生長(zhǎng)激素化合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明的領(lǐng)域是主要通過(guò)重組方法制備的生長(zhǎng)激素化合物。作為野生型生長(zhǎng)激 素，運(yùn)樣的化合物可用來(lái)治療其中具有生長(zhǎng)激素活性的化合物的血漿濃度增加對(duì)患者有益 的疾病或病癥。
[000引背景 生長(zhǎng)激素（GH)是由哺乳動(dòng)物垂體前葉分泌的多膚激素。取決于物種，GH是一種包含 大約190個(gè)氨基酸殘基（相當(dāng)于大約22kDa的分子量）的蛋白。GH結(jié)合于細(xì)胞表面受 體（GH受體（GHR))，并通過(guò)細(xì)胞表面受體發(fā)出信號(hào)。GH在促進(jìn)生長(zhǎng)，維持正常的身體成 分，合成代謝和脂質(zhì)代謝中起重要作用。它還具有對(duì)中間代謝的直接作用，例如降低葡萄 糖攝取，增加脂肪分解，增加氨基酸攝取和蛋白合成。激素也對(duì)其它組織包括脂肪組織、 肝、腸、腎、骨骼、結(jié)締組織和肌肉發(fā)揮作用。重組hGH(生長(zhǎng)激素）是可市售獲得的，例 如作為：Geno1:;ropin? (Pfizer)、Nirtropin?和Protropin? (Genentech)、Humatrope? (EliLilly)、Serostim? (Serono)、Norditropin(NovoNordisk)、0mnitrope(Sandoz)、 NutropinD巧ot(GenentechandA化ermes)。另外地，在N-末端具有另外的甲硫氨酸殘 基的類(lèi)似物也作為例如：Somatonorm?(PharmaciaUpjohn/Pfizer)上市。
[0003]GH與細(xì)-蛋白家族的其它成員，催乳素（P化）和胎盤(pán)生乳素（PU,共享一種共 同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。GH被分類(lèi)為一種四螺旋的束蛋白，其呈現(xiàn)一種具有兩個(gè)保守的二硫鍵的 "上-上-下-下"拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。特別地，成熟野生型人GH(由SEQIDNO: 1鑒別的hGH)包 含191個(gè)氨基酸殘基并在53、165、182和189位置含有4個(gè)半脫氨酸殘基，其通過(guò)形成分別 連接C53與C165和C182與C189的兩個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，穩(wěn)定蛋白的S維結(jié)構(gòu)。hGH的結(jié)構(gòu) 已通過(guò)X射線結(jié)晶學(xué)在游離形式（QiantaletL等（1995)ProteinandPeptideLetters 3，333-340)和在與其結(jié)合蛋白（人GHR化GHR)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域）的復(fù)合物中（deVos,A. M.等（1992)Science255，306-312)經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定。運(yùn)些結(jié)構(gòu)已存入蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（PDB) 且為公眾可獲得的（PDB檢索碼分別為IHGU和1HWG)。因此，可W從公布的hGH結(jié)構(gòu)，鑒定 對(duì)結(jié)合于hG皿的hGH為重要的殘基。研究證實(shí)，各種突變體具有對(duì)生長(zhǎng)激素受體的較低的 親和力（化nnin曲amBC,Proc化tlAcadSciUSA. 1991Apr15;88(8): 3407-11 和 Cunnin曲amBC,WellsJA,Science. 1989 化n2;244(4908): 1081-5)。此外，h細(xì)的動(dòng) 態(tài)特性已通過(guò)核磁共振（NMOLR)光譜研究化asimovaM.R.等J.Mol.Biol. (2002) 318， 679-695)。成熟人GHR在此由SEQIDNO: 2 (包含由信號(hào)膚去除生成的GHR基因編碼蛋 白的AA19-638)鑒定。也稱(chēng)為生長(zhǎng)激素結(jié)合蛋白的細(xì)胞外部分構(gòu)成AA19 - 256。
[0004]hGH已經(jīng)受廣泛的誘變并被修飾W試圖產(chǎn)生具有改變的化學(xué)或生物學(xué)特性的hGH 類(lèi)似物及其綴合物，包括生長(zhǎng)激素的半脫氨酸突變體、蛋白酶穩(wěn)定的突變體和聚乙二醇化 形式，如在例如US2003/0162949、W0 02/055532 和W02006048777 中描述的。
[0005] 在具有增加功能性的生長(zhǎng)激素化合物的探索中，需要具有增加的半壽期的化合 物，W減少所需化合物的量和給予治療劑的頻率。
[0006] 受抗體治療的巨大成功的啟發(fā)，使用抗體免疫球蛋白Fc區(qū)域作為延長(zhǎng) 子（protractor)的深入研究提供了具有增加半壽期的生長(zhǎng)激素化合物，如描述于W02012/008779 和W02006/107124、W02005 047334/35/36/37 中的化合物，其中Fc區(qū) 域經(jīng)由非膚基聚合物（PEG)共價(jià)連接于生長(zhǎng)激素，和生長(zhǎng)激素融合物，例如如描述于WO 01/03737、W0 200814743、US7404956、W0 04101739 和W02005001025 中的Fc融合物。 US2012/0116056描述人生長(zhǎng)激素化GH)的Fc融合蛋白和旨在減少不需要的Fc-介導(dǎo)的副 作用的特定人IgGFc變體的選擇。
[0007] 雖然運(yùn)樣的方法適合于增加hGH的半壽期，但增加生長(zhǎng)激素化合物的半壽期和穩(wěn) 定性的愿望甚至更加保持高優(yōu)先級(jí)，W便能夠提供給患者便利的治療劑。
概述 本發(fā)明的主要方面設(shè)及具有延長(zhǎng)的半壽期的生長(zhǎng)激素化合物，如本文通過(guò)與免疫球蛋 白Fc區(qū)域的融合物所舉例的。所述化合物的特征與人生長(zhǎng)激素比較還在于改變的氨基酸 序列，改變一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。運(yùn)樣突變的不尋常的特征旨在部分地改變與人生長(zhǎng)激 素比較的功能。
[0011] 運(yùn)樣的生長(zhǎng)激素變體在延長(zhǎng)的生長(zhǎng)激素化合物的情況下提供甚至進(jìn)一步延長(zhǎng)的 半壽期，同時(shí)保留人生長(zhǎng)激素的生物學(xué)活性。因此，運(yùn)樣的化合物可有助于解決提供治療的 生長(zhǎng)激素化合物的問(wèn)題，所述化合物可W低頻率和W低劑量給予，W提供給患者能夠增加 在血液中的生長(zhǎng)激素活性的便利的產(chǎn)品。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明設(shè)及包含連接于抗體 Fc-結(jié)構(gòu)域的生長(zhǎng)激素變體（GH-變體-Fe)的生長(zhǎng)激素化合物。在一個(gè)運(yùn)樣的實(shí)施方案中， 所述化合物由兩個(gè)多膚組成，一個(gè)是GH-變體-Fe多膚融合物和一個(gè)是與GH-變體-Fe多 膚融合物的Fe序列連接的Fe-多膚。在一個(gè)實(shí)施方案中，生長(zhǎng)激素化合物包含在GH變體 的序列中的1-5個(gè)點(diǎn)突變，其減少對(duì)生長(zhǎng)激素受體的親和力。依據(jù)本發(fā)明的生長(zhǎng)激素化合 物顯示出體內(nèi)延長(zhǎng)的半壽期燈1/2)W及誘導(dǎo)延長(zhǎng)的IGF-反應(yīng)的能力。
[0012] 本發(fā)明的其它方面設(shè)及生產(chǎn)運(yùn)樣的化合物，特別是編碼GH-變體-Fe融合多膚的 DNA序列和載體和包含運(yùn)樣的編碼GH-變體-Fe融合多膚的載體任選與編碼Fe多膚的載體 組合的宿主細(xì)胞的方法和工具。
[0013] 附圖簡(jiǎn)述 圖1顯示4個(gè)生長(zhǎng)激素變體Fe-融合化合物的藥代動(dòng)力學(xué)曲線圖。每個(gè)生長(zhǎng)激素Fe-融 合化合物具有相同的一般結(jié)構(gòu)：hGH-接頭-Fe(IgGl)/Fe(IgGl)。生長(zhǎng)激素序列中的突變?cè)?每個(gè)分子的圖例中指明。
[0014] 圖2顯示，在單劑量靜脈內(nèi)給予Sprague Dawley大鼠后，生長(zhǎng)激素變體Fe-融合 化合物的IGF-I血漿濃度-時(shí)間曲線圖。圖2A顯示IGF-I的總濃度，而圖2B顯示基線校 正的IGF-I血漿濃度。生長(zhǎng)激素序列的突變?cè)诿總€(gè)分子的圖例中指明。
[0015] 圖3顯示，在單劑量靜脈內(nèi)給予15nmolol后，生長(zhǎng)激素變體Fe-融合化合物對(duì)垂 體切除的SpragueDawley大鼠體重的影響。生長(zhǎng)激素序列的突變?cè)诿總€(gè)分子的圖例中指 明。
[001引定義 術(shù)語(yǔ)"結(jié)合親和力"在此用作兩個(gè)分子（例如受體和配體）之間的非共價(jià)相互作用的 強(qiáng)度的量度。術(shù)語(yǔ)"結(jié)合親和力"被用來(lái)描述單價(jià)相互作用（固有活性）。
[0017] 術(shù)語(yǔ)"核巧酸序列"被用來(lái)限定編碼多膚的DNA(或RNA序列）。
[0018] 術(shù)語(yǔ)"氨基酸"包括由遺傳密碼編碼的氨基酸組，其在此稱(chēng)為標(biāo)準(zhǔn)氨基酸。還包括 的是不由遺傳密碼編碼的天然氨基酸，W及合成氨基酸。
[0019] 本文所用的術(shù)語(yǔ)"多膚"和"膚"意指由至少兩個(gè)通過(guò)膚鍵連接的氨基酸組成的化 合物。
[0020] 本文所用的術(shù)語(yǔ)"蛋白"意指由一個(gè)或多個(gè)多膚組成的指生物化學(xué)化合物。
[0021] 術(shù)語(yǔ)"藥物"、"治療劑"、"藥劑"或"藥品"當(dāng)在此使用時(shí)，指用于藥用組合物的活 性成分，其可用于療法中。
[0022] 術(shù)語(yǔ)"生長(zhǎng)激素變體"在此用來(lái)描述生長(zhǎng)激素蛋白的類(lèi)似物，其具有不同于由SEQ IDNO1鑒定的成熟人生長(zhǎng)激素的序列的氨基酸序列。
[0023] 術(shù)語(yǔ)"Fe-結(jié)構(gòu)域"在此用來(lái)描述兩個(gè)Fe多膚的復(fù)合物。
[0024] 術(shù)語(yǔ)"復(fù)合物"在此用來(lái)描述至少兩個(gè)多膚的結(jié)合，運(yùn)兩個(gè)多膚并不通過(guò)在編碼核 巧酸序列的翻譯期間建立的膚鍵連接。所述結(jié)合可W是共價(jià)的或非共價(jià)的。
[0025] 術(shù)語(yǔ)"延長(zhǎng)的部分"在此用于定義具有延長(zhǎng)蛋白的體內(nèi)半壽期的能力的單位。術(shù)語(yǔ) 因此包含熟知的實(shí)體，例如Fc-結(jié)構(gòu)域、PEG分子、血清白蛋白、白蛋白粘合劑、生長(zhǎng)激素結(jié) 合蛋白、AA聚合物（如用于XTEN技術(shù)（Amunix,MountainView,CA),和用于PASylation? 狂L-蛋白GMBH,化eising,德國(guó)）），和碳水化合物組例如徑乙基淀粉和細(xì)菌肝素前體 化ep曰ros曰n)。
[0026] 描述 本發(fā)明設(shè)及包含連接于抗體Fc-結(jié)構(gòu)域的生長(zhǎng)激素變體的生長(zhǎng)激素化合物，運(yùn)樣的化 合物可W簡(jiǎn)稱(chēng)為"GH-變體-Fc"。
[0027] 生長(zhǎng)激素化合物 成熟人生長(zhǎng)激素蛋白包含用3個(gè)環(huán)（環(huán)1-3或L1-3)連接的4個(gè)螺旋（螺旋1-4或 化-4)，和C-末端區(qū)段。在人生長(zhǎng)激素中，螺旋1由AA殘基6-35限定，螺旋2由AA殘基 71-98限定，螺旋3由AA殘基107-127限定和螺旋4定義為AA殘基155-184。通過(guò)生長(zhǎng)激 素受體的相互作用，生長(zhǎng)激素介導(dǎo)其生物學(xué)活性。
[0028] 如將在本文下面所描述的，依據(jù)本發(fā)明的生長(zhǎng)激素化合物包含生長(zhǎng)激素部分和延 長(zhǎng)的部分，生長(zhǎng)激素部分被認(rèn)為負(fù)責(zé)化合物的生物學(xué)功能性，而延長(zhǎng)的部分至少部分地負(fù) 責(zé)延長(zhǎng)生長(zhǎng)激素化合物的半壽期。
[0029] 因此，生長(zhǎng)激素化合物通常包括生長(zhǎng)激素多膚，例如具有與如通過(guò)SEQIDNO1鑒 定的人生長(zhǎng)激素的高水平同一性的氨基酸鏈。如在本文下面所描述的，依據(jù)本發(fā)明的生長(zhǎng) 激素化合物包含如由不同于人生長(zhǎng)激素的序列的蛋白序列所限定的生長(zhǎng)激素變體。
[0030] 依據(jù)本發(fā)明的生長(zhǎng)激素化合物涵蓋生長(zhǎng)激素融合物和生長(zhǎng)激素綴合物二者。如 從措辭上顯而易見(jiàn)的，生長(zhǎng)激素融合化合物包括借助于至少一個(gè)膚鍵連接于第二蛋白序列 的生長(zhǎng)激素序列，而生長(zhǎng)激素綴合物指生長(zhǎng)激素部分和延長(zhǎng)的部分通過(guò)化學(xué)修飾的共價(jià)連 接。融合蛋白的生成是本領(lǐng)域熟知的且通常經(jīng)使用重組表達(dá)載體表達(dá)融合蛋白而獲得，所 述載體將編碼所述生長(zhǎng)激素序列的DNA序列與編碼所述第二蛋白的第二DNA序列（任選地 包括接頭序列）連接。生長(zhǎng)激素融合物包括，但不限于，包含抗體Fc-結(jié)構(gòu)域的融合物。
[0031] 同樣地，生長(zhǎng)激素部分和延長(zhǎng)的部分的綴合可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法獲得，其中 Fc-結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接于生長(zhǎng)激素變體。連接可W是在N-末端或C-末端氨基酸殘基或在生 長(zhǎng)激素變體的鏈中氨基酸殘基上。點(diǎn)突變可被引入生長(zhǎng)激素W促進(jìn)延長(zhǎng)部分的運(yùn)樣的連 接。
[0032] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明設(shè)及包含連接于抗體Fc-結(jié)構(gòu)域的生長(zhǎng)激素變體的生 長(zhǎng)激素化合物，其可通過(guò)GH-變體-Fc描述。
[0033] 生長(zhǎng)激素變體 依據(jù)本發(fā)明的生長(zhǎng)激素變體具有不同于由SEQIDNO. : 1鑒定的成熟人生長(zhǎng)激素序列 的序列。
[0034] 所述差異可通過(guò)與天然存在的人生長(zhǎng)激素序列比較，添加和/或缺失和/或替代 至少一個(gè)氨基酸殘基而引起。該術(shù)語(yǔ)是用于突變生長(zhǎng)激素蛋白的，其中生長(zhǎng)激素序列的一 個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已被另一個(gè)氨基酸殘基替代和/或其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已從 生長(zhǎng)激素缺失和/或其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已經(jīng)添加和/或插入生長(zhǎng)激素中。
[0035] 在一個(gè)實(shí)施方案中，依據(jù)本發(fā)明的生長(zhǎng)激素變體包含相對(duì)于人生長(zhǎng)激素的少于8 個(gè)修飾（替代、缺失和/或添加）。在一個(gè)實(shí)施方案中，生長(zhǎng)激素變體包含相對(duì)于人生長(zhǎng)激 素的少于7個(gè)修飾（替代、缺失和/或添加）。在一個(gè)實(shí)施方案中，生長(zhǎng)激素變體包含相對(duì) 于人生長(zhǎng)激素的少于6個(gè)修飾（替代、缺失和/或添加）。在一個(gè)實(shí)施方案中，生長(zhǎng)激素變 體包含相對(duì)于人生長(zhǎng)激素的少于5個(gè)修飾（替代、缺失和/或添加）。在一個(gè)實(shí)施方案中， 生長(zhǎng)激素變體包含相對(duì)于人生長(zhǎng)激素的少于4個(gè)修飾（替代、缺失和/或添加）。在一個(gè)實(shí) 施方案中，生長(zhǎng)激素變體包含相對(duì)于人生長(zhǎng)激素的少于3個(gè)修飾（替代、缺失和/或添加）。 在一個(gè)實(shí)施方案中，生長(zhǎng)激素變體包含相對(duì)于人生長(zhǎng)激素的少于2個(gè)修飾（替代、缺失和/ 或添加）。在一系列的實(shí)施方案中，生長(zhǎng)激素的生長(zhǎng)激素變體與由SEQIDNO: 1鑒定的人 生長(zhǎng)激素有至少95、96、97、98或99 %同源性。
[0036] 在一個(gè)實(shí)施方案中，生長(zhǎng)激素變體包含正好7個(gè)氨基酸修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中， 生長(zhǎng)激素變體包含正好6個(gè)氨基酸修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，生長(zhǎng)激素變體包含正好5個(gè) 氨基酸修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，生長(zhǎng)激素變體包含正好4個(gè)氨基酸修飾。在一個(gè)實(shí)施方 案中，生長(zhǎng)激素變體包含正好3個(gè)氨基酸修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，生長(zhǎng)激素變體包含正好 2個(gè)氨基酸修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，生長(zhǎng)激素變體包含正好1個(gè)氨基酸修飾。
[0037] 如上所述，生長(zhǎng)激素的總體結(jié)構(gòu)是眾所周知的和二維和=維結(jié)構(gòu)識(shí)別可至少被部 分地分配不同的功能的各個(gè)區(qū)域。二級(jí)結(jié)構(gòu)限定螺旋1-4和插入的環(huán)1-3。生長(zhǎng)激素受體 結(jié)合已被分配至稱(chēng)為位點(diǎn)1和位點(diǎn)2的=維位點(diǎn)，其各自跨多個(gè)不連續(xù)的氨基酸序列段。如 本文描述的，與包含由SEQIDNO1鑒定的人生長(zhǎng)激素的hGH或GH化合物比較，由于在位 點(diǎn)1或位點(diǎn)2的點(diǎn)突變或AA缺失，GH化合物/GH變體優(yōu)選地具有經(jīng)由位點(diǎn)1或位點(diǎn)2與 hGHR較低的結(jié)合親和力。
[0038] 在一個(gè)實(shí)施方案中，生長(zhǎng)激素變體在位點(diǎn)1 (螺旋1巧-35)和環(huán)1 (36-71)和螺 旋4 (155-184))具有至少一個(gè)點(diǎn)突變，例如在螺旋1，在對(duì)應(yīng)于Metl4、Hisl8、His21、Gln22 和化e25的位置。
[0039] 在一個(gè)實(shí)施方案中，生長(zhǎng)激素變體在環(huán)1，例如在對(duì)應(yīng)于Lys41、Tyr42、Leu45、 Gln46、Asn47、P;ro48、Gln49、Ser51、Leu52、ProSg、ProGI、Ser62、Asn63、Ar挑 4、Glu65、！'虹 67 和Gln68的位置或例如在對(duì)應(yīng)于Lys41、Leu45、Pro59、Pro61、Arg64和Glu65的位置具有 至少一個(gè)點(diǎn)突變。
[0040] 在一個(gè)實(shí)施方案中，生長(zhǎng)激素變體在螺旋4,例如在對(duì)應(yīng)于Tyr164、Argl67、 Lysl68、Aspl71、Lysl72、Glul74、T虹 175、Phel76、A巧 178、Ilel79、Cysl82、切sl89 和 Glyl90的位置或例如在對(duì)應(yīng)于Lysl72、Glul74、T虹175、化6176和Argl78的位置具有至 少一個(gè)點(diǎn)突變。
[0041] 在一個(gè)實(shí)施方案中，生長(zhǎng)激素變體在位點(diǎn)2 (N-末端和螺旋1 (1-35)和/或環(huán)2/ 螺旋3 (99-127))具有至少一個(gè)點(diǎn)突變。
[0042] 在一個(gè)實(shí)施方案中，生長(zhǎng)激素變體在N-末端和螺旋1，例如在對(duì)應(yīng)于化el、Pro2、 1164、？'〇5、1^6116、4'妍、1^6119、431112、41日13、1^61115、4'邑16和4'邑19的位置具有至少一個(gè)點(diǎn) 突變。
[0043] 在一個(gè)實(shí)施方案中，生長(zhǎng)激素變體在環(huán)2/螺旋3例如在對(duì)應(yīng)于Vall02、Tyrl03、 Asnl09、Aspll6、Leull7、Glull9、Glyl20 和！'虹 123 的位置具有至少一個(gè)點(diǎn)突變。
[0044] 在一個(gè)實(shí)施方案中，生長(zhǎng)激素變體在螺旋3 (AA107-127)，例如在對(duì)應(yīng)于Asnl09、 Asplie、Leull7、Glull9、Glyl20和！'虹123的位置具有至少一個(gè)點(diǎn)突變。
[0045] 在一個(gè)實(shí)施方案中，生長(zhǎng)激素變體在對(duì)應(yīng)于G120的位置具有點(diǎn)突變。
[0046] 在一個(gè)實(shí)施方案中，生長(zhǎng)激素變體在對(duì)應(yīng)于Lys41、Ar挑4、Lysl72和/或Glyl20 的位置具有至少一個(gè)點(diǎn)突變。
[0047] 在一個(gè)實(shí)施方案中，生長(zhǎng)激素變體在對(duì)應(yīng)于Lys41、Ar挑4、Lysl72和/或Glyl20 的位置具有至少兩個(gè)點(diǎn)突變。
[0048] 在一個(gè)實(shí)施方案中，生長(zhǎng)激素變體在對(duì)應(yīng)于Lys41、Ar挑4、Lysl72和/或Glyl20 的位置具有至少3個(gè)點(diǎn)突變。
[0049] 在一個(gè)實(shí)施方案中，生長(zhǎng)激素變體在對(duì)應(yīng)于Lys41、Arg64和/或LyS172的位置具 有至少一個(gè)點(diǎn)突變。
[0050] 在一個(gè)實(shí)施方案中，生長(zhǎng)激素變體在對(duì)應(yīng)于Lys41、Arg64和/或LyS172的位置具 有至少兩個(gè)點(diǎn)突變。
[0051] 在一個(gè)實(shí)施方案中，生長(zhǎng)激素變體具有正好1、2或3個(gè)點(diǎn)突變。在一個(gè)實(shí)施方案 中，生長(zhǎng)激素變體在對(duì)應(yīng)于Lys41、Arg64或LyS172的位置具有單一的突變。
[0052] 在一個(gè)實(shí)施方案中，生長(zhǎng)激素變體具有選自K41A、R64A和K172A的1個(gè)點(diǎn)突變。 在一個(gè)實(shí)施方案中，生長(zhǎng)激素變體具有選自K41A、R64A和K17