專利名稱：一種c-di-GMP的分離純化方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種環(huán)鳥苷二磷酸(Cyclic diguanylate，c-di-GMP)的分離純化方法，具體地說，是涉及用配有離子交換色譜柱的快速蛋白液相色譜(Fast protein liquid chromatography, FPLC)分離純化 c-di-GMP 的方法。
背景技術(shù)：
環(huán)鳥苷二磷酸(Cyclic diguanylate，c-di-GMP)是一種具有細菌特異性的新型第二信使，它廣泛存在于各種真細菌中，但不存在于真核生物中。c-di-GMP參與調(diào)控細菌的多種生理過程，包括生物膜的形成、運動性的調(diào)節(jié)、毒力因子的表達等。生物膜作為自然界中細菌主要的生存方式，給人類的生產(chǎn)生活帶來了嚴重危害。除了危害環(huán)境和工業(yè)生產(chǎn)以外，根據(jù)NIH的調(diào)查報告，80%以上的細菌性感染與生物膜有關(guān)，生物膜可以使細菌大幅度提高對抗生素的耐受性并抵抗機體的免疫防御，從而導致嚴重的臨床耐藥問題。c-di-GMP在相關(guān)科研工作中有重要用途，但市場價格昂貴使其使用受限，2009年 12月份價格調(diào)整為原價十分之一后，1 μ mol (0. 7mg)仍需150歐元(Biolog Life Science Institute)。它可以用多種方法來制備，例如組織提取法、化學合成法或者酶促合成法，影響質(zhì)量和成本的主要因素是其分離純化?，F(xiàn)有技術(shù)通常采用反相高效液相色譜(High performance Liquid Chromatography, HPLC)來分離純化c-di-GMP。以酶促合成c-di-GMP為例，步驟為酶與底物GTP反應生成含c-di-GMP的混合液一煮沸、加入酸堿等方法使酶變性沉淀一離心一濾膜過濾除酶一凍干濃縮一反相HPLC分離純化一凍干一得固體c-di-GMP。其中，HPLC所用流動相分別為乙腈和乙酸胺水溶液(PH4. 8)，用紫外檢測器在254nm下檢測產(chǎn)物。由此可見，傳統(tǒng)方法的分離純化工藝復雜，耗時耗能。反相色譜柱對樣品要求比較嚴，要先除去可能會在柱子上沉積的雜質(zhì)(如酶)，不然會降低色譜柱使用壽命；凍干過程既需要有凍干儀又會耗費大量時間，致使生產(chǎn)效率低下。并且由于在制備過程中使用大量有機溶劑，會對操作者和環(huán)境造成危害，環(huán)保效果差。因此，開發(fā)新的簡便、高效、綠色的分離純化技術(shù)是非常有必要的。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中分離純化c-di-GMP所存在的不足，本發(fā)明提供了一種新型的分離純化c-di-GMP的方法。本發(fā)明所述c-di-GMP的分離純化方法，步驟是(1)取含c-di-GMP的粗產(chǎn)物溶液，以1 5mL/min的流速，直接上樣于配有離子交換色譜柱的快速蛋白液相色譜(Fast protein liquid chromatography，F(xiàn)PLC)，上樣量為 1 IOOOmL ；(2)上樣結(jié)束后，用洗脫液A和洗脫液B梯度洗脫，流速為1 5mL/min ；其中所述洗脫液A為pH8. 0的緩沖液，所述緩沖液為Tris-HCl、Na2HPO4-NaH2PO4或K2HPO4-KH2PO4 ；所CN 102443031 A
說明書
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述洗脫液B為A液中加入IM NaCl ；(3)用紫外檢測器在254nm下檢測，收集出峰位置處洗脫液，用質(zhì)譜確證結(jié)構(gòu)，然后將含目標化合物洗脫液凍干，制得固體c-di-GMP ；(4)以反相高效液相色譜(High performance Liquid Chromatography,HPLC)檢測，確定固體c-di-GMP純度。上述洗脫結(jié)束后的離子交換色譜柱，經(jīng)洗脫液B徹底清除柱上吸附物，再經(jīng)洗脫液A平衡后還可用于下一輪c-di-GMP的分離純化。上述c-di-GMP分離純化方法中，優(yōu)選的實施條件是所述快速蛋白液相色譜優(yōu)選GEAKTAFPLC ；所述離子交換色譜柱為Mini Q 4. 6/50PE時，優(yōu)選上樣量為1 10mL，優(yōu)選上樣流速和洗脫流速均為1 2mL/min ；所述離子交換色譜柱為Source Q HP 10/10時，優(yōu)選上樣量為10 IOOmL,優(yōu)選上樣流速和洗脫流速均為3 4mL/min ；所述離子交換色譜柱為 Source Q HP 16/10時，優(yōu)選上樣量為50 lOOOmL，優(yōu)選上樣流速和洗脫流速均為4 5mL/ min ；所述梯度洗脫優(yōu)選以0 — 20倍柱體積進行，所述洗脫液A的濃度值以100%— 0 進行，同時洗脫液B的濃度值以0 — 100%進行；所述緩沖液優(yōu)選TriS-HCl ；所述高效液相色譜為Siimadzu LC-10AD/AT，反相色譜柱為Agela Venusil MP C184. 6mmX 250mm,洗脫液A為pH4. 8的IOmM乙酸胺水溶液，洗脫液B為乙腈，流速為ImL/ min ；梯度洗脫運行時間30分，洗脫液A的濃度值以100%— 50%進行，同時洗脫液B的濃度值以0 — 50%進行；目標產(chǎn)物c-di-GMP保留時間在12. 0 12. 5min。利用本發(fā)明方法分離純化后的c-di-GMP產(chǎn)物經(jīng)反相HPLC檢測，純度達95 %以上， 符合生物學、動物藥理學等科研工作需要。'1 才目fei普(Fast protein liquid chromatography, FPLC) : —禾中f M、 快速、高效色譜技術(shù)，目前主要用于分離純化蛋白質(zhì)，目前尚沒有利用FPLC分離純化核苷酸的報導。本發(fā)明采用離子交換FPLC裝置作為主要設備來分離純化c-di-GMP，不僅能夠獲得純凈的產(chǎn)物，且待分離純化的原料在進入離子交換FPLC裝置之前不需經(jīng)過除酶、凍干濃縮等處理，實現(xiàn)了一步法直接從酶反應液或組織提取液中分離純化c-di-GMP。并且，離子交換FPLC裝置柱容量大、回收效率高且不易使生物分子失活，一次可以處理較多的原料，進一步縮減了分離純化時間，提高了分離純化速度。與傳統(tǒng)反相HPLC分離純化技術(shù)相比，本發(fā)明在簡化步驟、節(jié)省時間的同時，還避免了毒性有機溶劑乙腈的大量使用，顯著提高了 c-di-GMP分離純化的效率，消除了乙腈對操作者和環(huán)境造成的危害。生產(chǎn)成本的降低、環(huán)境污染的減輕無疑給該工作帶來了廣闊的工業(yè)應用前景。


圖1.采用離子交換FPLC分離純化c-di-GMP的圖譜。其中FPLC為GE AKTA FPLC,離子交換色譜柱為Mini Q 4. 6/50PE,兩種洗脫液分別為 25mM Tris-HCl (ρΗ8· 0) (A)禾P25mM Tris-HCl (ρΗ8. 0)+1Μ NaCl (B)。目標產(chǎn)物 c-di-GMP在洗脫液電導為35. 97mS/cm時出峰。圖2.本發(fā)明所得c-di-GMP經(jīng)HPLC純度鑒定圖譜。其中HPLC為 Shimadzu LC-10AD/AT，反相色譜柱為 Agela Venusil MP C184. 6mmX 250mm，兩種洗脫液分別為IOmM乙酸胺水溶液(pH4. 8) (A)和乙腈⑶；目標產(chǎn)物c-di-GMP保留時間在12. !3min。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作詳細的描述，但本發(fā)明保護內(nèi)容不僅限于此。實施例lc-di-GMP的粗產(chǎn)物溶液的制備(酶促反應法)將GTP (購自Sigma)和具有c-di-GMP合成活性的酶VCA0956以摩爾比1000 2 的比例加入到反應緩沖液(75mM Tris-HCl pH 8. 0,250mM NaCl,25mM KCl, IOmM MgCl2)中， 室溫下反應過夜，得含c-di-GMP的粗產(chǎn)物溶液。其中上述VCA0956的表達純化及c-di-GMP的粗產(chǎn)物溶液制備的詳細方法及步驟請參閱文獻:Rita Tamayo, Anna D. Tischler, and Andrew Camilli. The EAL domain protein VieA is a cyclic diguanylate phosphodiesterase. J. Biol. Chem. ,2005, 280, 33324-33330.實施例2(1)取實施例1制備的含c-di-GMP的粗產(chǎn)物溶液4mL，以lmL/min的流速，上樣于配有Mini Q 4. 6/50PE的離子交換色譜柱GE AKTA FPLC ；(2)上樣結(jié)束后，以 1. 5mL/min 流速，用 25mM Tris-HCl (ρΗ8· 0) (A)和 25mM Tris-HCl (ρΗ8. 0)+1Μ NaCl (B)梯度洗脫，梯度洗脫以0 — 20倍柱體積進行，洗脫液A的濃度值以100% — 0進行，同時洗脫液B的濃度值以0 — 100%進行；(3)用紫外檢測器在2Mnm下檢測；在洗脫液電導為35. 97mS/cm時出峰，收集出峰位置洗脫液，用質(zhì)譜確證其結(jié)構(gòu)[(ESI+) :m/e (relative intensity) [M+l]+691. 2, [M+2]2+346. 2]，此部分洗脫液凍干，即得固體c-di-GMP(結(jié)果如圖1所示)；(4)將步驟(3)的產(chǎn)物經(jīng)反相HPLC檢測，所用高效液相色譜為^imadzu LC-10AD/ AT，反相色譜柱為Agela Venusil MP C18 4. 6mmX 250mm，洗脫液A為pH4. 8的IOmM乙酸胺水溶液，洗脫液B為乙腈，流速為lmL/min ；梯度洗脫運行時間30分，洗脫液A的濃度值以 100%-50%進行，同時洗脫液B的濃度值以0 — 50%進行；檢測結(jié)果本實施例所制得的 c-di-GMP純度達100% (結(jié)果如圖2所示)。實施例3(1)取實施例1制備的含c-di-GMP的粗產(chǎn)物溶液30mL，以3mL/min的流速，上樣于配有Source Q HP 10/10離子交換色譜柱的GE AKTA FPLC ；(2)上樣結(jié)束后，以 3mL/min 流速，用 25mM Tris-HCl (pH8. 0) (A)和 25mM Tris-HCl (ρΗ8. 0)+1Μ NaCl (B)梯度洗脫，梯度洗脫以0 — 20倍柱體積進行，洗脫液A的濃度值以100%— 0進行，同時洗脫液B的濃度值以0 — 100%進行；(3)用紫外檢測器在254nm下檢測；在洗脫液電導為36. 03mS/cm時出峰，收集出峰位置洗脫液，用質(zhì)譜確證其結(jié)構(gòu)，此部分洗脫液凍干，即得固體c-di-GMP ；(4)將步驟(3)的產(chǎn)物經(jīng)反相HPLC檢測，所用高效液相色譜為^imadzu LC-10AD/AT，反相色譜柱為Agela Venusil MP C184. 6mmX 250mm，洗脫液A為pH4. 8的IOmM乙酸胺水溶液，洗脫液B為乙腈，流速為lmL/miin梯度洗脫運行時間30分，洗脫液A的濃度值以 100%-50%進行，同時洗脫液B的濃度值以0 — 50%進行；檢測結(jié)果本實施例所制得的 c-di-GMP 純度達 96%。實施例4(1)取實施例1制備的含c-di-GMP的粗產(chǎn)物溶液200mL，以5mL/min的流速，上樣于配有Source Q HP 16/10離子交換色譜柱的GE AKTAFPLC ；(2)上樣結(jié)束后，以 4mL/min 流速，用 25mM Tris-HCl (pH8. 0) (A)和 25mM Tris-HCl (ρΗ8. 0)+1Μ NaCl (B)梯度洗脫，梯度洗脫以0 — 20倍柱體積進行，洗脫液A的濃度值以100%— 0進行，同時洗脫液B的濃度值以0 — 100%進行；(3)用紫外檢測器在254nm下檢測；在洗脫液電導為36. 07mS/cm時出峰，收集出峰位置洗脫液，用質(zhì)譜確證其結(jié)構(gòu)，此部分洗脫液凍干，即得固體c-di-GMP ；(4)將步驟(3)的產(chǎn)物經(jīng)反相HPLC檢測，所用高效液相色譜為^imadzu LC-10AD/ AT,反相色譜柱為Agela Venusil MP C184. 6mmX 250mm，洗脫液A為pH4. 8的IOmM乙酸胺水溶液，洗脫液B為乙腈，流速為lmL/min ；梯度洗脫運行時間30分，洗脫液A的濃度值以 100%- 50%進行，同時洗脫液B的濃度值以0 — 50%進行；檢測結(jié)果本實施例所制得的 c-di-GMP 純度達 95%。
權(quán)利要求
1.一種c-di-GMP的分離純化方法，步驟是(1)取含c-di-GMP的粗產(chǎn)物溶液，以1 5mL/min的流速，直接上樣于配有離子交換色譜柱的快速蛋白液相色譜，上樣量為1 IOOOmL ；(2)上樣結(jié)束后，用洗脫液A和洗脫液B梯度洗脫，流速為1 5mL/min；其中所述洗脫液A為pH8. 0的緩沖液，所述緩沖液為Tris-HCLNa2HPO4-NaH2PO4或K2HPO4-KH2PO4 ；所述洗脫液B為A液中加入IMNaCl ；(3)用紫外檢測器在254nm下檢測，收集出峰位置處洗脫液，用質(zhì)譜確證結(jié)構(gòu)，然后將含目標化合物洗脫液凍干，制得固體c-di-GMP ；(4)以反相高效液相色譜檢測，確定固體c-di-GMP純度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述c-di-GMP的分離純化方法，其特征在于，所述快速蛋白液相色譜選 GE AKTAFPLC。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述c-di-GMP的分離純化方法，其特征在于，所述離子交換色譜柱為Mini Q 4. 6/50PE時，上樣量為1 10mL，上樣流速和洗脫流速均為1 2mL/min ；所述離子交換色譜柱為Source Q HP 10/10時，上樣量為10 lOOmL，上樣流速和洗脫流速均為 3 4mL/min ；所述離子交換色譜柱為Source Q HP 16/10時，上樣量為50 IOOOmL,上樣流速和洗脫流速均為4 5mL/min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述c-di-GMP的分離純化方法，其特征在于，所述梯度洗脫以 0 — 20倍柱體積進行，所述洗脫液A的濃度值以100% — 0進行，同時洗脫液B的濃度值以 0 — 100% 進行。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述c-di-GMP的分離純化方法，其特征在于，所述緩沖液為 Tris-HCl0
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述c-di-GMP的分離純化方法，其特征在于，所述高效液相色譜為 Shimadzu LC-10AD/AT，反相色譜柱為 Agela Venusil MP C184. 6mmX 250mm，洗脫液 A 為 PH4. 8的IOmM乙酸胺水溶液，洗脫液B為乙腈，流速為lmL/min ；梯度洗脫運行時間30分， 洗脫液A的濃度值以100%— 50%進行，同時洗脫液B的濃度值以0 — 50%進行；目標產(chǎn)物c-di-GMP保留時間在12. 0 12. 5min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種c-di-GMP的分離純化方法，是將c-di-GMP粗產(chǎn)物溶液直接上樣于配有離子交換色譜柱的快速蛋白液相色譜，用pH8.0緩沖液梯度洗脫，紫外檢測器254nm檢測，收集出峰位置處洗脫液，用質(zhì)譜確證結(jié)構(gòu)，然后將含目標化合物洗脫液凍干，即制得固體c-di-GMP。本發(fā)明方法制得的c-di-GMP經(jīng)反相高效液相色譜檢測其純度達95％以上，并實現(xiàn)了一步法直接從c-di-GMP粗產(chǎn)物溶液中分離純化c-di-GMP，且本發(fā)明工藝簡單，周期短，不使用毒性有機溶劑，是一種高效、環(huán)保、適合工業(yè)化生產(chǎn)的新方法。
文檔編號C07H19/213GK102443031SQ20111027997
公開日2012年5月9日 申請日期2011年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月20日
發(fā)明者朱春原, 李冰清, 許素娟, 谷立川, 陳穎 申請人:山東大學