專利名稱：用于免疫球蛋白類蛋白質(zhì)分離純化的色譜介質(zhì)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于免疫球蛋白類蛋白質(zhì)分離純化的色譜介質(zhì)及其制備方法，屬于用 于分離純化免疫球蛋白的色譜介質(zhì)技術(shù)。
背景技術(shù)：
近些年來，抗體被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷和疾病治療中。2006年FDA批準(zhǔn)的20余 種抗體類藥物全球銷售額超過170億美元04w歷o^/mo/丄a6， 24(8): 8 (2006))?？贵w藥物制 備通常采用沉淀、離子交換色譜、疏水性相互作用色譜、親和色譜等方法完成，其過程成 本約占生產(chǎn)成本的30%~40%。以目前廣泛應(yīng)用的親和蛋白A色譜為例，盡管蛋白A與抗 體的Fc片段間專一性的識別使經(jīng)由蛋白A色譜分離得到的抗體具有較高的純度，但其高 昂的價格、脆弱的結(jié)構(gòu)及牽強(qiáng)人意的偶聯(lián)方法和洗脫條件嚴(yán)重影響其產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程 9: 211 (2000); /C/wwatogr A 1122: 144 (2006))。近來，受到以追求產(chǎn)物高 收率為目標(biāo)的高密度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展的影響，抗體純化成本有更加增大的趨勢。
針對以上問題，Biosepra公司公布了以含巰基的雜環(huán)化合物為配基的擬親和色譜介質(zhì) 用于抗體的分離(US Patent 5719269A1)。該介質(zhì)通過與免疫球蛋白間的選擇性作用吸附目 標(biāo)蛋白。在電導(dǎo)率低于100mS/cm的范圍內(nèi)，該色譜介質(zhì)的動態(tài)吸附量與電導(dǎo)率無關(guān)并維 持在30mg/mL作用，顯示出很好的耐鹽特性，更加適應(yīng)高密度細(xì)胞培養(yǎng)液的處理(細(xì)胞 培養(yǎng)液的電導(dǎo)率在13-16 mS/cm)。同時色譜介質(zhì)因采用了價格較蛋白A便宜的化學(xué)配基 而更加穩(wěn)定，使用周期長。Upfront Chromatography A/S報道了以含有羧基的芳香或雜環(huán)化 合物為配基的色譜介質(zhì)(US Patent 6498236B1)，其對抗體的吸附效率達(dá)到80-100%(吸附效 率定義為吸附前后液相中蛋白濃度差與吸附前液相中蛋白濃度之比)。但這種較高的吸附 效率通常出現(xiàn)在低鹽和少量親水性有機(jī)溶劑存在的條件下。GE Healthcare于2007年5月' 公開了一種分離抗體的多模式配基色譜介質(zhì)，通過電子受體-供體間相互作用實現(xiàn)免疫球 蛋白的吸附(USPatent2007112178Al)。該色譜介質(zhì)由帶有碳、硫或氧原子的芳香或雜環(huán)芳 香化合物構(gòu)成，如3-氨基-4-丙磺?；?2-羧基噻吩等。在牛血清白蛋白存在條件下，單克 隆抗體在色譜介質(zhì)上的動態(tài)吸附量可達(dá)40 mg/mL。隨著抗體藥物在近年來的興起，作為 抗體制備關(guān)鍵技術(shù)的抗體色譜也受到了日益廣泛地關(guān)注。目前抗體色譜雖初步實現(xiàn)了在較 寬離子強(qiáng)度范圍內(nèi)目標(biāo)產(chǎn)物的高容量吸附，但昂貴的配基價格、相對苛刻的洗脫條件等仍 然制約著抗體色譜的推廣和應(yīng)用。因此，尋找并開發(fā)廉價、穩(wěn)定及洗脫條件相對溫和的配 基是當(dāng)前抗體色譜發(fā)展中急待解決的問題，其對抗體藥物的產(chǎn)業(yè)化所要求的大規(guī)模制備技 術(shù)的實現(xiàn)具有重要的經(jīng)濟(jì)和技術(shù)價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于開發(fā)一種用于免疫球蛋白類蛋白質(zhì)分離純化的色譜介質(zhì)及制備方 法。所述的分離純化色譜介質(zhì)具有吸附量大的特點，其制備方法過程簡單，價格低廉。
本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案加以實現(xiàn)的， 一種用于免疫球蛋白類蛋白質(zhì)分離純化的色 譜介質(zhì)，其特征在于，該色譜介質(zhì)是在平均粒徑為30-300 ym的瓊脂糖凝膠顆粒的介質(zhì) 表面偶聯(lián)烯丙基的間隔臂，在間隔臂的末端偶聯(lián)咪唑和苯的雙環(huán)化合物D為介質(zhì)的配基。 色譜介質(zhì)的結(jié)構(gòu)表達(dá)形式如下
其中R3、 R4、 R5、 R6、 R7中的一個基團(tuán)必為氨基或甲基氨，其余的基團(tuán)及R1、 R2 為氫原子和含有1-4個碳原子的短鏈垸烴一種。
上述的咪唑和苯的雙環(huán)化合物D選自2-(咪唑-l-基)苯胺、4-(咪唑-l-基)苯胺、3-(咪 唑-l-基)苯胺、4-咪唑-l-基-2-甲基-苯胺、4-咪唑-l-基-苯甲胺、2-咪唑-l-基-苯甲胺和3-甲基_4-(咪唑-1-基)苯胺。
上述用于免疫球蛋白類蛋白質(zhì)分離純化的色譜介質(zhì)的制備方法，其特征在于包括以下 過程
1.介質(zhì)的烯丙基化反應(yīng)
將平均粒徑為30-300 pm的瓊脂糖凝膠顆粒的介質(zhì)，加入二甲基亞砜中形成介質(zhì)的懸 浮液，二甲基亞砜的體積用量為介質(zhì)體積量的0.05-2倍，繼而向介質(zhì)懸浮液中加入體積用
其中，咪唑和苯的雙環(huán)化合物D結(jié)構(gòu)式如I式所示:
量為介質(zhì)體積量的0.05-1倍、濃度為0.5-6 mol/L氫氧化鈉溶液，混合均勻，制得混合懸 浮液，再向混合懸浮液中加入體積用量為介質(zhì)體積量的0.02-1倍的烯丙基溴后，置于4-50 。C的恒溫水浴中活化3-36小時，之后用去離子水沖洗介質(zhì)至無游離烯丙基溴，制得含烯 丙基的色譜介質(zhì)。
2. 介質(zhì)的活化反應(yīng)
將烯丙基色譜介質(zhì)加入到二甲基亞砜和水的體積比為0. 1-4的混合溶液中，二甲基亞 砜和水的混合溶液的體積用量為烯丙基色譜介質(zhì)體積量的1-8倍，再向二甲基亞砜和水及 烯丙基色譜介質(zhì)的懸浮液中按每毫升烯丙基色譜介質(zhì)加入0. 05-2g N-溴代琥珀酰亞胺后， 將該懸浮液置于15-5(TC水浴中反應(yīng)0. 3-5小時，反應(yīng)后以去離子水沖洗介質(zhì)制得活化色 譜介質(zhì)；
3. 活化色譜介質(zhì)的配基偶聯(lián)
按每克活化色譜介質(zhì)用雙環(huán)化合物D為0. 05-2 mmol標(biāo)準(zhǔn)計，再將活化色譜介質(zhì)懸浮 于含有雙環(huán)化合物D的二甲基亞砜的反應(yīng)液中，反應(yīng)液的體積用量為活化色譜介質(zhì)體積量 的0.2-5倍，反應(yīng)液的pH值為9.0-13.0，再將該懸浮有活化色譜介質(zhì)的反應(yīng)液置于 25-60° C恒溫水浴中，經(jīng)3-36小時進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，偶聯(lián)反應(yīng)后的偶聯(lián)配基介質(zhì)以去離子 水、體積濃度25%乙醇-水溶液和0.5mol/L的氯化鈉溶液進(jìn)行交替沖洗，得到用于免疫 球蛋白類蛋白質(zhì)分離純化的色譜介質(zhì)。
上述的介質(zhì)烯丙基化過程，采用的二甲基亞砜的體積用量為介質(zhì)體積量的0.1-0.7 倍，氫氧化鈉溶液的濃度為1-5 mol/L，體積用量為介質(zhì)體積量的0.2-0.8倍，烯丙基溴 的體積用量為介質(zhì)體積量的0.05-0.5倍；上述的介質(zhì)活化反應(yīng)過程，采用的混合溶液中 二甲基亞砜和水的體積比為0.3_1.2，該混合溶液體積用量為烯丙基色譜介質(zhì)體積量的 3-6倍，混合溶液中N-溴代琥珀酰亞胺按每毫升烯丙基色譜介質(zhì)用量為0. l-lg比例加入； 上述的介質(zhì)偶聯(lián)配基過程，偶聯(lián)懸浮反應(yīng)液中雙環(huán)化合物D的用量按每克活化色譜介質(zhì)用 量為0.3-1.0 mmol加入，偶聯(lián)懸浮反應(yīng)液二甲基亞砜體積用量為活化色譜介質(zhì)體積量的 l-3倍；反應(yīng)液的pH值10. 0-13. 0，反應(yīng)時間為15-30小對。
本發(fā)明提供了的用于免疫球蛋白類蛋白質(zhì)分離純化的色譜介質(zhì)，該色譜介質(zhì)具有如下 顯著的特點:色譜介質(zhì)在離子強(qiáng)度從0.02mol/L到2mol/L的范圍內(nèi)對抗體均有較強(qiáng)的吸附， 表現(xiàn)出優(yōu)良的耐鹽吸附特性，顯示出該配基為非鹽依賴性配基；因此，原料液可無需預(yù)處 理，直接經(jīng)色譜分離而獲得目標(biāo)產(chǎn)物，簡化了操作步驟；作為主要雜蛋白的牛血清白蛋白 在色譜介質(zhì)上的吸附量隨著離子強(qiáng)度的增加顯著下降，采用高離子強(qiáng)度緩沖液可洗脫白蛋 白，提高目標(biāo)產(chǎn)物的純度；色譜介質(zhì)在特定離子強(qiáng)度下(如含有0.5 mol/LNaCl的20mmol/L 磷酸鹽緩沖液，pH8.0)選擇性地吸附免疫球蛋白的同時，避免了雜蛋白的共吸附和共洗脫， 從而獲得純度在90%以上的目標(biāo)產(chǎn)品；配基的解離常數(shù)pif。幾近中性，從而可根據(jù)目標(biāo)蛋
白和雜蛋白等電點的差異，選擇合適的洗脫pH，獲得高純度的產(chǎn)品；該制備方法過程簡 單，價格低廉。


圖1為以本發(fā)明實施例1所制備的瓊脂糖凝膠色譜介質(zhì)在20mmol/L磷酸鹽緩沖溶液 (pH 8.0)中不同氯化鈉濃度下抗體和牛血清白蛋白的動態(tài)吸附量比較圖。圖中深色柱代表 抗體的動態(tài)吸附量；淺色柱代表牛血清白蛋白的動態(tài)吸附量。
圖2為本發(fā)明實施例1所制備的瓊脂糖凝膠色譜介質(zhì)在含0.5 mol/L氯化鈉的20 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)中分離抗體與白蛋白混合溶液的色譜圖。圖中1為含50%乙二醇的 20mmol/L NaAc-HAc緩沖液(pH 5.0)的洗脫峰；2為20mmol/L NaAc-HAc緩沖液(pH 4.0) 的洗脫峰；3為0.1mol/LHCl的洗脫峰。
圖3為本發(fā)明實施例1所制備的瓊脂糖凝膠色譜介質(zhì)在含0.13 mol/L氯化鈉的20 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中分離抗體與白蛋白混合溶液的色譜圖。圖中1為含1.0mol/L NaCl的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH8.0)的洗脫峰；2為含50%乙二醇的20mmol/L NaAc-HAc緩沖液(pH 5.0)的洗脫峰；3為20mmol/LNaAc-HAc緩沖液(pH 4.0)的洗脫峰； 4為0.1mol/LHCl的洗脫峰。
圖4為本發(fā)明實施例1所制備的瓊脂糖凝膠色譜介質(zhì)從成牛血清中分離抗體的色譜 圖。其中l(wèi)為20mmol/L NaAc-HAc緩沖液(pH5.5)的洗脫峰；2為20mmol/L NaAc-HAc 緩沖液(pH5.0)的洗脫峰；3為20mmol/L NaAc-HAc緩沖液(pH4.5)的洗脫峰;4為20mmol/L NaAc-HAc緩沖液(pH4.0)的洗脫峰；5為0.1 mol/L鹽酸的洗脫峰。
具體實施例方式
下面的實例將對本發(fā)明的方法予以進(jìn)一步的說明。 實施例1
稱取1.0g經(jīng)砂濾漏斗沖洗抽干、平均粒徑為90 nm的瓊脂糖凝膠介質(zhì)Sepharose CL-6B 置于50mL錐形瓶中后，依次加入0.2mL 二甲基亞砜，0.5mL 4mol/L氫氧化鈉溶液和0.3mL 烯丙基溴；混合均勻后，凝膠懸浮液置于水浴搖床在25"C下反應(yīng)24小時，得到帶有烯丙 基的Sepharose CL-6B瓊脂糖凝膠介質(zhì)。烯丙基色譜介質(zhì)以去離子水沖洗除去游離的烯丙 基溴。烯丙基色譜介質(zhì)的烯丙基修飾密度為200 pmol/mL。
稱取1.0 g烯丙基色譜介質(zhì)置于4mL體積比為1:3的二甲基亞砜和水的混合溶液中； 然后，加入0.6gN-溴代琥珀酰亞胺，經(jīng)充分混勻并置于水浴搖床在25'C下反應(yīng)1小時； 反應(yīng)后的介質(zhì)經(jīng)去離子水沖洗和抽干處理后，置于1.2mL 二甲基亞砜溶液中，溶液中4(咪 唑-l-基)苯胺的含量為0.8 mmol;用2mol/L的氫氧化鈉將溶液pH調(diào)節(jié)至12，置于50°C
水浴搖床中反應(yīng)24小時。得到的瓊脂糖凝膠介質(zhì)用去離子水、體積濃度25%乙醇-水溶液 和0.5mol/L氯化鈉溶液交替沖洗干凈，即可得到用于免疫球蛋白類蛋白質(zhì)分離純化的色譜 介質(zhì)，色譜介質(zhì)中4 (咪唑-l-基)苯胺偶聯(lián)密度為90pmol/mL。 實施例2
稱取1.0g經(jīng)砂濾漏斗沖洗抽干、平均粒徑為90 nm的瓊脂糖凝膠介質(zhì)Sepharose CL-6B 置于50mL錐形瓶中后，依次加入0.2mL二甲基亞砜，0.5mL4mol/L氫氧化鈉溶液和0.3mL 烯丙基溴；混合均勻后，凝膠懸浮液置于水浴搖床在25r下反應(yīng)24小時，得到含烯丙基 的Sepharose CL-6B瓊脂糖凝膠介質(zhì)。烯丙基色譜介質(zhì)以去離子水沖洗除去游離的烯丙基 溴。烯丙基色譜介質(zhì)的烯丙基修飾密度為200 mol/mL。
稱取1.0g烯丙基色譜介質(zhì)置于4mL體積比為1:3的二甲基亞砜和水的混合溶液中； 然后，加入0.5gN-溴代琥珀酰亞胺，經(jīng)充分混勻并置于水浴搖床在25'C下反應(yīng)1小時； 反應(yīng)后的介質(zhì)經(jīng)去離子水沖洗和抽干處理后，置于1.2mL二甲基亞砜溶液中，溶液中3-(咪 唑-l-基)苯胺的含量為0.5 mmol;用2mol/L的氫氧化鈉將溶液pH調(diào)節(jié)至10，置于37°C 水浴搖床中反應(yīng)24小時。得到的瓊脂糖凝膠介質(zhì)用去離子水、體積濃度25%乙醇-水溶液 和0.5mol/L氯化鈉溶液交替沖洗干凈，即可得到用于免疫球蛋白類蛋白質(zhì)分離純化的色譜 介質(zhì)，色譜介質(zhì)中3-(咪唑-l-基)苯胺偶聯(lián)密度為32 u mol/mL。 實施例3
實施例l中N-溴代琥珀酰亞胺加入量1.2 g，溶液中4-(咪唑-l-基)苯胺的含量提高 到1.6 mmol;其他條件不變的情況下,可得到用于免疫球蛋白類蛋白質(zhì)分離純化的色譜介 質(zhì)中4-咪唑-l-基)苯胺偶聯(lián)密度為123umol/mL。 實施例4
實施例2中N-溴代琥珀酰亞胺加入量1.8g，溶液中3-(咪唑-l-基)苯胺的含量提高到 1.5 mmol;其他條件不變的情況下,可得到用于免疫球蛋白類蛋白質(zhì)分離純化的色譜介質(zhì)中 3-(咪唑-l-基)苯胺偶聯(lián)密度為73 P mol/mL。 實施例5
取1.0 mL實施例1制備的色譜介質(zhì)裝填于TricornTM5/50色譜柱中，分別用含有不同 濃度氯化鈉(0、 0.2、 0.5、 lmol/L)的20mmol/L磷酸緩沖液(pH8.0)平衡后，以迎頭分 析模式上樣考察免疫球蛋白和牛血清白蛋白的動態(tài)吸附量(在10%穿透點下計算的動態(tài) 吸附量)。結(jié)果顯示，免疫球蛋白的動態(tài)吸附量介于36-55mg/mL柱體積(如圖1所示)； 而牛血清白蛋白的動態(tài)吸附量分別為53.4、 27.2、 7.4、 3.8mg/mL柱體積，隨離子強(qiáng)度的 增加吸附量顯著下降。 實施例6
配制免疫球蛋白濃度為1 mg/mL、牛血清白蛋白濃度為4 mg/mL的蛋白質(zhì)混合溶液
10mL。色譜柱經(jīng)含0.5 mol/L氯化鈉的20 mmol/L磷酸緩沖液(pH8.0)平衡后，以迎頭 分析模式進(jìn)樣直至穿透；色譜柱依次用平衡緩沖液和含50%乙二醇20mmol/L的 NaAc-HAc緩沖液(pH5.0)洗脫，免疫球蛋白收率為80%,經(jīng)聚丙烯酰胺電泳分析，該產(chǎn)品 的純度為98% (如圖2所示)。 實施例7
分別稱取10 mg免疫球蛋白和40 mg牛血清白蛋白溶于10 mL含0.13mol/L氯化鈉的 磷酸緩沖液(pH7.4)中；色譜柱用經(jīng)含0.13mol/L氯化鈉的磷酸緩沖液(pH7.4)平衡后， 連續(xù)進(jìn)樣直至穿透；然后，依次采用樣品緩沖液和含lmol/L氯化鈉的磷酸緩沖液(pH7.4) 沖洗色譜柱，洗脫吸附于色譜柱上的白蛋白；最后，經(jīng)含50%乙二醇的20mmol/L的 NaAc-HAc緩沖液(pH5.0)洗脫，免疫球蛋白收率為70%,經(jīng)聚丙烯酰胺電泳分析，該產(chǎn)品 的純度為95% (如圖3所示)。 實施例8
原料液為標(biāo)準(zhǔn)成牛血清，其中免疫球蛋白含量約為2.15% (電泳分析)。用含有氯化 鈉的磷酸緩沖液分別調(diào)節(jié)成牛血清的離子強(qiáng)度至40-50mS/cm和溶液的pH值至8.0;用0.22 ^m的濾膜過濾后，取20mL此原料液進(jìn)樣，流出液中的主要成分是白蛋白和一些雜蛋白， 這說明所發(fā)明的色譜介質(zhì)能夠選擇性吸附免疫球蛋白G;在pH4.5條件下洗脫，經(jīng)聚丙烯 酰胺電泳分析，該產(chǎn)品的純度為80%，沒有檢測到白蛋白被洗脫，表明所發(fā)明的色譜介質(zhì): 能夠有效地排斥白蛋白的共吸附。
權(quán)利要求
1.一種用于免疫球蛋白類蛋白質(zhì)分離純化的色譜介質(zhì)，其特征在于，該色譜介質(zhì)是在平均粒徑為30-300μm的瓊脂糖凝膠顆粒的介質(zhì)表面偶聯(lián)烯丙基的間隔臂，在間隔臂的末端偶聯(lián)咪唑和苯的雙環(huán)化合物D為介質(zhì)的配基，色譜介質(zhì)的結(jié)構(gòu)表達(dá)形式如下id="icf0001" file="S2007100595765C00011.gif" wi="45" he="33" top="5" left = "5" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>其中，咪唑和苯的雙環(huán)化合物D結(jié)構(gòu)式如I式所示id="icf0002" file="S2007100595765C00012.gif" wi="48" he="34" top="5" left = "5" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>其中R3、R4、R5、R6、R7中的一個基團(tuán)必為氨基或甲基氨，其余的基團(tuán)及R1、R2為氫原子和含有1-4個碳原子的短鏈烷烴一種。
2. 按權(quán)利要求l所述的用于免疫球蛋白類蛋白質(zhì)分離純化的色譜介質(zhì)，其特征在于， 咪唑和苯的雙環(huán)化合物D選自2-(咪唑-l-基)苯胺、4-(咪唑-1-基)苯胺、3-(咪唑-1-基) 苯胺、4-咪唑-1-基-2-甲基-苯胺、4-咪唑-1-基-苯甲胺、2-咪唑-1-基-苯甲胺和3-甲基 -4-(咪唑-1-基)苯胺。
3. —種制備權(quán)利要求1所述的用于免疫球蛋白類蛋白質(zhì)分離純化的色譜介質(zhì)的方法， 其特征在于包括以下過程1).介質(zhì)的烯丙基化反應(yīng)將平均粒徑為30-300 pm的瓊脂糖凝膠顆粒的介質(zhì)，加入二甲基亞砜中形成介質(zhì)的懸 浮液，二甲基亞砜的體積用量為介質(zhì)體積量的0.05-2倍，繼而向介質(zhì)懸浮液中加入體積用 量為介質(zhì)體積量的0.05-1倍、濃度為0.5-6 mol/L氫氧化鈉溶液，混合均勻，制得混合懸 浮液，再向混合懸浮液中加入體積用量為介質(zhì)體積量的0.02-1倍的烯丙基溴后，置于4-50 。C的恒溫水浴中活化3-36小時，之后用去離子水沖洗介質(zhì)至無游離烯丙基溴，制得含烯丙基的色譜介質(zhì)；2) .介質(zhì)的活化反應(yīng)將烯丙基色譜介質(zhì)加入到二甲基亞砜和水的體積比為0. 1-4的混合溶液中，二甲基亞 砜和水的混合溶液的體積用量為烯丙基色譜介質(zhì)體積量的1-8倍，再向二甲基亞砜和水及 烯丙基色譜介質(zhì)的懸浮液中按每毫升烯丙基色譜介質(zhì)加入0. 05-2g N-溴代琥珀酰亞胺后， 將該懸浮液置于15-50"C水浴中反應(yīng)0. 3-5小時，反應(yīng)后以去離子水沖洗介質(zhì)制得活化色 譜介質(zhì)；3) .活化介質(zhì)的配基偶聯(lián)按每克活化色譜介質(zhì)用雙環(huán)化合物D為0. 05-2 mmol標(biāo)準(zhǔn)計，再將活化色譜介質(zhì)懸浮 于含有雙環(huán)化合物D的二甲基亞砜的反應(yīng)液中，反應(yīng)液的體積用量為活化色譜介質(zhì)體積量 的0.2-5倍，反應(yīng)液的pH值為9.0-13.0，再將該懸浮有活化色譜介質(zhì)的反應(yīng)液置于 25-60° C恒溫水浴中，經(jīng)3-36小時進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，偶聯(lián)反應(yīng)后的偶聯(lián)配基介質(zhì)以去離子 水、體積濃度25%乙醇-水溶液和0.5mol/L的氯化鈉溶液進(jìn)行交替沖洗，得到用于免疫 球蛋白類蛋白質(zhì)分離純化的色譜介質(zhì)。
4.按權(quán)利要求3所述的用于免疫球蛋白類蛋白質(zhì)分離純化的色譜介質(zhì)的制備方法， 其特征在于，介質(zhì)烯丙基化過程，采用的二甲基亞砜的體積用量為介質(zhì)體積量的0.1-0.7 倍，氫氧化鈉溶液的濃度為1-5 mol/L，體積用量為介質(zhì)體積量的0.2-0.8倍，烯丙基溴 的體積用量為介質(zhì)體積量的0.05-0.5倍；上述的介質(zhì)活化反應(yīng)過程，采用的混合溶液中 二甲基亞砜和水的體積比為0.3_1.2，該混合溶液體積用量為烯丙基色譜介質(zhì)體積量的 3-6倍，混合溶液中N-溴代琥珀酰亞胺按每毫升烯丙基色譜介質(zhì)用量為0. 1-lg比例加入; 上述的介質(zhì)偶聯(lián)配基過程，偶聯(lián)懸浮反應(yīng)液中雙環(huán)化合物D的用量按每克活化色譜介質(zhì)用 量為0.3-1.0 mmol加入，偶聯(lián)懸浮反應(yīng)液二甲基亞砜體積用量為活化色譜介質(zhì)體積量的 1-3倍；反應(yīng)液的pH值10. 0-13. 0，反應(yīng)時間為15-30小時。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于免疫球蛋白類蛋白質(zhì)分離純化的色譜及其制備方法，屬于用于分離純化免疫球蛋白的色譜介質(zhì)的制備技術(shù)。該色譜介質(zhì)為間隔臂末端偶聯(lián)含有咪唑基團(tuán)和苯環(huán)的雙環(huán)化合物分子作為色譜介質(zhì)配基。其制備方法為采用烯丙基色譜介質(zhì)與N-溴代琥珀酰亞胺的溴化醇化反應(yīng)獲得活化色譜介質(zhì)，該活化介質(zhì)在二甲基亞砜溶液中與雙環(huán)化合物中的氨基反應(yīng)完成配基的偶聯(lián)。該色譜介質(zhì)在離子強(qiáng)度0.02-2.0mol/L的范圍內(nèi)對抗體均有較高的動態(tài)吸附量，直接用于料液中抗體的回收；同時介質(zhì)具有更溫和的洗脫條件；可用于從血清、腹水、細(xì)胞培養(yǎng)上清液或其它含有抗體的料液中純化抗體。該色譜介質(zhì)在抗體制備過程中具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號B01J20/281GK101185881SQ20071005957
公開日2008年5月28日 申請日期2007年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月12日
發(fā)明者史清洪, 彥 孫, 姝 白, 征 程, 董曉燕 申請人:天津大學(xué)