長激素可以延長泌乳期，增加奶產量，且奶成分基本沒 有變化。近年來，分子細胞生物學的研究表明生長激素是主要通過細胞中的信號轉導蛋白 影響細胞的增殖和分化的。Thomas MJ研究表明，在體外生長激素能夠激活Statl、Stat3、 Stat5的表達，Bromberg J等研究等激素的信號通路發(fā)現，Stat蛋白對乳腺的增殖和分化 中具有重要的作用，Iavni lovitch E等進一步證實，妊娠期和泌乳期乳腺細胞的增殖和發(fā) 育和Stat5密切相關，MarionBoutinaud等對泌乳期的薩能奶山羊研究發(fā)現，GH能夠增加 轉錄激活因子Statl、Stat5影響乳腺細胞的增殖。這些研究表明，GH在增加奶產量方面具 有重要的作用，是增加奶產量的候選基因之一。通過常規(guī)育種方法費時費力，利用轉基因技 術，將生長激素在泌乳期持續(xù)表達，促進乳的分泌、維持泌乳期乳腺上皮細胞的數量，延長 泌乳期，可以很快增加羊奶產量，適應市場需要。本研究從薩能奶山羊中克隆得到一個與乳腺導管發(fā)育和乳腺上皮細胞增殖相關 的基因gh，通過構建乳腺特異性表達載體pcGH，研究gh基因在體外人乳腺癌細胞Bcap-37 上的表達情況，為進一步生產轉gh基因奶山羊提供試驗材料。

發(fā)明內容
技術問題本發(fā)明的目的在于公開一個山羊生長激素基因gh促進泌乳功能的基因工程應 用，構建乳腺特異性表達載體pcGH，山羊乳腺細胞通過脂質體轉染的方法，檢測轉染后GH 的表達量，證實載體的有效性，為后期生產轉基因奶山羊提供了理論依據，打下了堅實的基 石出。
技術方案高效表達山羊生長激素(GH)的乳腺特異性表達載體pcGH的構建，其特征是gh基 因具有如SEQ ID NO. 1所示的序列，其構建方法包括1)薩能奶山羊生長激素gh的克隆參照Genbank登陸號Y00767山羊生長激素gh基因的cDNA序列設計一對擴增生 長激素cDNA的引物，并在上游引物上引入EcoR I限制性酶切位點，下游引物上引入SalI 限制性酶切位點上游引物ZP3 5，-TAGAATTCATGATGGCTGCAGGCCCCCGGA-3，下游引物ZP4 5，-TAGTCGACCTAGAAGGCACAGCTGGCCTCCCCG-3，以薩能奶山羊肝臟組織的總RNA為模板，經反轉錄合成cDNA第一鏈后進行PCR 擴增；PCR反應體系為25uL，PCR反應條件95°C預變性5min，95°C 30sec，65°C 30sec, 72°C 40sec, 30個循環(huán)，72°C IOmin, 4°C IOmin ；將PCR產物連接到pMD19_T載體上，送交上 海生工測序。測序后獲得具有完整編碼區(qū)的薩能奶山羊生長激素gh基因的cDNA序列SEQ ID NO. 1 ；2)薩能奶山羊β-乳球蛋白5端和3端的克隆參照已發(fā)表的山羊的β -乳球蛋白序列Genbank登陸號Ζ33881，設計一對擴增 β-乳球蛋白5端的引物，并在上游引物上引入Xho I限制性酶切位點，在下游引物上引入 EcoRI限制性酶切位點，引物序列如下上游引物ZP1 5，-ATACTCGAGCCAGGCCAGAGGTGCTTTATTTCCG-3，下游引物ΖΡ2 :5，-TATGAATTCCTTCTGGATGTCCAGGCCTTTCATG-3’設計一對擴增乳球蛋白3端的引物，并在上游和下游引物上分別引入SalI限 制性酶切位點，引物序列如下上游引物ΖΡ5 :5，-TATGTCGACCCTGCCGGTGCCTCTGTGGTAAGCT-3’下游引物ΖΡ6 5，-ATCGTCGACGGGAGTCCTGAAGCGGGAGGGTGTT-3，以薩能奶山羊肝臟組織提取的DNA為模板，用合成的ΖΡ1、ΖΡ2引物PCR擴增β-乳 球蛋白5端，PCR反應體系為25uL，PCR反應條件95°C預變性5min，95°C 30sec，61°C 30sec， 72°C 150sec，30個循環(huán)，72°C 10min，4°C IOmin ；將PCR產物連接到pMD19_T載體上，測序后 獲得具有薩能奶山羊β “乳球蛋白5端的DNA序列SEQ ID NO. 2 ；用合成的ZP5、ZP6引物擴增β -乳球蛋白3端，PCR反應體系為25uL，PCR反 應條件95°C 預變性 5min ；95 °C 30sec,67°C 30sec,72°C 40sec,30 個循環(huán)；72°C IOmin, 4 °C lOmin，將PCR產物連接到pMD19-T載體上，測序后獲得具有薩能奶山羊β-乳球蛋白3 端的 DNA 序列 SEQ ID Ν0. 3 ；3)乳腺特異性表達載體的構建將SEQ ID NO. 1序列、SEQ ID N0. 2和序列SEQ ID N0. 3序列克隆至骨架載體 pIRES2-EGFP上，獲得乳腺特異性表達載體pcGH。有益效果生長激素基因可以提高哺乳動物的泌乳持續(xù)性。體外轉染人乳腺癌細胞Bcap-37 結果顯示，從48小時到第72小時，轉染組(只轉染乳腺特異性表達載體pcGH) GH表達量均 高于對照組(正常培養(yǎng)的人乳腺癌細胞Bcap-37未轉染載體pcGH)。其中在第48小時轉染組的GH表達量136. 48ng/mL極顯著高于對照組的GH表達量29. 33ng/mL。轉染組GH的表 達增加量約是對照組的4. 5倍。本發(fā)明的gh可作為目的基因導入哺乳動物，促進哺乳動物的乳腺發(fā)育，提高泌乳 性能，以進行動物品種改良，所編碼的蛋白質具有促進泌乳功能。攜帶有本發(fā)明gh的乳腺特異性表達載體可通過使用脂質體、電轉等常規(guī)生物學 方法轉化薩能奶山羊細胞，并將成功轉化細胞經核移植生產轉gh基因奶山羊。下面結合附圖及實施例對本發(fā)明做進一步說明。所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。
四

圖1 乳腺特異性表達載體pcGH的質粒圖譜圖2 :GH基因的克隆圖片圖3 β _乳球蛋白5端基因的克隆圖片圖4 β _乳球蛋白3端基因的克隆圖片圖5:pcGH質粒Xho I, EcoRI, Sal I酶切驗證圖片圖6 人乳腺癌細胞Bcap-37細胞轉染質粒pcGH后ELISA測定GH表達量
五具體實施例方式本發(fā)明首先擴增目的基因山羊的gh和山羊的β -乳球蛋白5端及3端基因，然后 以乳腺特異性表達載體pIRES2-EGFP為基礎構建乳腺特異性表達載體pcGH，最后通過脂質 體轉染的方法，轉染人乳腺癌細胞Bcap-37，并且提取蛋白通過ELISA方法，檢測轉染后的 表達效果。具體涉及的材料和試劑如下羊腦垂體，來自于無感染病史的薩能奶山羊，將組織于液氮中保存(購自南京溧 水種山羊養(yǎng)殖基地)，pIRES2-EGFP載體(購自Clontech)；人乳腺癌細胞Bcap-37 (南京凱 基生物公司；貨號KG035 ；名稱人乳腺癌細胞Bcap-37)，載體pMD19_T，JM109菌株(購自 大連寶生物，Takara)。試劑Trizol、MLV-反轉錄酶購自 promega 公司，rTaq 酶、pMD19_T 載體、Agarose Gel DNA Purification Kit、內切酶 Xho I、EcoRI、Sal I 等均購自 TAKARA 公司；無內毒 素質粒提取試劑盒購自OMEGA公司，質粒純化試劑盒Wizard PureFection Plasmid DNA Purification system 購自 Promega 公司；脂質體Lipofectamine 2000,胎牛血清購自Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基(貨 號C12430)購自Gibco公司；青鏈雙抗(購自碧云天)；胰島素、轉鐵蛋白、氫化可的松(購 自南京生興生物有限公司)；鼠抗羊生長激素ELISA試劑盒(購自R&D)，其他試劑均為國產 或進口分析純級。1載體pcGH的構建1. 1山羊生長激素(GH)的克隆參照已發(fā)表的山羊生長激素gh基因的cDNA序列(Genbank登陸號Y00767)設計 一對擴增生長激素cDNA的引物，并在上游引物上引入EcoRI限制性酶切位點，下游引物上引入SalI限制性酶切位點上游引物ZP3 5，-TAGAATTCATGATGGCTGCAGGCCCCCGGA-3，下游引物ZP4 5，-TAGTCGACCTAGAAGGCACAGCTGGCCTCCCCG-3，以上引物由上海生工公司合成。PCR 反應體系為 25uL, PCR 反應條件95°C預變性 5min,95°C 30sec，65°C 30sec, 72 °C 40sec，30 個循環(huán)，72°C 10min,4°C IOmin ；反應結束后，取 20uL，在 1.0% 瓊脂糖 中電泳，切取目的條帶，經DNA純化試劑盒回收后，連接到PMD19-T載體上，獲得質粒 PMD19-T-GH，經菌落PCR及酶切驗證后，送去測序。所獲得的序列經BLAST及DNAstar與 Genbank上已發(fā)表的序列比對。所克隆的生長激素序列與已經在Genebank上發(fā)表的序列的 同源性為99%，僅在301處有一個堿基T突變成C，進一步分析表明這個點突變并不引起氨 基酸的突變，和Genebank上已發(fā)表的山羊序列表達相同的生長激素蛋白。1. 2山羊β -乳球蛋白5端及3端的克隆山羊的乳球蛋白是山羊的主要乳清蛋白，該蛋白僅在乳腺中特異性表達，通 過對綿羊的乳球蛋白基因研究發(fā)現，乳球蛋白上游_406bp的表達載體就可啟動 外源基因在轉基因小鼠的乳腺組織特異性表達，用綿羊的乳球蛋白5端作為調控元 件構建的表達載體，已經將人的α -1-抗胰蛋白酶、凝血酶III等在山羊乳腺中特異性表 達。山羊的β-乳球蛋白和綿羊的β-乳球蛋白的5’端調控區(qū)同源性高達99%，利用山 羊的乳球蛋白為調控元件也可以指導外源基因在乳腺中特異性表達，成勇等利用山羊 的乳球蛋白5端為調控元件，成功在小鼠的乳腺中表達了人乳鐵蛋白。因此，山羊的 β-乳球蛋白可以作為啟動外源基因表達在山羊乳腺中特異性表達的啟動元件。本試驗以薩能奶山羊的肝臟為材料，用液氮研磨山羊的肝臟組織，根據天根基因 組提取試劑盒提取基因組。參照已發(fā)表的山羊的β -乳球蛋白序列Genbank登陸號Ζ33881，設計一對擴增 β-乳球蛋白5端的引物，并在上游引物上引入Xho I限制性酶切位點，在下游引物上引入 EcoRI限制性酶切位點。引物序列如下上游引物ZP 1:5’ -ATACTCGAGCCAGGCCAGAGGTGCTTTATTTCCG-3’下游引物ΖΡ2 5，-TATGAATTCCTTCTGGATGTCCAGGCCTTTCATG-3，設計一對擴增乳球蛋白3端的引物，并在上游和下游引物上分別引入SalI限 制性酶切位點。引物序列如下上游引物ΖΡ5 5，-TATGTCGACCCTGCCGGTGCCTCTGTGGTAAGCT-3，下游引物ΖΡ6 5，-ATCGTCGACGGGAGTCCTGAAGCGGGAGGGTGTT-3，以上引物由上海生工公司合成。以薩能奶山羊肝臟組織提取的DNA為模板，用合成的ΖΡ1、ΖΡ2引物PCR擴增β-乳 球蛋白5端，PCR反應體系為25uL，PCR反應條件95°C預變性5min，95°C 30sec，61°C 30sec， 72°C 150sec，30個循環(huán)，72°C 10min,4°C IOmin ；將PCR產物連接到pMD19_T載體上，獲得質 粒pMD19-T-BLG5，經菌落PCR及酶切驗證后，送交上海生工測序。用合成的ZP5、ZP6引物擴增β -乳球蛋白3端，PCR反應體系為25uL，PCR反 應條件95°C 預變性 5min ；95 °C 30sec,67°C 30sec,72°C 40sec,30 個循環(huán)；72°C IOmin, 4°C IOmin,將PCR產物連接到pMD19_T載體上，獲得質粒pMD19_T_BLG3，經菌落PCR及酶切驗證后，送交上海生工測序。所獲得的序列經BLAST及DNAstar與Genbank上已發(fā)表的序列比對。結果表明 該序列與已發(fā)表的山羊β _乳球蛋白序列的5端和3端調控區(qū)的同源性為99 %，通過棚. gene-regulation, com/pub/programs, html在線分析表明，該序列包含β -乳球蛋白的外 顯子1及信號肽序列，在序列的420bp處存在乳腺因子(MGF)，在1946bp處存在有GR (糖皮 質結合受體)，在678bp及2050bp處存在MPBF (乳蛋白結合因子)等乳腺特異性表達調控 元件；Whitelaw等(2000)發(fā)現在β -乳球蛋白3端polyA加尾信號前(-95bp—985bp)存 在MAR序列，該序列的存在能夠提高外源基因的基礎表達水平。本試驗的克隆β-乳球蛋 白3端的序列與已發(fā)表的山羊的乳球蛋白3端的同源性高達99%，可以減少插入位點 對生長激素表達水平的影響?；谝陨戏治霰砻鞒晒嫿ㄉL激素表達載體構建成功，為 下一步生產高產轉基因奶羊奠定了基礎。1. 3乳腺特異性表達載體pcGH的構建1. 3. 1 載體 pIRES2-BLG5 的構建將質粒pIRES2_EGFP和步驟1. 2中獲得到pMD19_T_BLG5載體，同時用限制性核酸 內切酶Xho I、EcoRI，分別回收5. 3kb和2. 2kb左右的片段，連接，獲得質粒pIRES2_BLG5， 轉化JM109感受態(tài)菌株，菌落PCR篩選驗證陽性克隆，獲得2284bp的片段，目的條帶大小和 預期一致，說明乳球蛋白5端已連接到骨架載體上。1. 3. 2 載體 pIRES2-BLG5-GH 的構建將上一步1. 3. 1獲得的質粒pIRES2-BLG5和步驟1. 1中獲得到pMD19-T_GH，用限 制性核酸內切酶EcoRI和Sal I酶切雙酶切，分別回收7. 5kb和654bp左右的片段。連接， 獲得質粒pIRES2-BLG5-GH，轉化JM109感受態(tài)菌株，菌落PCR篩選驗證陽性克隆，目的條帶 大小和預期一致，說明生長激素已連接上。1. 3. 3載體pcGH的構建將上一步1. 3. 2獲得的質粒和步驟1. 2中獲得到pMD19_T_BLG3載體，分別用Sal I單酶切。酶切后，分別回收8. Okb和1. 8bp左右片段，連接獲得乳腺特異性表達載體pcGH， 轉化JM109感受態(tài)菌株，菌落PCR篩選驗證陽性克隆，和限制性核酸內切酶鑒定，目的條帶 大小和預期一致，表明成功構建乳腺特異性表達載體pcGH。2乳腺特異性表達載體pcGH的提取及純化將乳腺特異性表達載體pcGH用OMIGA無內毒素質粒提取試劑盒提取和純化質粒， 具體操作步驟見說明書，提取的質粒保存于_20°C，準備細胞轉染。3人乳腺癌細胞Bcap-37的培養(yǎng)從液氮中取出人乳腺癌細胞Bcap-37，立即投入37 40°C溫水中快速晃動，直至 凍存液完全溶解。將細胞凍存液移入細胞培養(yǎng)瓶，加入約4mL培養(yǎng)液，放入37°C，5%的C02 培養(yǎng)。用體積分數10%胎牛血清、鏈霉素lOOug/mL，青霉素100U/mL的DMEM培養(yǎng)基進行培 養(yǎng)。轉染前l(fā)d，待細胞鋪滿培養(yǎng)皿底的70% 80%時，改用無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng) 基洗滌細胞2次，饑餓24小時后轉染。4轉染人乳腺癌細胞Bcap-37外源基因通過脂質體法轉染進入細胞，通常48h后才能表達，選取48h、60h、72h測 定外源基因的表達情況，具體試驗方案如下
待細胞鋪滿培養(yǎng)皿底的70% 80%時，將其接種到六個12孔板中培養(yǎng)，當細胞鋪 滿皿底80 90%時，改用無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基洗滌細胞2次，換用無血無抗的 DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，24小時后用于轉染。轉染前用無血無抗的培養(yǎng)基洗劑一次，轉染步驟按 Lipofectamine 2000說明書進行轉染。細胞培養(yǎng)6h后棄去混合液，用體積分數10%胎牛血 清、鏈霉素100ug/mL，青霉素100U/mL、氫化可的松5ug/mL，胰島素10ug/mL，轉鐵蛋白5ug/ mL的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，轉染后分別測定48h、60h、72h的表達量。5轉染人乳腺癌細胞Bcap-37后GH的檢測分別于48h、60h、72h收集細胞上清液，用鼠抗羊生長激素ELISA試劑盒檢測細胞 上清液中生長激素GH的含量，操作步驟按說明書進行。結果顯示，從48小時到第72小時， 轉染組(只轉染乳腺特異性表達載體pcGH) GH表達量均高于對照組(正常培養(yǎng)的人乳腺癌 細胞Bcap-37未轉染載體pcGH)。其中在第48小時轉染組的GH表達量136. 48ng/mL極顯 著高于對照組的GH表達量29.33ng/mL。轉染組GH的表達增加量約是對照組的4. 5倍。以 上結果表明本專利構建的乳腺特異性表達載體PcGH可以在乳腺上皮細胞上高效的表達 生長激素基因。
權利要求
一種高效表達山羊生長激素GH的乳腺特異性表達載體，其gh基因具有如SEQ ID NO.1所示的序列，其構建方法包括1)薩能奶山羊生長激素gh的克隆參照Genbank登陸號Y00767山羊生長激素gh基因的cDNA序列設計一對擴增生長激素cDNA的引物，并在上游引物上引入EcoRI限制性酶切位點，下游引物上引入SalI限制性酶切位點上游引物ZP35’ TAGAATTCATGATGGCTGCAGGCCCCCGGA 3’下游引物ZP45’ TAGTCGACCTAGAAGGCACAGCTGGCCTCCCCG 3’以薩能奶山羊肝臟組織的總RNA為模板，經反轉錄合成cDNA第一鏈后進行PCR擴增；PCR反應體系為25uL，PCR反應條件95℃預變性5min，95℃30sec，65℃30sec，72℃40sec，30個循環(huán)，72℃10min，4℃10min；將PCR產物連接到pMD19 T載體上，送交上海生工測序。測序后獲得具有完整編碼區(qū)的薩能奶山羊生長激素gh基因的cDNA序列SEQ ID NO.1；2)薩能奶山羊β 乳球蛋白5端和3端的克隆參照已發(fā)表的山羊的β 乳球蛋白序列Genbank登陸號Z33881，設計一對擴增β 乳球蛋白5端的引物，并在上游引物上引入Xho I限制性酶切位點，在下游引物上引入EcoRI限制性酶切位點，引物序列如下上游引物ZP15’ ATACTCGAGCCAGGCCAGAGGTGCTTTATTTCCG 3’下游引物ZP25’ TATGAATTCCTTCTGGATGTCCAGGCCTTTCATG 3’設計一對擴增β 乳球蛋白3端的引物，并在上游和下游引物上分別引入SalI限制性酶切位點，引物序列如下上游引物ZP55’ TATGTCGACCCTGCCGGTGCCTCTGTGGTAAGCT 3’下游引物ZP65’ ATCGTCGACGGGAGTCCTGAAGCGGGAGGGTGTT 3’以薩能奶山羊肝臟組織提取的DNA為模板，用合成的ZP1、ZP2引物PCR擴增β 乳球蛋白5端，PCR反應體系為25uL，PCR反應條件95℃預變性5min，95℃30sec，61℃30sec，72℃150sec，30個循環(huán)，72℃10min，4℃10min；將PCR產物連接到pMD19 T載體上，測序后獲得具有薩能奶山羊β 乳球蛋白5端的DNA序列SEQ ID NO.2；用合成的ZP5、ZP6引物擴增β 乳球蛋白3端，PCR反應體系為25uL，PCR反應條件95℃預變性5min；95℃30sec，67℃30sec，72℃40sec，30個循環(huán)；72℃10min，4℃10min，將PCR產物連接到pMD19 T載體上，測序后獲得具有薩能奶山羊β 乳球蛋白3端的DNA序列SEQ ID NO.3；3)乳腺特異性表達載體的構建將SEQID NO.1序列、SEQ ID NO.2和序列SEQ ID NO.3序列克隆至骨架載體pIRES2 EGFP上，獲得乳腺特異性表達載體pcGH。
全文摘要
本發(fā)明公開了高效表達山羊生長激素GH的乳腺特異性表達載體，屬于生物工程技術領域。GH的cDNA序列見SEQ ID NO.1。生長激素既可以促進乳腺導管形成，也可以促進山羊的乳腺上皮細胞的增殖，從而增加產奶量。將本發(fā)明構建的乳腺特異性表達載體pcGH采用脂質體法，導入體外培養(yǎng)的人乳腺癌細胞Bcap-37中，在轉染后收集細胞培養(yǎng)上清；采用ELISA的方法檢測細胞培養(yǎng)上清中的GH含量。結果顯示與未轉染pcGH的空白組細胞相比，轉染pcGH組細胞GH表達量顯著提高。表明pcGH載體可已在乳腺細胞上成功表達GH，為下一步生產轉gh基因奶山羊奠定堅實的基礎。
文檔編號C12N15/85GK101985635SQ201010544629
公開日2011年3月16日 申請日期2010年11月16日 優(yōu)先權日2010年11月16日
發(fā)明者庾慶華, 張強, 楊倩, 林 建 申請人:南京農業(yè)大學