本發(fā)明屬于一種高效液相色譜分離系統(tǒng)，具體涉及一種三維超高效液相色譜分離系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

隨著分離技術(shù)的發(fā)展，探尋并分離復(fù)雜樣品體系中的成分已成為熱點(diǎn)研究領(lǐng)域。多維液相色譜正是基于這一研究熱點(diǎn)發(fā)展起來的分離技術(shù)。與傳統(tǒng)的一維液相色譜分析方法相比，多維液相色譜技術(shù)通過提高峰容量有效改善復(fù)雜樣品成分分離的分離度。由于技術(shù)限制，目前最常見的為二維液相色譜系統(tǒng)。根據(jù)感興趣組份的不同，二維液相色譜方法包括全二維和中心切割兩種模式。全二維液相色譜是指樣品體系中的全部組份均經(jīng)歷兩次不同模式的色譜分離，而中心切割二維液相色譜是指第一維分離后對部分組份進(jìn)行收集并進(jìn)入第二維進(jìn)行分離。

最常見的二維液相色譜接口技術(shù)有3種：基于樣品環(huán)的接口技術(shù)；基于捕集柱的接口技術(shù)；基于停留模式的接口技術(shù)?；跇悠翻h(huán)的接口技術(shù)是最常用的接口技術(shù)，但是，為了與第二維分析速度匹配，樣品環(huán)的體積即第二維的進(jìn)樣體積通常很大，造成很嚴(yán)重的溶劑效應(yīng)?；诓都慕涌诩夹g(shù)通過在保留化合物的同時(shí)去除溶劑，有效的避免了這一問題，但是由于溶劑不兼容，化合物在捕集過程中的丟失是這種接口技術(shù)最大的弊端。停留模式可以避免第二維分離速度對第一維分析的影響，但是使用這種接口技術(shù)進(jìn)行全二維分析十分費(fèi)時(shí)。

實(shí)際樣品中化合物組成十分復(fù)雜且性質(zhì)差別非常大。對于不同的第一維餾分，第二維分離時(shí)使用等度或者相同梯度條件往往不能得到很好的分離。雖然第二維使用逐漸變化的梯度模式可以在一定程度上改善方法的分辨率，但是這種梯度模式不僅構(gòu)建比較困難，對于正交性較好的二維液相色譜系統(tǒng)可行性較小?；诙S液相色譜系統(tǒng)以上所述問題，本發(fā)明構(gòu)建了一種三維液相色譜系統(tǒng)，在復(fù)雜樣品進(jìn)入全二維系統(tǒng)分析前，選擇合適的色譜柱將其根據(jù)性質(zhì)不同分為幾個(gè)餾分，然后根據(jù)每個(gè)餾分的性質(zhì)針對性的建立全二維的方法，那么可以進(jìn)一步提高方法的分辨率。此外，采用捕集柱收集色譜分離所得的餾分，并在化合物進(jìn)入捕集柱前引入稀釋液以提高捕集效率。

綜上所述，本發(fā)明所構(gòu)建的三維液相色譜系統(tǒng)，適用于復(fù)雜樣品體系如植物提取物，血樣，尿樣等的分離。根據(jù)被分析樣品的不同選擇不同的色譜柱組合，系統(tǒng)構(gòu)建靈活。與質(zhì)譜聯(lián)用可進(jìn)一步提高分辨 率，在復(fù)雜體系分離分析中有非常廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是基于上述多維液相色譜現(xiàn)有技術(shù)中存在的一些問題，提供一種三維超高效液相色譜裝置。使用停留模式與中心切割技術(shù)相結(jié)合，引入第一維預(yù)分離，將復(fù)雜樣品預(yù)分離成幾個(gè)性質(zhì)相近的餾分，結(jié)合后續(xù)全二維液相色譜分離，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品組份的高效分離。此外通過引入稀釋液提高化合物在捕集柱上的捕集效率。

本發(fā)明涉及的三維高效液相色譜裝置包括包括自動(dòng)進(jìn)樣器、混合器1、混合器2，稀釋液泵、液相色譜泵1、液相色譜泵2、液相色譜泵3、液相色譜柱1、液相色譜柱2、液相色譜柱3、捕集柱1、捕集柱2、捕集柱3、八通閥或六通閥(9)、八通閥(24)、十通閥(38)、和檢測器；

通過控制二位多通閥的位置，這種三維液相色譜分離系統(tǒng)分為上樣位和洗脫位；在上樣位，作為第1維液相泵的液相色譜泵1輸出端流經(jīng)自動(dòng)進(jìn)樣器后與作為第1維色譜柱的液相色譜柱1輸入端連接，液相色譜柱1輸出端與混合器1的一個(gè)輸入端連接；稀釋液泵的輸出端與八通閥或六通閥(9)的5號位連接，八通閥或六通閥的6號位與混合器1的另一輸入端連接；混合器1的輸出端與八通閥(24)的16號位連接，八通閥的17號位與捕集柱1的輸入端相連，捕集柱1的輸出端與八通閥(24)的20號位連接，八通閥的21號位為廢液口；作為第2維液相泵的液相色譜泵2輸出端與八通閥(24)的19號位連接，八通閥的18號位與液相色譜柱2的輸入端連接，液相色譜柱2的輸出端與混合器2的一個(gè)輸入端連接；混合器2的另一輸入端與八通閥或六通閥(9)的4號位連接，八通閥或六通閥的3號位用塞子堵死；混合器2的輸出端與十通閥(38)的28號位連接，十通閥的29號位與34號位通過管線連接，35號位與捕集柱3的輸入端連接，捕集柱3的輸出端與十通閥(38)的33號位連接，十通閥的32號位為廢液口。作為第3維液相泵的液相色譜泵3輸出端與十通閥(38)的36號位連接，十通閥的37號位與捕集柱2的輸入端連接，捕集柱2的輸出端與十通閥(38)的31號位連接，十通閥的30號位與液相色譜柱3的輸入端連接，液相色譜柱3的輸出端接入檢測器；上述十通閥(38)每0.5分鐘至2分鐘切換一次；

在洗脫位，作為第1維液相泵的液相色譜泵1輸出端流經(jīng)自動(dòng)進(jìn)樣器后與作為第1維色譜柱的液相色譜柱1輸入端連接，液相色譜柱1輸出端與混合器1的一個(gè)輸入端連接；混合器1的另一輸入端與八通閥或六通閥(9)的6號位連接，八通閥或六通閥的7號位用塞子堵死；混合器1的輸出端接入八通閥(24)的16號位連接，八通閥的23號位用塞子堵死，同時(shí)液相色譜泵1停止給液；作為第二維液 相泵的液相色譜泵2輸出端與八通閥(24)的19號位連接，八通閥的20號位與捕集柱1的輸入端連接，捕集柱1的輸出端與八通閥(24)的17號位連接，八通閥的18號位與色譜柱2的輸入端相連，色譜柱2的輸出端接入混合器2的一個(gè)輸入端；稀釋液泵的輸出端與八通閥或六通閥(9)的5號位連接，八通閥或六通閥的4號位與混合器2的另一輸入端連接，混合器2的輸出端與十通閥(38)的28號位連接，十通閥的29號位與34號位通過管線連接，35號位與捕集柱3的輸入端連接，捕集柱3的輸出端與十通閥(38)的33號位連接，十通閥的32號位為廢液口；作為第3維液相泵的液相色譜泵3的輸出端與十通閥(38)的36號位連接，十通閥的37號位與捕集柱2的輸入端連接，捕集柱2的輸出端與與十通閥(38)的31號位連接，十通閥的30號位與液相色譜柱3連接，液相色譜柱3的輸出端接入檢測器；上述十通閥(38)每0.5至2分鐘切換一次。

所述液相色譜泵1、液相色譜泵2、液相色譜泵3均為高效液相色譜泵，為單泵或者二元泵。

所述八通閥或六通閥(9)的3號位和7號位，八通閥(24)的22號位和23號位，均使用塞子堵死。

所述檢測器為：質(zhì)譜檢測器，具體為離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜。

上樣位所述稀釋液輔助化合物在捕集柱1上的保留，洗脫位所述稀釋液輔助化合物在捕集柱2和捕集柱3上的保留。

混合器1可以根據(jù)色譜柱1和上樣位所述稀釋液的流速選擇合適的體積?；旌掀?可以根據(jù)色譜柱2和洗脫位所述稀釋液的流速選擇合適的體積。

第1維液相色譜分離通過中心切割的方式簡化復(fù)雜樣品體系。

第1維液相色譜系統(tǒng)通過停留模式與后續(xù)全二維液相色譜體系相連。

本發(fā)明最核心的過程是：復(fù)雜樣品體系中的化合物經(jīng)第一維預(yù)分離后與稀釋液混合并有效的保留在捕集柱上，然后通過二位八通閥切換到后續(xù)第二維和第三維色譜柱所構(gòu)建的全二維系統(tǒng)中進(jìn)一步分離。

根據(jù)本發(fā)明提供的三維液相色譜系統(tǒng)，選擇不同固定相和流動(dòng)相組合，可以實(shí)現(xiàn)對復(fù)雜體系如植物，環(huán)境，血樣，尿樣，組織等樣品的高效分離。

附圖說明

圖1為本發(fā)明提供的三維液相色譜系統(tǒng)的裝置圖；

圖2為本發(fā)明系統(tǒng)裝置圖及上樣位流程圖；

圖3為本發(fā)明系統(tǒng)裝置圖及洗脫位流程圖；

圖1-圖3中，9為六通閥或八通閥，1-8為六通閥或八通閥的接口，10為液相色譜泵1，11為自動(dòng)進(jìn)樣器，12為液相色譜柱1，13為混 合器1，14為稀釋液泵，15為捕集柱1，24為八通閥，16-23為八通閥接口，25為液相色譜泵2，26為液相色譜柱2，27為混合器2，38為十通閥，28-37為十通閥接口，39為液相色譜泵3，40為捕集柱2，41為捕集柱3，42為液相色譜柱3，43為檢測器。

圖4為本發(fā)明系統(tǒng)對大豆提取物進(jìn)行分離，其第一個(gè)餾分的色譜圖(見實(shí)施例)。圖中橫坐標(biāo)為第二維保留時(shí)間(min)，縱坐標(biāo)為第三維保留時(shí)間(s)。

圖5為本發(fā)明系統(tǒng)對大豆提取物進(jìn)行分離，其第二個(gè)餾分的色譜圖(見實(shí)施例)。圖中橫坐標(biāo)為第二維保留時(shí)間(min)，縱坐標(biāo)為第三維保留時(shí)間(s)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述。

實(shí)施例1：三維高效液相色譜體系構(gòu)建

本發(fā)明系統(tǒng)裝置包括自動(dòng)進(jìn)樣器、混合器1、混合器2，稀釋液泵、液相色譜泵1、液相色譜泵2、液相色譜泵3、液相色譜柱1、液相色譜柱2、液相色譜柱3、捕集柱1、捕集柱2、捕集柱3、八通閥(9)、八通閥(24)、十通閥、和離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜。通過控制二位多通閥的位置，這種三維液相色譜分離系統(tǒng)分為上樣位和洗脫位。

如圖2所示為上樣位，作為第1維液相泵的液相色譜泵1輸出端流經(jīng)自動(dòng)進(jìn)樣器后與作為第1維色譜柱的液相色譜柱1輸入端連接，液相色譜柱1輸出端與混合器1的一個(gè)輸入端連接；稀釋液泵的輸出端與八通閥(9)的5號位連接，八通閥的6號位與混合器1的另一輸入端連接；混合器1的輸出端與八通閥(24)的16號位連接，八通閥的17號位與捕集柱1的輸入端相連，捕集柱1的輸出端與八通閥(24)的20號位連接，八通閥的21號位為廢液口；作為第2維液相泵的液相色譜泵2輸出端與八通閥(24)的19號位連接，八通閥的18號位與液相色譜柱2的輸入端連接，液相色譜柱2的輸出端與混合器2的一個(gè)輸入端連接；混合器2的另一輸入端與八通閥(9)的4號位連接，八通閥的3號位用塞子堵死；混合器2的輸出端與十通閥(38)的28號位連接，十通閥的29號位與34號位通過管線連接，35號位與捕集柱3的輸入端連接，捕集柱3的輸出端與十通閥(38)的33號位連接，十通閥的32號位為廢液口。作為第3維液相泵的液相色譜泵3輸出端與十通閥(38)的36號位連接，十通閥的37號位與捕集柱2的輸入端連接，捕集柱2的輸出端與十通閥(38)的31號位連接，十通閥的30號位與液相色譜柱3的輸入端連接，液相色譜柱3的輸出端接入檢測器；上述十通閥38每1分鐘切換一次；

如圖3所示為洗脫位，作為第1維液相泵的液相色譜泵1輸出端流經(jīng)自動(dòng)進(jìn)樣器后與作為第1維色譜柱的液相色譜柱1輸入端連接， 液相色譜柱1輸出端與混合器1的一個(gè)輸入端連接；混合器1的另一輸入端與八通閥(9)的6號位連接，八通閥的7號位用塞子堵死；混合器1的輸出端接入八通閥(24)的16號位連接，八通閥的23號位用塞子堵死，同時(shí)液相色譜泵1停止給液；作為第二維液相泵的液相色譜泵2輸出端與八通閥(24)的19號位連接，八通閥的20號位與捕集柱1的輸入端連接，捕集柱1的輸出端與八通閥(24)的17號位連接，八通閥的18號位與色譜柱2的輸入端相連，色譜柱2的輸出端接入混合器2的一個(gè)輸入端；稀釋液泵的輸出端與八通閥(9)的5號位連接，八通閥的4號位與混合器2的另一輸入端連接，混合器2的輸出端與十通閥(38)的28號位連接，十通閥的29號位與34號位通過管線連接，35號位與捕集柱3的輸入端連接，捕集柱3的輸出端與十通閥(38)的33號位連接，十通閥的32號位為廢液口；作為第3維液相泵的液相色譜泵3的輸出端與十通閥(38)的36號位連接，十通閥的37號位與捕集柱2的輸入端連接，捕集柱2的輸出端與與十通閥(38)的31號位連接，十通閥的30號位與液相色譜柱3連接，液相色譜柱3的輸出端接入檢測器；上述十通閥每1分鐘切換一次。

在本實(shí)施例中，液相色譜泵1為二元高效液相色譜泵，液相色譜泵2為兩個(gè)高效液相色譜單泵組合，液相色譜泵3為兩個(gè)超高效液相色譜泵組合，稀釋液泵為一個(gè)高效液相色譜單泵?；旌掀?的體積為100μL?；旌掀?的體積為20μL。

實(shí)施例2：復(fù)雜樣品體系分離

樣品：大豆80％甲醇提取物。

具體提取過程如下：準(zhǔn)確稱量大豆干粉60mg，加入1.5mL 80％甲醇，渦旋10分鐘，超聲1小時(shí)；4℃下以14000rpm的速度離心15分鐘；取1.4mL上層清液真空冷凍干燥。進(jìn)樣前使用400μL 80％甲醇復(fù)溶；進(jìn)樣量為10μL。

第一維液相色譜參數(shù)：液相色譜柱1：BEH Amide柱(1.7μm，2.1×100mm)。流動(dòng)相A1為含有10mM甲酸銨的乙腈/水溶液(乙腈/水＝40/60，v/v)，流動(dòng)相B1為含有10mM甲酸銨的乙腈/水溶液(乙腈/水＝95/5，v/v)。流速0.15mL/min。柱溫為室溫。

第二維液相色譜參數(shù)：液相色譜柱2：Fluoro-Phenyl柱(3.5μm，2.1×50mm)。流動(dòng)相A2為含有體積分?jǐn)?shù)0.1％甲酸的水溶液，流動(dòng)相B2為含有體積分?jǐn)?shù)0.1％甲酸的乙腈。流速0.025mL/min。柱溫為室溫。

第三維液相色譜參數(shù)：液相色譜柱3：SB-C18柱(1.8μm，2.1×50mm)。流動(dòng)相A3為含有體積分?jǐn)?shù)0.1％甲酸的水溶液，流動(dòng)相B3為含有體積分?jǐn)?shù)0.1％甲酸的甲醇。流速1mL/min。柱溫為90℃。

捕集柱1、2、3參數(shù)：BEH C18柱(1.7μm，2.1×5mm)。其中捕集柱1為兩根C18柱串聯(lián)，捕集柱2和3為單根C18捕集柱。

稀釋液泵中的稀釋液為含有體積分?jǐn)?shù)0.1％甲酸的水溶液。在上樣位，稀釋液流速為2mL/min，在洗脫位，稀釋液流速為0.5mL/min。

本實(shí)施例中復(fù)雜樣品體系大豆提取物經(jīng)過第一維預(yù)分離后被分為兩個(gè)餾分并被保留在捕集柱1上。其中餾分1為在柱1上不保留的非極性化合物。餾分2為中等極性和強(qiáng)極性化合物。

三維液相色譜梯度條件如下表所示：

經(jīng)GCImage軟件處理后，餾分1的二維色譜圖如圖4所示，餾分2的二維色譜圖如圖5所示。