專利名稱：一種能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行非色譜分離的融合標(biāo)簽蛋白及其編碼基因和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行非色譜分離的融合標(biāo)簽蛋白及其編碼基因和 制備方法。
背景技術(shù)：
近年來，生物技術(shù)尤其是基因工程的迅猛發(fā)展，表達(dá)蛋白已變得較容易。相對(duì)而 言，純化卻是一個(gè)非常繁雜的工作。蛋白質(zhì)分子大規(guī)模分離純化是當(dāng)前生物工程中的關(guān)鍵 技術(shù)問題，純化過程所需成本約占總成本的60% -70%。興起于20世紀(jì)末的融合標(biāo)簽技 術(shù)促進(jìn)了重組蛋白純化技術(shù)的發(fā)展，其主要過程是利用重組DNA技術(shù)在靶蛋白編碼基因的 3'端或5'端融合某種標(biāo)簽的編碼基因，通過宿主表達(dá)重組蛋白質(zhì)，該重組蛋白可通過其 融合的標(biāo)簽與包被在固相基質(zhì)上的特異配基結(jié)合而得以純化。此方法已成為后基因組學(xué)時(shí) 代純化重組蛋白常用手段。它無需了解蛋白質(zhì)的生化特性或生理活性，就可通過帶標(biāo)簽的 重組融合蛋白選擇性地與層析基質(zhì)上的配體結(jié)合，從而得以純化蛋白。采用保護(hù)蛋白質(zhì)結(jié) 構(gòu)和功能完整性的溫和條件，已成功地通過一步親和層析從粗提物中純化出了多種重組蛋 白，純度達(dá)90%以上。其中最為典型的代表就是聚組氨酸(以鎳離子為配基)，此法具有快 速、高分辨率等諸多優(yōu)點(diǎn)。融合表達(dá)在最初的檢測(cè)和純化時(shí)會(huì)很方便，但若對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行生化及功能分 析，需要避免親和標(biāo)簽所帶來的潛在干擾，通常必需去掉外源融合標(biāo)簽，尤其是具有治療和 診斷用途的蛋白，往往必需去掉所有外源氨基酸。已建立了數(shù)種對(duì)融合蛋白進(jìn)行位點(diǎn)特異 性裂解的方法。早期的化學(xué)裂解法雖便宜、有效，但由于裂解位點(diǎn)特異性低和可能對(duì)目標(biāo)蛋 白產(chǎn)生不必要修飾，已被酶解法逐步取代。酶解法條件較溫和，且普遍用于此用途的蛋白 酶都具有高度特異性，它們均具有較長的底物識(shí)別序列，降低了蛋白質(zhì)中其它無關(guān)部位發(fā) 生斷裂的可能性。但酶解法成本高(這些酶價(jià)格一般都相當(dāng)昂貴)、反應(yīng)時(shí)間長(10多個(gè)小 時(shí))、更重要的是這些酶蛋白不可避免地混入目標(biāo)蛋白中，造成新的污染，需在裂解后附加 層析分離除去，使純化工藝復(fù)雜化。此外，與融合標(biāo)簽結(jié)合的特異配基價(jià)格昂貴也限制了在 大規(guī)模分離純化中的應(yīng)用。因此，發(fā)展簡單易行、廉價(jià)、可靠的蛋白質(zhì)純化方法對(duì)于大規(guī)模 生產(chǎn)重組蛋白及高通量蛋白質(zhì)組學(xué)研究具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供了一種能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行非色譜分離 的融合標(biāo)簽蛋白及其編碼基因和制備方法。本發(fā)明制備的融合標(biāo)簽蛋白能快速與目標(biāo)蛋白 融合，經(jīng)過條件的控制，可采用離心或過濾的方法分離重組蛋白，效果顯著；蛋白表達(dá)條件 簡單，易于操作，生產(chǎn)成本低廉，因而適宜進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。為達(dá)到上述的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行非色譜分離的融合標(biāo)簽蛋白，它具有序列表1所示的氨基酸序列或其融合蛋白、或其功能性片段、或其功能性片段衍生物中的一種。(中國微生物菌 種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物 研究所，保藏號(hào)CGMCCN0. 4185，大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏日期:2010年9月 17 日。)—種能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行非色譜分離的融合標(biāo)簽蛋白的編碼基因，它具有序列表 2所示的核苷酸序列。(中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，北京市朝陽 區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)CGMCC NO. 4185，大腸埃希氏菌 (Escherichia coli)，保藏日期2010 年 9 月 17 曰。)一種能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行非色譜分離的融合標(biāo)簽蛋白的制備方法，采用序列表2所 示核苷酸序列的編碼基因融合表達(dá)之后經(jīng)高速離心進(jìn)行分離制備該融合標(biāo)簽蛋白。所述的序列表2所示的編碼基因插入到經(jīng)人工改造后的表達(dá)載體pET_22b (購于 上海捷瑞生物工程有限公司)，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE!3)或者BLR菌株中，用熱擊法轉(zhuǎn)化 到大腸桿菌BL21(DE!3)或者大腸桿菌BLR菌株中(二者均為商業(yè)化菌株，可直接從上海 超研生物科技有限公司、上海博亞生物科技有限公司購買)。BL2KDE3)基因型F_omp T hsdSB (rB_mB_) dcm gal (DE3) pLysS Cam r，特點(diǎn)該菌株帶有質(zhì)粒pLysS，具有氯霉素抗性。 大腸桿菌BLR菌株為BL21 (DE3)的衍生株，它是recA-，RecA是大腸桿菌中介導(dǎo)同源重組的 重要蛋白之一。它的缺失，可以保證質(zhì)粒的穩(wěn)定。質(zhì)粒中含有表達(dá)T7溶菌酶的基因，T7溶 菌酶能降低目的基因的背景表達(dá)水平，但不干擾IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)。經(jīng)過質(zhì)粒酶切分析、PCR鑒定，篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)異丙基-β -D-硫 代半乳糖苷(IPTG)(購于Sigma公司)誘導(dǎo)使編碼基因獲得融合高效表達(dá)，細(xì)胞破碎后，利 用高速離心對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化。所述的表達(dá)載體pET-22b的人工改造包括如下步驟1)人工合成序列表 3的基因片段(委托上海捷瑞生物工程有限公司合成，該序列來源于文獻(xiàn)Improved non-chromatographic purification of a recombinant protein by cationic elastin-like polypeptides, Biomacromolecules. 20078(5) 1417-1424.作者Dong Woo Lim, Kimberly Trabbic-Carlson, J. Andrew MacKay, and Ashutosh Chilkoti) ；2)用上述 基因片段替換初始pET-22b(+)中NdeI與EcoRI酶切位點(diǎn)之間的序列。所述的高效表達(dá)為低溫誘導(dǎo)表達(dá)，包括如下步驟1)將甘油菌(購于上海捷瑞生 物工程有限公司)按1 100的體積比接入到含氨芐青霉素(Amp) (100mg/L)的LB液體中 培養(yǎng)(OD6tltl值為0. 6-1. 0，時(shí)間為10-12h)，4°C保存，離心收集細(xì)胞；2)將細(xì)胞重懸浮于2ml 的含氨芐青霉素(Amp) (100mg/L) 2ml的Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB)液體中，再培養(yǎng)(OD6tltl 值為0.6-1. 0，時(shí)間為10-12小時(shí))，以此接種；按1 100的接種量接種于TB培養(yǎng)基中，置 于37°C搖床，以200r/min的速度，培養(yǎng)4_5小時(shí)；加入IPTG誘導(dǎo)劑(終濃度為ImM)誘導(dǎo)7 小時(shí)；之后，4°C下以4000r/min的速度，離心15分鐘，按照IL菌液40mlPBS緩沖液(須預(yù) 先冰浴冷卻)重懸菌體。所述的細(xì)胞破碎采用超聲波法，包括如下步驟1)取出加入IPTG誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)7 小時(shí)后的錐形瓶，冰浴，使細(xì)胞停止生長，將菌液分裝于100ml離心管中，使處于對(duì)稱位置 的離心管質(zhì)量相等(配平)，離心，離心條件轉(zhuǎn)速4000r/min，時(shí)間15min ；2)離心機(jī)停止后， 取離心管，棄上清，按1 25 (PBS緩沖溶液菌液)的比例加入PBS緩沖溶液洗滌菌體，在旋渦混合器上充分振蕩，直至將離心管底的菌體沖洗干凈，收集；幻用超聲波破碎機(jī)進(jìn)行 細(xì)胞破碎，條件為超^，停2s，80個(gè)循環(huán)，之后收集細(xì)胞破碎液。所述的純化采用高速離心法純化蛋白，包括如下步驟1)加入聚乙烯亞胺(終濃 度為0. 5% W/V)，振蕩，使其充分混勻，去除核酸；2)將蛋白質(zhì)溶液分裝于IOml的離心管， 冰浴15min，離心，其條件為4°C，14000r/min，離心時(shí)間15min ；3)取出離心管，將上清液移 到干凈的離心管，棄沉淀，按體積比1 2 (NaCl溶液上清液)加入NaCl溶液，45°C恒溫 水浴15min，離心，離心條件為38°C，13500r/min,時(shí)間為5min ；4)取出離心管，迅速棄上清， 每管加anlPBS緩沖溶液，沿管壁緩慢滴加，使壁上的蛋白質(zhì)充分溶解，冰浴15min后離心， 離心條件為4°C，14000r/min，時(shí)間為5min ；5)重復(fù)步驟3)和4) 一次。最終棄沉淀，收集 上清，保存在-20°C冰箱中；6)透析后冷凍干燥。所述的TB培養(yǎng)基(體積為900ml)配方為蛋白胨(Tryptone) 12g，酵母粉Mg(購 于OXOID公司)，丙三醇(Glycerol) 8ml ；將TB培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌，與經(jīng)高壓蒸汽滅菌 后的磷酸鹽緩沖液按9 1的比例混合后使用；其中所述的磷酸鹽緩沖液(體積為100ml) 配方為磷酸氫二鉀(K2HPO4) 12. Mg，磷酸二氫鉀(KH2PO4) 2. 31g。所述的PBS 緩沖溶(1000ml)液配方為=NaCl 8g、KCl 0. 2g,NaH2PO4O. 66g，溶解在 二次水中，調(diào)節(jié)pH為7. 3。本發(fā)明的有益效果是類彈性蛋白多肽(Elastin-Like Polyp印tide，ELP)是一 種生物高分子，由于其特殊的性質(zhì)，成為構(gòu)建“非色譜法”分離純化蛋白的寵兒。它包含有 一個(gè)重復(fù)的序列(VPGXG)，其中X代表除脯氨酸以外的任何一個(gè)氨基酸。在室溫下，ELP在 水溶液當(dāng)中有很高的溶解度，而當(dāng)溫度升至30-40°C之間時(shí)便從溶液中析出。某一特定ELP 精確的相變溫度(Tt)與多種因素有關(guān)多肽鏈長度、濃度，殘基X的類型和多少、溶液中鹽 濃度以及與其相連目標(biāo)蛋白的性質(zhì)等，這為精確控制Tt提供了可能。每純化Ikg蛋白質(zhì) 所需原材料的費(fèi)用分別為利用His尾巴親和層析$838124. 73，使用IMPACT-CN純化系統(tǒng) $989606. 23，而采用ELP體系僅$74509. 75，不到前兩者的10%。采用ELP進(jìn)行非色譜純化 操作簡易、成本低廉，給重組蛋白的分離純化技術(shù)帶來革命性的變化。本發(fā)明的融合標(biāo)簽蛋 白及其基因的用途為本發(fā)明制備的融合標(biāo)簽蛋白中的ELP能快速與目標(biāo)蛋白融合，融合 后能通過高速離心的方法快速、簡便的將目標(biāo)蛋白純化，同時(shí)可濃縮蛋白溶液，避免了色譜 分離的繁瑣操作及對(duì)蛋白樣品的稀釋。且具有以下特點(diǎn)1)能簡單、快速與目標(biāo)蛋白基因 鏈接，實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)；2)對(duì)目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)和正常功能無明顯影響，安全性高；3)蛋白表達(dá)條 件簡單，純化方便，生產(chǎn)成本低廉，因而適宜進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明為重組蛋白的分離提 供了一條新途徑，在生物分離領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1是本發(fā)明最后獲得的融合標(biāo)簽蛋白中的ELP對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行分離，使目標(biāo)蛋 白能發(fā)生明顯的相變現(xiàn)象圖；圖2是本發(fā)明產(chǎn)品經(jīng)高速離心后ITC純化前后對(duì)照?qǐng)D；圖3是本發(fā)明產(chǎn)品經(jīng)高速離心后ITC純化后電泳圖。
具體實(shí)施例方式
下面通過具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。實(shí)施例1一種能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行非色譜分離的融合標(biāo)簽蛋白，其特征在于它具有序列表 1所示的氨基酸序列或其融合蛋白、或其功能性片段、或其功能性片段衍生物中的一種。 本實(shí)施例的一種能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行非色譜分離的融合標(biāo)簽蛋白(KV8F)的制備方法采用 序列表2所示序列的編碼基因插入到經(jīng)改造后高效表達(dá)載體pET-22b。改造的方法為利 用序列表 3 的基因片段 CAT ATG AGC AAA GGG CCG GGC TGG CCG TGA TAA GAA TTC 替換 pET-22b (+)中自Nde I至EcoR I基因片段。使用pf IMI與Bgl I進(jìn)行限制性酶切，電泳分離 后回收ELP[KV8F-20]基因片斷，再將此基因?qū)氲接肧fiI酶切修飾后的pET-22b(+)表達(dá) 載體中，構(gòu)建pET-22b (+) -ELPs表達(dá)載體，經(jīng)測(cè)序，表達(dá)載體構(gòu)建正確。將pET-22b (+) -ELPs 導(dǎo)入到大腸桿菌BL21 (DE3)(購于上海超研生物科技有限公司)或者BLR菌株(購于上海 博亞生物科技有限公司)宿主菌中，構(gòu)建工程菌。陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)異丙基-D-硫代半乳 糖苷(IPTG)誘導(dǎo)使編碼基因獲得低溫誘導(dǎo)高效表達(dá)，其中高效表達(dá)步驟為1)將甘油菌 按1 100的體積比接入到含氨芐青霉素(Amp) (100mg/L)的LB液體中培養(yǎng)(0D·值為 0.6-1.0，，時(shí)間為10-12h)，4°C保存，離心收集細(xì)胞。2)將細(xì)胞重懸浮于2ml的含氨芐青霉 素(Amp) (100mg/L) 2ml的LB液體中(以去除β -內(nèi)酰胺酶)，再培養(yǎng)(OD6tltl值為0. 6-1. 0，， 時(shí)間為10-12小時(shí))，以此接種。按1 100的接種量接種于TB培養(yǎng)基中，置于37°C搖床， 以200r/min的速度，培養(yǎng)4_5小時(shí)。加入IPTG(終濃度為ImM)誘導(dǎo)7小時(shí)。之后，4°C下 以4000r/min的速度，離心15分鐘，按照IL菌液40mlPBS緩沖液重懸菌體。所用的PBS緩 沖液須預(yù)先冰浴冷卻。高效表達(dá)后，經(jīng)過超聲波法破碎細(xì)胞，其步驟為1)取出加入誘導(dǎo)劑IPTG誘 導(dǎo)7小時(shí)后的錐形瓶，冰浴，使細(xì)胞停止生長，將菌液分裝于IOOml離心管中，配平，離 心，離心條件轉(zhuǎn)速4000r/min，時(shí)間15min，2)離心機(jī)停止后，取出離心管，倒出上清液，按 1 25 (PBS緩沖溶液菌液)的比例加入PBS緩沖溶液洗滌菌體，在旋渦混合器上充分振 蕩，直至將離心管底的菌體沖洗干凈，收集，幻用超聲波破碎機(jī)進(jìn)行細(xì)胞破碎，設(shè)定條件為 超k，停2s，80個(gè)循環(huán)，然后收集細(xì)胞破碎液。然后利用高速離心法對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化；其步驟為1)細(xì)胞破碎液中加入聚 乙烯亞胺(終濃度為0.5% W/V)，振蕩，使其充分混勻，去除核酸；2)將蛋白質(zhì)溶液分裝于 IOml的離心管，冰浴15min，離心，其條件為4°C，14000r/min，離心時(shí)間15min ；3)取出離心 管，將上清液移到干凈的離心管，棄沉淀，按體積比1 2 (NaCl溶液上清液)加入NaCl溶 液，45°C恒溫水浴15min，離心，條件為38°C，13500r/min，時(shí)間為5min ；4)取出離心管，迅速 棄上清，每管加anlPBS緩沖溶液，沿管壁緩慢滴加，使壁上的蛋白質(zhì)充分溶解，冰浴15min 后離心，離心條件為4°C,14000r/min,時(shí)間為5min ；5)重復(fù)步驟3)和4) 一次。最終棄沉 淀，收集上清，保存在-20°C冰箱中；6)透析后冷凍干燥即為本發(fā)明的能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行非 色譜分離的融合標(biāo)簽蛋白。本實(shí)施例采用的TB培養(yǎng)基，每900ml體積的TB培養(yǎng)基配方為蛋白胨12g，酵母 粉Mg，丙三醇8ml ；將TB培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌，與經(jīng)高壓蒸汽滅菌后的磷酸鹽緩沖液按 9 1的比例混合后使用；其中所述的磷酸鹽緩沖液，每IOOml體積的磷酸鹽緩沖液，其配方為磷酸氫二鉀12. Mg，磷酸二氫鉀2. 31g。所述的PBS緩沖溶液，每IOOOml體積的PBS 緩沖溶液配方為=NaCl 8g、KCl 0. 2g、NaH2PO4O. 66g，溶解在二次水中，調(diào)節(jié)pH為7. 3。最后獲得的融合標(biāo)簽蛋白中的ELP對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行分離，使目標(biāo)蛋白能發(fā)生明顯 的相變現(xiàn)象，如圖1所示。產(chǎn)品經(jīng)高速離心后的純度鑒定見圖2及圖3所示。其純度可達(dá)99%。圖2是ITC 純化前后對(duì)照，1-經(jīng)2次ITC循環(huán)，2-經(jīng)1次ITC循環(huán)，3-未經(jīng)純化前。圖3是ITC純化后 電泳圖；1-稀釋10倍后加樣，2-稀釋5倍后加樣，4-原液加樣。由于本產(chǎn)品能發(fā)生相變現(xiàn)象，同時(shí)它對(duì)要分離的其它目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)無明顯影 響。因此，將其編碼基因與需要分離的目標(biāo)蛋白進(jìn)行融合后，表達(dá)出的融合蛋白，可通過本 產(chǎn)品含有的ELP能發(fā)生獨(dú)特的相變現(xiàn)象，經(jīng)高速離心分離，由于目標(biāo)蛋白和本產(chǎn)品ELP直接 相連。因此，也同時(shí)隨本產(chǎn)品ELP—起被分離出來，從而達(dá)到對(duì)目標(biāo)蛋白的快速、簡單的分 離，而且該方法不需要借助目前常用的色譜法。
權(quán)利要求
1.一種能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行非色譜分離的融合標(biāo)簽蛋白，其特征在于它具有序列表1 所示的氨基酸序列或其融合蛋白、或其功能性片段、或其功能性片段衍生物中的一種；該氨 基酸序列由中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)CGMCC NO. 4185， 保藏日期2010年9月17日。
2.一種能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行非色譜分離的融合標(biāo)簽蛋白的編碼基因，其特征在于它具 有序列表2所示的核苷酸序列；該核苷酸序列由中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生 物中心保藏，保藏號(hào)CGMCC NO. 4185，保藏日期2010年9月17日。
3.一種能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行非色譜分離的融合標(biāo)簽蛋白的制備方法，其特征在于采用 序列表2所示核苷酸序列的編碼基因融合表達(dá)之后經(jīng)高速離心進(jìn)行分離制備該融合標(biāo)簽 蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行非色譜分離的融合標(biāo)簽蛋白的制 備方法，其特征在于所述的序列表2所示的編碼基因插入到經(jīng)人工改造后的表達(dá)載體 pET-22b，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE!3)或者BLR菌株中，經(jīng)過質(zhì)粒酶切分析、PCR鑒定，篩選 出陽性轉(zhuǎn)化子，陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)異丙基-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)使編碼基因獲得融合高效 表達(dá)，細(xì)胞破碎后，利用高速離心對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行非色譜分離的融合標(biāo)簽蛋白的制備 方法，其特征在于所述的表達(dá)載體pET-22b的人工改造包括如下步驟1)人工合成序列表 3的基因片段；2)用上述基因片段替換初始pET-22b(+)中NdeI與EcoRI酶切位點(diǎn)之間的 序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行非色譜分離的融合標(biāo)簽蛋白的制備 方法，其特征在于所述的高效表達(dá)為低溫誘導(dǎo)表達(dá)，包括如下步驟1)將甘油菌按1 100 的體積比接入到含100mg/L氨芐青霉素的Luria-Bertani培養(yǎng)基液體中培養(yǎng)，4°C保存，離 心收集細(xì)胞；2)將細(xì)胞重懸浮于2ml含100mg/L氨芐青霉素2ml的LB液體中，再培養(yǎng)，以 此接種；按1 100的接種量接種于TB培養(yǎng)基中，置于37°C搖床，以200r/min的速度，培 養(yǎng)4-5小時(shí)；加入終濃度為ImM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)7小時(shí)；之后，4°C 下以4000r/min的速度，離心15分鐘，按照IL菌液40mlPBS緩沖液重懸菌體。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行非色譜分離的融合標(biāo)簽蛋白的 制備方法，其特征在于所述的細(xì)胞破碎采用超聲波法，包括如下步驟1)取出加入異丙 基- β -D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)7小時(shí)后的錐形瓶，冰浴，使細(xì)胞停止生長，將菌液分 裝于100ml離心管中，使處于對(duì)稱位置的離心管質(zhì)量相等，離心，離心條件轉(zhuǎn)速PBS緩沖溶 液菌液4000r/min，時(shí)間15min ；2)離心機(jī)停止后，取離心管，棄上清，按PBS緩沖溶液 菌液=1 25的體積比加入PBS緩沖溶液洗滌菌體，在旋渦混合器上充分振蕩，直至將離 心管底的菌體沖洗干凈，收集；幻用超聲波破碎機(jī)進(jìn)行細(xì)胞破碎，條件為超^，停2s，80個(gè) 循環(huán)，之后收集細(xì)胞破碎液。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行非色譜分離的融合標(biāo)簽蛋白的制備 方法，其特征在于所述的純化采用高速離心法純化蛋白，包括如下步驟1)加入終濃度為 0. 5% W/V聚乙烯亞胺，振蕩，使其充分混勻，去除核酸；2)將蛋白質(zhì)溶液分裝于IOml的離 心管，冰浴15min，離心，其條件為4°C，14000r/min，離心時(shí)間15min ；3)取出離心管，將上清 液移到干凈的離心管，棄沉淀，按NaCl溶液上清液=1 2的體積比加入NaCl溶液，45°C恒溫水浴15min，離心，離心條件為38°C，13500r/min，時(shí)間為5min ；4)取出離心管，迅速棄 上清，每管加anlPBS緩沖溶液，沿管壁緩慢滴加，使壁上的蛋白質(zhì)充分溶解，冰浴15min后 離心，離心條件為4°C,14000r/min,時(shí)間為5min ；5)重復(fù)步驟3)和4) 一次。最終棄沉淀， 收集上清，保存在-20°C冰箱中；6)透析后冷凍干燥。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行非色譜分離的融合標(biāo)簽蛋白的制備 方法，其特征在于所述的TB培養(yǎng)基，每900ml體積的TB培養(yǎng)基配方為蛋白胨12g，酵母 粉24g，丙三醇8ml ；將TB培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌，與經(jīng)高壓蒸汽滅菌后的磷酸鹽緩沖液按 9 1的比例混合后使用；其中所述的磷酸鹽緩沖液，每IOOml體積的磷酸鹽緩沖液，其配 方為磷酸氫二鉀12. Mg，磷酸二氫鉀2. 31g。
10.根據(jù)權(quán)利要求6或7或8所述的一種能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行非色譜分離的融合標(biāo)簽蛋 白的制備方法，其特征在于所述的PBS緩沖溶液，每IOOOml體積的PBS緩沖溶液配方為 NaCl 8g、KCl 0. 2g、NaH2PO4O. 66g，溶解在二次水中，調(diào)節(jié) pH 為 7. 3。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行非色譜分離的融合標(biāo)簽蛋白，它具有序列表1所示的氨基酸序列或其融合蛋白、或其功能性片段、或其功能性片段衍生物中的一種；以及此種融合標(biāo)簽蛋白的編碼基因和融合標(biāo)簽蛋白的制備方法。本發(fā)明制備的融合標(biāo)簽?zāi)芎唵?、快速與目標(biāo)蛋白基因鏈接，實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)；對(duì)目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)和正常功能無明顯影響，安全性高；蛋白表達(dá)條件簡單，純化方便，生產(chǎn)成本低廉，因而適宜進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07K19/00GK102127156SQ201010562100
公開日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2010年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月16日
發(fā)明者張光亞, 李夏蘭, 林毅, 陳國 , 黃凱宗 申請(qǐng)人:華僑大學(xué)