在疏水性相互作用位點內(nèi)引入了靜電相互作用的蛋白及其制備方法
【專利說明】在疏水性相互作用位點內(nèi)引入了靜電相互作用的蛋白及其 制備方法 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及具有高純度的異源雙特異性抗體度sAb)或雙特異性融合蛋白 度3巧）。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 大多數(shù)雙特異性抗體度sAb)均通過人工制造W同時結(jié)合兩個不同的祀標，而不 是通常在自然界中產(chǎn)生。雙重祀向能力為BsAb提供了新的尚未被單特異性抗體（MsAb)設(shè) 足的應(yīng)用領(lǐng)域。對治療性目的的特別關(guān)注是引人深思的可能性，W使得BsAb(I)可靠地將 免疫細胞募集到祀細胞附近，（2)抑制或激活祀細胞中兩個相隔較遠的信號傳導(dǎo)通路W產(chǎn) 生協(xié)同效應(yīng)，W及（3)W特異性和調(diào)控方式遞送福射誘導(dǎo)的治療性物質(zhì)、藥品、毒素或信號 傳導(dǎo)分子。
[000引 BsAb通常用于W非M肥依賴性方式將T細胞遞送到腫瘤細胞中，從而介導(dǎo)腫瘤細 胞的細胞表面抗原與細胞毒性T細胞的CD3-TCR復(fù)合物之間的聯(lián)系（圖1)。圖1中的卡妥 索單抗(民6皿>^純?)(大鼠-小鼠混合單克隆抗體）用于治療惡性腹水，其稱為功能抗 體"。
[0004] 完整的鏈締合應(yīng)在兩個不同的水平上發(fā)生，W便產(chǎn)生修飾最少的全長IgG樣的 BsAb,而無任何鏈締合問題。（1)兩條重鏈應(yīng)為異源雙特異性的，并且（2)兩條輕鏈化C)應(yīng) 與其相應(yīng)的重鏈正確配對。
[0005] 鏈締合問題應(yīng)加W解決W按值得信賴的方法產(chǎn)生BsAb。如圖2中所示，兩條重鏈 和兩條輕鏈的組合生成了 10個不同形式的抗體嵌合體。在它們之中，僅有一個是正確的 BsAb,而其余的是無價值的嵌合體。該鏈締合問題在工業(yè)領(lǐng)域中將正確的BsAb的產(chǎn)率降低 至至少10倍，并導(dǎo)致難W將BsAb與其他嵌合體分離的各種問題。因此，許多制藥公司花費 了大量的資源并努力開發(fā)和獲得W直接且可靠的方式產(chǎn)生BsAb的技術(shù)。
[0006] 已開發(fā)了多種多樣的BsAb相關(guān)技術(shù)（45種不同的形式）。運些技術(shù)基于結(jié)構(gòu)而 被分成4類。第一，通過包括稱為Knob-into-Hole或簡稱為KiH的結(jié)構(gòu)互補性、靜電指向 效應(yīng)或C冊結(jié)構(gòu)域混編（稱為SE邸bodyTM)的各種方法對重鏈進行的異源雙特異化；第二， 各種抗體片段形式，諸如Di油odyTM、BiTETM和DARTTM;第S，使用與完整抗體相結(jié)合的一 個或多個功能性結(jié)構(gòu)域的技術(shù)，諸如ModularAntibodyTM、ZybodyTM、dAbsTM和DVD-IGTM; 第四，采用全長IgG類似方案的技術(shù)，如DuobodyTM(F油-ArmExchange)、CrossMabTM、 AzymetricTM和klbodyTM,已得到開發(fā)。
[0007] 在它們之中，Zymeworks通過美國專利申請第2013-892198號（對在Fe結(jié)構(gòu)域中 具有突變的異源多聚體免疫球蛋白鏈的結(jié)構(gòu)專利提出了權(quán)利要求）表明異源多聚體結(jié)構(gòu) 的抗體可通過用帶電荷的氨基酸對二硫鍵中設(shè)及的半脫氨酸殘基進行修飾而制備。
[0008] 然而，W上任何專利均未公開運樣一種技術(shù)：選自疏水性相互作用部分的修飾氨 基酸對通過靜電相互作用而引起與彼此選擇性偶合。本發(fā)明人已通過確認W下方面而完成 了本發(fā)明：當將疏水性相互作用中設(shè)及的一對氨基酸分別修飾成酸性氨基酸和堿性氨基酸 時，異源雙特異化更具選擇性地發(fā)生。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[000引【技術(shù)問題】
[0010] 本發(fā)明的目的在于提供具有優(yōu)異的異源雙特異化的雙特異性抗體（異源二聚 體）。
[0011] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種通過將疏水性相互作用中的一對氨基酸改變 成彼此相反的電荷而制造異源雙特異化很好地發(fā)生的蛋白的方法。
[001引【技術(shù)方案】
[0013] 對于W上目標，本發(fā)明的第一方面是提供通過上述負電荷和上述正電荷而引入了 靜電相互作用的蛋白，其中一對疏水性氨基酸選自蛋白的疏水性相互作用的一部分，將一 個疏水性氨基酸改變成正電荷，并將另一個疏水性氨基酸改變成負電荷。帶有正電荷的材 料可W是堿性氨基酸但不限于此，帶有負電荷的材料可W是酸性氨基酸但不限于此。
[0014] 疏水性氨基酸是選自甘氨酸、丙氨酸、鄉(xiāng)氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨 酸和苯丙氨酸中的任一種氨基酸，并且酸性氨基酸是選自天冬氨酸或谷氨酸的任一種氨基 酸。
[0015] 從兩個不同的肥/LC對來組裝全長IgG類似的雙特異性抗體通過兩個鏈締合過程 進行。換句話講，HC異源雙特異化和富有成效的HC/LC配對，及其在兩條重鏈之間的成功 率取決于區(qū)分重鏈與輕鏈的效率。
[0016] 為了找到適當?shù)淖儺愇稽c，已關(guān)注了抗體的鏈之間的疏水性界面上的氨基酸殘 基，因為疏水性相互作用是蛋白折疊和結(jié)合的主要驅(qū)動力。為了選擇如同疏水性相互作用 一樣強大的適當類型的修飾（因為其提供解決雙特異性抗體的鏈締合問題所必需的蛋白 鑒別力），已選擇了靜電相互作用。
[0017] 據(jù)設(shè)想，此類鏈之間的區(qū)別通過在兩條結(jié)合鏈之間的界面處引入結(jié)構(gòu)修飾的互補 配對而解決。一個或多個疏水性氨基酸被突變的帶電荷的氨基酸替換W與對應(yīng)物配對。運 樣的變化在下文中稱為S冊CAP(將疏水性置換成帶相反電荷的氨基酸對）。兩條重鏈的Fc 結(jié)構(gòu)域中的甜OCAP生成帶正電和帶負電的重鏈（各自稱為化和化）。運些靜電相互作用 比重鏈的同源雙特異化（同源二聚化）更偏向于異源雙特異化（異源二聚化）。W相同的 方式，通過S冊CAP對兩個Fab結(jié)構(gòu)域的修飾形成帶正電和帶負電的輕鏈（分別稱為La和 化），并且與重鏈的帶相反電荷的Fab結(jié)構(gòu)域的靜電相互作用提高了正確HC/LC配對的概 率。
[0018]為了在無任何鏈締合問題的情況下產(chǎn)生BsAb，將兩個獨立的修飾引入天然存在的 抗體中。一個針對Fc結(jié)構(gòu)域的異源雙特異化，而另一個針對重鏈與輕鏈的正確配對。
[0019] 在本發(fā)明中，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域的異源雙特異化（異源二聚化）在抗體的Fc結(jié)構(gòu)域中的 一個或多個疏水性相互作用轉(zhuǎn)化成靜電對相互作用（例如，第407位殘基處的兩個酪氨酸 的疏水性相互作用燈407:Y407)轉(zhuǎn)化成第407位殘基處天冬氨酸和賴氨酸的靜電對相互作 用值407:K407))時可靠且積極地發(fā)生。
[0020] 當F油結(jié)構(gòu)域的主要疏水性殘基被置換時（例如，第128位殘基的亮氨酸和第118 位殘基的苯丙氨酸化128:F118)置換成第128位殘基的賴氨酸和第118位殘基的天冬氨酸 化128:0118))時，使用甜OCAP技術(shù)可較為容易地區(qū)分兩條重鏈（重鏈）和兩條輕鏈（輕 鏈）。因此，IgG類似的雙特異性抗體可通過將甜OCAP技術(shù)應(yīng)用于抗體的Fc和F油結(jié)構(gòu)域 而生成。
[0021] 本發(fā)明的第二方面是提供運樣的抗體，其中已通過將一個疏水性氨基酸突變成帶 正電的氨基酸并將另一個突變成帶負電的氨基酸而將靜電相互作用引入了疏水性相互作 用區(qū)。W上正電荷可W是堿性的但不限于此，并且W上負電荷可W是酸性的但不限于此。
[0022] 具體地，抗體因W下兩者之間的靜電相互作用而具有結(jié)合力：任一個氨基酸突變 成選自天冬氨酸或谷氨酸的酸性氨基酸，而另一個突變成選自賴氨酸、精氨酸或組氨酸的 堿性氨基酸，其中，突變被引入選自W下的一個或多個氨基酸對：CH3結(jié)構(gòu)域中的351亮氨 酸和351亮氨酸疏水性相互作用對、395脯氨酸和397鄉(xiāng)氨酸疏水性相互作用對、395脯氨 酸和395脯氨酸疏水性相互作用對、407酪氨酸和407酪氨酸疏水性相互作用對；W及人抗 體的CHl結(jié)構(gòu)域與化結(jié)構(gòu)域之間的128亮氨酸和118苯丙氨酸對、128亮氨酸和133鄉(xiāng)氨 酸對、141丙氨酸和116苯丙氨酸對、141丙氨酸和135亮氨酸對、145亮氨酸和133鄉(xiāng)氨酸 對、170苯丙氨酸和135亮氨酸對、185鄉(xiāng)氨酸和118苯丙氨酸對W及185鄉(xiāng)氨酸和135亮 氨酸對。更具體地，抗體被表征為在選自表4中的ZO至Z14的一組組合上發(fā)生突變?？?體可帶有一對具有一對功能的胞外域。胞外域可在癌癥和信號傳導(dǎo)中發(fā)揮作用，并且該毒 素可用于治療通過另一種特異性抗體結(jié)合的與細胞死亡相關(guān)的癌癥。胞外域可W是選自 TNR2、Her3、Tie2、TGFbRU BMPbRU Il-12R-bl、IL-4Ra、ITGA4、ITGA2B、INFAR1、IL-12A、 IL-4、InFa、BMP2、IL-lRlL、IL-17RA、n^-17AJas、FltD2、Herl、Tiel、TGFbR2、n^-12R-b2、 比-13Ral、IT