專利名稱：借助于膜色譜進行的維生素k依賴性蛋白的純化的制作方法
技術領域：
本發(fā)明的主題是從含有這些組分的原料源制備既含有經(jīng)病毒滅活的維生素K依賴性血漿組分又含有蛋白C和蛋白S的藥劑的方法。
維生素K依賴性血漿組分，例如蛋白C、蛋白S、因子II、VII、IX和X是血漿中包含的組分，在凝血級聯(lián)系統(tǒng)中起著重要的病理生理作用。這些因子在治療表現(xiàn)出由分別缺損這些因子引起的癥狀的病人中用作藥物。
現(xiàn)在，作為這些因子的商業(yè)性回收原料源，血漿不能以任意需要的量被獲得。因此，由于倫理的和經(jīng)濟的原因任何分級分離和分離這些維生素K依賴性血漿組分，以及蛋白C和蛋白S的目的必然是一方面保證盡可能多地單獨地產(chǎn)生各因子自身且另一方面同時也使各種其它因子得以分離。本發(fā)明的目的是提供一種能夠達到所述目的的方法。
所得出的目的由按照本發(fā)明的包含權利要求1中提出的技術特征的方法達到。
在按照本發(fā)明的方法中，膜色譜法的使用起到了重要的作用。Josic等在Joural of Chromatography(632(1993)1-10)中描述了肝素親和色譜在從凝血級聯(lián)系統(tǒng)分離血漿蛋白質(zhì)上的適用性。描述了陰離子色譜預分離后的抗凝血酶III的分離以及因子IX和因子X的分離。用于預分離因子IX和因子X的陰離子交換色譜用制備型HPLC進行。按照H.G.J.Brummelhuis的方法(J.M.Curling(Editor)，″Methods of Plasma Protein Fractionation”，AcademicPress，London，Orlando，1980，p.117)完成含有因子IX和因子X的樣品的富集。
Josic等(Joural of Chromatography 590(1992)59-76)已使血清和血漿膜蛋白的高效膜色譜公知。其中已描述了血清和血漿膜蛋白的分離。例如，分離了來源于肝腎組織的血漿膜蛋白。
令人驚奇地是，業(yè)已表明通過以下所述的方法可以以高的純度和產(chǎn)率獲得有價值的維生素K依賴性血漿組分例如蛋白C、蛋白S、因子II、VII、IX和X。
第一步，將既含有各維生素K依賴性血漿組分又含有蛋白C和蛋白S的原料源(該源優(yōu)選采用新鮮或解凍狀態(tài)下的血漿)進行陰離子交換劑材料上的固相抽提。所述陰離子交換劑材料可以以排列在膜上的疏松塊狀顆粒材料或以緊密片狀形式使用。在交聯(lián)的或非交聯(lián)的和已用堿性基團修飾過的多糖上的固相抽提是優(yōu)選的。更具體地說，可以使用如用二乙氨乙基(DEAE)或季胺修飾的多糖之類的材料。因此，例如可以使用像SephadexP50一類的材料。特別是將DEAE修飾的分相材料用于因子IX的分離。在固相抽提中，將待抽提的原料源與以固定狀態(tài)存在的材料混合。
所說的固相抽提最好在低離子強度條件下進行。在可進行可不進行的洗滌步驟之后，收集洗脫物，然后又將其進行其它的處理步驟。
這樣，為了分離因子IX，樣品最好經(jīng)合適的修飾膜過濾。然后可進一步任選利用例如產(chǎn)生白蛋白或不利用濾液。
結合到膜上或各固相材料上的蛋白質(zhì)即因子II，特別是因子IX和因子X在較高的離子強度的條件下從固相連續(xù)流出。當使用DEAE-或季胺-修飾膜時，借助于以上提到的固相抽提材料，特別是顆粒材料，其多種可適用性與固相抽提相比是優(yōu)越的。
然后，通過具有高離子強度的溶液的作用將吸附在固相上的物質(zhì)從載體材料上解吸。接著將組分的離子強度采用合適的方法調(diào)節(jié)至完成后續(xù)分離步驟所需的狀態(tài)，例如稀釋或超濾或滲濾或添加增加離子強度的試劑。
此后可以接著進行陰離子交換劑膜色譜或親和膜色譜后者采用具有高或低分子量，對待分離的維生素K依賴性血漿組分以及蛋白C和蛋白S具有高親和力的固定化物質(zhì)。
這一色譜純化步驟也可以在用于進行疏水作用色譜的物質(zhì)上進行。
這里也將分別考慮到作為陰離子交換劑的材料，更具體地說是用二乙氨乙基或季胺修飾的膜。對維生素K依賴性血漿組分以及蛋白C和蛋白S具有高親和力的物質(zhì)可以是免疫親和配體。所考慮的免疫親和配體是直接針對待分離的因子的抗體。因此，例如就因子IX的分離來說，可以使用具有針對因子IX的各固定化抗體的膜。洗掉未被陰離子交換劑膜或免疫親和膜吸留的物質(zhì)，可進行可不進行收集和進一步處理。
用于疏水色譜的典型配體在疏水性上表現(xiàn)出某些漸變。它們包括例如無環(huán)或脂環(huán)脂肪族化合物具有例如C1到C18烷基鏈或芳香族化合物，也可以是已用極性質(zhì)子或極性非質(zhì)子配體，例如氰基，修飾。就適于疏水作用色譜的疏水配體而言，特別要考慮丙基、丁基、苯基基團(載體材料已經(jīng)它們修飾)和疏水性上表現(xiàn)出某些漸變的類似配體。疏水性上的漸變也可以被極性基團影響。因此，更具體地說，2-羥氨烷基基團，例如2-羥氨丙基基團，作為分離因子IX的疏水配體是合適的。
接下來的步驟包括吸附的血漿組分的進一步的分級分離，該步驟是基于在離子強度和/或pH值的變化下組分的逐步流出，用具有不同極性的高離子強度溶劑系統(tǒng)的溶劑系統(tǒng)或消除免疫親和配體和基質(zhì)之間的親和性的溶劑系統(tǒng)進行的。然后也可以采用以上提到的方法將從膜流出的組分的離子強度調(diào)節(jié)至進一步的分離步驟的條件下。
權利要求1的任選的步驟f)包括親和膜色譜。在按照本發(fā)明的方法范圍內(nèi)的親和膜色譜被理解為包括疏水色譜。以上已指出了合適配體的特征。
在按照本發(fā)明的方法范圍內(nèi)的親和膜色譜也涉及其中使用由免疫親和配體修飾的膜的色譜方法。這里，更具體地說，使用針對維生素K依賴性血漿組分以及蛋白C和蛋白S的單克隆抗體，所述單克隆抗體已在膜上固定化。
一方面可以用由離子交換劑基團特別是陰離子交換劑修飾的基質(zhì)材料或另一方面可以用由免疫親和配體修飾的材料進行樣品中的維生素依賴性血漿組分以及蛋白C和蛋白S的色譜分離操作。
在一種非常有利的模式中，所說的色譜材料排列在膜上。膜由基質(zhì)材料例如經(jīng)修飾的纖維素或合成纖維構成較好。更具體地說，由多孔聚甲基丙烯酸縮水甘油酯和/或其它具有類似結構的多孔親水聚合物(例如親水化的聚苯乙烯)制成的膜及緊密片狀物是合適的。
在第一種情況下，適于分離的膜由纖維素或合成纖維制成的堆積薄多孔膜組成，而在第二種情況下，它由硅膠或聚合物載體制成的緊密片狀物組成。所述片狀物膜的基質(zhì)材料已備有合適的陰離子交換劑基團或免疫親和配體。更具體地說，離子交換劑基團可以是陰離子交換劑基團，例如季胺化合物或二乙氨乙基(DEAE)基團。陽離子交換劑基本上可以是弱的或強的酸性陽離子交換劑，例如由磺酸或磷酸基團修飾的物質(zhì)。
離子交換劑基團可以是或者可以不是已經(jīng)所謂的間隔基鍵合到基質(zhì)材料纖維上的。備有間隔基的材料也稱為觸角材料。DE 4204694中已限定了合適的間隔基和配體。例如葡糖胺部分(glucosaminemioety)也可以用作間隔基。陰離子交換劑基團(例如DEAE或季胺化合物)也可以是已鍵合到由多孔聚甲基丙烯酸縮水甘油酯或其它提及的物質(zhì)制成的膜上的。陰離子交換劑基團直接或者經(jīng)間隔基例如葡糖胺部分鍵合到形成膜的材料上。
在按照本發(fā)明的另一個實施方案中，使用了親和膜色譜，其中采用固定化的低或高分子量的對維生素K依賴性血漿組分以及蛋白C和蛋白S優(yōu)選是人或鼠 的有高親和力的物質(zhì)。
借助化學活性基團使對維生素K依賴性血漿組分、因子II、VII、IX或X以及蛋白C和蛋白S有高親和力的物質(zhì)在載體上固定化。優(yōu)選活性基團不直接與載體材料而是與間隔基未端起化學反應。通過將對所述因子具有親合力的物質(zhì)鍵合到活性基團例如甲苯磺酰基、tresyl、酰肼等上來進行所述物質(zhì)的固定化。合適的方法已是公知的(T.M.Phillips，“Affinity Chromatography”，in“Chromatography”(E，Heftmann，Ed.)，5th edition，Elsevier，Amsterdam 1992)。
也可以將抗體預先吸附在攜帶有蛋白A或蛋白G配體的膜上?？贵w的流出(柱流出)可以用隨后的柱共價交聯(lián)阻止。為了將抗體交聯(lián)到蛋白A或蛋白G膜上，可以采用類似于使用疏松載體的方法。在蛋白A和蛋白G上固定化的優(yōu)點包括抗體全部地固定在分子(Fc)的恒定區(qū)段上，因此，抗原結合部分(Fab)保持游離，并且在其與各因子的相互作用中不被抑制。
對色譜純化后獲得級分用去垢劑例如離子或非離子表面活性劑處理來滅活病毒，該處理是按照EP 0 131 740A1中所述的方法在例如二或三烷基化的磷酸鹽化合物例如三正丁基磷酸鹽的存在下進行的。滅活病毒基本上也可以在第一色譜步驟之前進行。將TritonX-100Tween/TNBP(三正丁基磷酸鹽)用于滅活病毒是優(yōu)選的。用氯酸鈉/TNBP也獲得好的結果。最好使用重量比達15％的去垢劑。
然而，也可以經(jīng)加熱處理來進行病毒滅活。在這一方法中，在第一膜色譜后，對維生素K依賴性血漿組分以及蛋白C和蛋白S進行巴氏殺菌步驟。德國專利申請P43 18 435.9提出了一種合適的方法。其中使富含因子VIII的級分在穩(wěn)定劑例如糖、氨基酸、二價陽離子和/或肝素存在下與三或三烷基磷酸鹽任選的潤濕劑接觸，并且同時或者相繼在從55℃到70℃范圍內(nèi)的某一提高的溫度下處理5小時到30小時。如果需要，也可以進行過濾除去病毒。
將兩種滅活病毒的方法，即用去垢劑和加熱及過濾處理結合會是有利的。
在因子IX的分離中，巴氏滅菌步驟最好接著權利要求1的步驟f)進行。此后可進行另一膜色譜，除去在所述步驟中使用的化學品。最好借助膜除去添加的穩(wěn)定劑，所說的膜是由通過一個間隔基處于色譜載體材料表面的DEAE或季胺化合物修飾的。不采用間隔基使相應的配體處于色譜載體材料的表面也是可能的。
在選擇的條件下，穩(wěn)定劑不被這一陰離子交換劑材料滯留，而各因子被吸附在色譜材料上。
也可以經(jīng)超濾或滲濾除去通常由低分子量物質(zhì)組成的穩(wěn)定劑。然后，如果需要將形成的積累了維生素K依賴性血漿組分如蛋白C和蛋白S級分濃縮。呈現(xiàn)的濃縮方法涉及在溫和條件下除去溶劑(通常是水)的方法。更具體地說，它們包括其中在減壓下除去溶劑的方法，例如凍干(冷凍干燥)或噴霧干燥。
更具體地說，在按照本發(fā)明的方法中使用膜色譜意味著具有色譜分離進行的速度被大大加快這一優(yōu)點。而且，所使用的膜可以重復使用多次。與此相反，如果使用按照現(xiàn)有技術的固相材料，這種材料不能重復使用，而使用一次后就需要進行處理。
用分離因子IX的過程比較詳細地說明了按照本發(fā)明的方法。
實施例1用SephadexP50對解凍的血漿進行固相抽提。在吸附在固相上的物質(zhì)流出后，將所形成的級分在pH7.4下調(diào)節(jié)至具有相當于10到20mM檸檬酸鈉的離子強度，并且在DEAE QuickDisk(直徑25mm；厚度3mm)中進行膜色譜。壓力約3巴。然后，在5ml/min的流速下進行色譜。合并液含有因子II和因子VII的混合物，可進行進一步的分離。后來從柱中流出的峰含有因子IX和因子X的混合物。用梯度洗脫(從所說的起始緩沖溶液向作為緩沖溶液B的含有1M NaCl及10-20mM檸檬酸鈉(pH7.4)的緩沖溶液變化)進行膜色譜。如果使用具有配體高表面占有的強陰離子交換劑，則可獲得更大的載量。某些限制性因素由材料的選擇性構成。洗脫梯度的進程取決于載體上配體表面占有的程度。
將包含因子IX和因子X的混合物進行進一步的色譜。使用的膜色譜材料的載量等于或大于顆粒形式的材料的載量，兩種載量均依據(jù)材料的量。
實施例2按Journal of Chromatography，632(1993)，1-10中所述的方法處理按照實施例1的方法回收的并含有因子IX/X的級分。將按照實施例1的方法獲得的包含因子IX/X的級分進行緊密片狀物上的肝素親和層析。在具有相對低的離子強度的緩沖液中加樣后，用具有約500mOsm離子強度的緩沖液沖洗材料。然后用梯度溶液(從約500mOsm開始增加至約1,000mOsm)洗脫因子IX。由此洗脫的因子IX具有高的純度。從第一分離步驟開始，因子IX的回收率為約87％。
權利要求
1.一種制備既含有經(jīng)病毒滅活的維生素K依賴性血漿組分又含有蛋白C和蛋白S、因子II、因子VII、因子IX和/或因子X以及其組合物的藥劑例如PPSB制劑的方法，其中對含有這些組分的原料源按以下方法步驟進行處理a)在相對低的離子強度下，對陰離子交換劑材料上的含有待分離組分的原料源進行固相抽提，該陰離子交換劑處于疏松塊狀物中、膜上、緊密片狀物上，除去形成的洗脫物，如果需要，對洗脫物進行進一步的處理以回收其它物質(zhì)；b)洗脫吸附在固相上的物質(zhì)；c)任選地調(diào)節(jié)包含洗脫物級分的離子強度和/或pH值至隨后的純化步驟所需的條件下d)陰離子交換劑膜色譜、親和膜色譜、以及疏水作用色譜，其中親和膜色譜采用固定化的，高或低分子量的物質(zhì)進行，所述物質(zhì)對維生素K依賴性血漿組分以及蛋白C和蛋白S具有高親和力；e)經(jīng)改變離子強度、極性和/或pH值的逐步洗脫進行單個組分的分級分離；f)任選地進行膜親和色譜；g)任選地收集含有還未被除去的產(chǎn)物的洗脫物，任選地經(jīng)重復步驟f)進行所述洗脫物的進一步分級分離，其中使用合適的親和材料；h)在消除親和鍵合的條件下洗脫結合到親和材料上的物質(zhì)，接著濃縮洗脫物，任選地減低用于從親和材料洗脫的試劑的量；并且在每一色譜純化步驟前借助離子和/或非離子去垢劑滅活病毒和/或經(jīng)加熱處理和/或過濾滅活病毒，以便在合適的階段除去病毒。
2.按照權利要求1的方法，其中含有維生素K依賴性血漿組分例如蛋白C和蛋白S的原料源是新鮮或解凍狀態(tài)的血漿。
3.按照權利要求1和/或2的方法，其中的固相抽提是借助由堿性基團修飾的交聯(lián)多糖，例如Sephadex，或借助經(jīng)適當修飾的陰離子交換劑膜進行的。
4.按照權利要求1到3至少之一的方法，其中所說的膜色譜通過用已由DEAE或季胺修飾的膜，或者通過用已由低或高分子量的能與所需血漿組分特異性結合的親和配體修飾的膜(膜親和色譜)進行。
5.按照權利要求1到4至少之一的方法，其中所說的親和色譜是肝素膜親和色譜，采用針對待分離物質(zhì)的固定化抗體的膜免疫親和色譜或使用具有疏水配體的膜的膜親和色譜。
6.按照權利要求5的方法，其中用于修飾色譜載體的所說疏水配體是2-羥氨烷基基團，例如2-羥氨丙基，和/或疏水配體例如丙基、丁基、苯基基團和其它在疏水性上表現(xiàn)出某些漸變的類似配體。
7.按照權利要求1到6至少之一的方法，其中的色譜步驟后的離子強度的調(diào)節(jié)用稀釋或脫鹽過程例如滲濾或超濾，或用添加增加離子強度的試劑進行。
8.按照權利要求1到7至少之一的方法，其中的病毒滅活采用在二或三烷基磷酸鹽化合物例如三-正丁基磷酸鹽的存在下，用去垢劑例如離子的和/或非離子的去垢劑處理色譜純化后獲得的級分來進行。
9.按照權利要求1到8至少之一的方法，其中的病毒滅活是通過在穩(wěn)定劑例如糖、氨基酸、二價陽離子和/或肝素存在下，在55℃到70℃將級分加熱5到10小時進行的。
10.按照權利要求9的方法，其中的穩(wěn)定劑經(jīng)脫鹽方法例如滲濾或超濾、肝素親和色譜或陰離子交換劑色譜除去，或者在由DEAE或季胺化合物修飾的載體或由疏水配體修飾的載體上除去。
11.按照權利要求1到10至少之一的方法，其中的色譜材料是排列成疏松塊狀的顆粒材料，包埋在膜中的材料和/或由所述各種材料制成的緊密片狀物。
12.按照權利要求1到11至少之一的方法，其中所獲得的級分用冷干或噴霧干燥濃縮。
全文摘要
公開了一種制備含有既含有經(jīng)病毒滅活的維生素K依賴性血漿組分又含有蛋白C和蛋白S、因子Ⅱ、因子Ⅶ、因子Ⅸ和/或因子Ⅹ以及其組合物的藥劑例如PPSB制劑的方法，其中用合適的分離方法，特別是用膜色譜法處理含有這些組分的原料源。
文檔編號C07K14/745GK1137292SQ94194445
公開日1996年12月4日 申請日期1994年12月7日 優(yōu)先權日1993年12月10日
發(fā)明者D·佐西克, A·施特蘭卡 申請人:奧克塔法馬有限公司