Chip蛋白在胰腺癌早期診斷以及預(yù)后判斷中的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及CHIP蛋白在胰腺癌早期診斷以及預(yù)后判斷中的用途。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種CHIP蛋白在用于制備診斷胰腺癌患者的試劑盒中的用途。更特別地，本發(fā)明提供了CHIP蛋白在制備用于評(píng)估胰腺癌患者預(yù)后的試劑盒中的用途。
【專利說明】CHIP蛋白在胰腺癌早期診斷以及預(yù)后判斷中的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及CHIP蛋白作為診斷胰腺癌患者以及評(píng)估胰腺癌患者預(yù)后的血清標(biāo)記 物的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 胰腺癌是最難早期發(fā)現(xiàn)、惡性程度最高和預(yù)后最差的腫瘤之一。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)對(duì) 美國(guó)腫瘤發(fā)病率及死亡率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，胰腺癌占全部腫瘤死亡原因的第四位，5年生存 率在5%以下。其死亡的主要原因是超過50%患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期，腫瘤已包繞血管或 發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且對(duì)傳統(tǒng)的放化療或靶向治療具有一定耐受性。因此，提高胰腺癌的早期診 斷率，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，提高藥物的治療效果，成為改善胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)鍵 因素。
[0003] 由于胰腺癌臨床發(fā)病隱匿，發(fā)展迅速，具有較高的侵襲性，而且通常在出現(xiàn)臨床癥 狀時(shí)已進(jìn)入晚期，此時(shí)進(jìn)行手術(shù)及放化療效果極差，而改變這種情況的關(guān)鍵在于早期的診 斷和治療。因此，對(duì)于胰腺癌的腫瘤標(biāo)記物的研究有助于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)，有助于對(duì)胰腺 的良性病變或惡性腫瘤的鑒別診斷，為早期手術(shù)治療提供診斷依據(jù)。由于血清中可能含有 較多的腫瘤標(biāo)記物，同時(shí)血樣的采集安全可靠，因此，通過血清學(xué)樣本對(duì)無癥狀患者進(jìn)行胰 腺癌的篩選具有很大的潛力。目前臨床上常用的胰腺癌腫瘤學(xué)標(biāo)志物是CA19-9和CA142。 CA19-9是一種唾液酸Lewis血型類粘蛋白糖蛋白抗原，與Lewis血型成分有關(guān)，用于鑒別正 常人和胰腺癌患者的敏感性為79% (70%-90%)，特異性為82 (68%-91%)，其中約5%-14%的 人群缺乏Lewis抗原糖基轉(zhuǎn)移酶而不能合成CA19-9,即使發(fā)生胰腺癌后其CA19-9的表達(dá)并 不升高；而急性膽管炎，胰腺炎膽汁淤積等非胰腺腫瘤疾病均可導(dǎo)致CA19-9表達(dá)的增加。 因此，CA19-9表達(dá)水平的改變更多的是作為手術(shù)或放化療后腫瘤復(fù)發(fā)的依據(jù)。CA242也是 一種唾液酸化的粘蛋白類型糖抗原，由于同時(shí)受到Lewis血型的影響所以靈敏度與CA19-9 相似，約為75% (65%-82%)，特異性為90% (65%-95%)，在與慢性胰腺炎、良性肝病、膽汁淤積 等方面診斷效率略好于CA19-9。這些標(biāo)志物用于鑒別診斷的準(zhǔn)確性并不高，常需要聯(lián)合使 用。因此，還需要尋找一些敏感性或特異性更好的腫瘤學(xué)標(biāo)志物用于早期診斷。
[0004] C末端Hsc70反應(yīng)蛋白（命名為CHIP)是一個(gè)種屬間高度保守的胞漿蛋白，在平滑 肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌和大腦中高度表達(dá)。它含有三個(gè)功能區(qū)，N末端的TPR功能區(qū)、 C-末端的U-盒子功能區(qū)和中間的正負(fù)電荷富集區(qū)。CHIP作為一個(gè)陪伴蛋白（chaperone) 即可通過TPR基序（motif)與熱休克蛋白Hsp70和Hsp90相互作用，輔助新生蛋白折疊，形 成具有正常結(jié)構(gòu)和功能的蛋白，抑制變性蛋白的聚集；又可通過U-盒子功能區(qū)作為E3連 接酶，促進(jìn)蛋白底物的泛素化降解。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CHIP在多種腫瘤中發(fā)揮重要的作用。可 與CHIP結(jié)合并發(fā)生降解的蛋白包括突變的p53,雌激素受體，erbB2, SMAD3, HIF-1，SRC-3， NF-κ B，c-Myc，以及磷酸化的AKT等，這些底物都與腫瘤的增殖、侵襲或轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)。 另一方面，CHIP在乳腺癌、胃癌及腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平要明顯低于癌旁的正常組織， 這些結(jié)果均提示CHIP在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌的作用，目前關(guān)于腫瘤患者血清中CHIP表達(dá) 水平國(guó)內(nèi)外并沒有相關(guān)的報(bào)道。
[0005] 本發(fā)明來源于一個(gè)驚人的方法，S卩，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)正常人、慢性胰腺炎患者和胰腺 癌患者三者血清CHIP表達(dá)水平有顯著性差異。這一結(jié)果為胰腺疾病的鑒別診斷以及預(yù)后 提供了一個(gè)新的思路。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，癌組織表達(dá)水平高于癌旁組織，其表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和術(shù)后 轉(zhuǎn)移負(fù)相關(guān)；CHIP高表達(dá)患者預(yù)后相對(duì)較好，是影響胰腺癌預(yù)后的可能危險(xiǎn)因素。CHIP在 慢性胰腺炎，胰腺癌患者血清中表達(dá)水平明顯降低；在胰腺癌患者中，其表達(dá)水平與腫瘤遠(yuǎn) 處轉(zhuǎn)移相關(guān)，CHIP可作為鑒別正常人、慢性胰腺炎和胰腺癌患者有效的血清學(xué)標(biāo)志物。
[0007] 一方面，本發(fā)明提供了一種CHIP蛋白在用于制備診斷胰腺癌患者的試劑盒中的 用途。
[0008] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種CHIP蛋白作為區(qū)分正常人、慢性胰腺炎和胰腺癌患 者的有效的血清學(xué)標(biāo)志物中的用途。
[0009] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種CHIP蛋白作為區(qū)分正常人、胰腺良性腫瘤和胰腺癌 患者的有效的血清學(xué)標(biāo)志物中的用途。
[0010] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種CHIP蛋白作為區(qū)分胰腺良性腫瘤、胰腺內(nèi)分泌腫瘤 與正常人的有效的血清學(xué)標(biāo)志物。進(jìn)一步地，所述的試劑盒用于ELISA方法中。
[0011] 另一方面，本發(fā)明提供了 CHIP蛋白在制備用于評(píng)估胰腺癌患者預(yù)后的試劑盒中 的用途。
[0012] 進(jìn)一步地，其中CHIP蛋白高表達(dá)患者預(yù)后相對(duì)較好。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1顯示了 CHIP和Hsp70在癌和癌旁組織中的表達(dá)水平。N代表癌旁胰腺組織， T代表胰腺癌組織。
[0014] 圖2顯示了 CHIP在癌組織及癌旁組織表達(dá)水平比較。
[0015] 圖3顯示了血清CHIP表達(dá)水平鑒別正常人和慢性胰腺炎患者的價(jià)值。
[0016] 圖4顯示了血清CHIP表達(dá)水平鑒別正常人和胰腺良性腫瘤患者的價(jià)值。
[0017] 圖5顯示了血清CHIP表達(dá)水平鑒別正常人和胰腺內(nèi)分泌腫瘤患者的價(jià)值。
[0018] 圖6顯示了血清CHIP表達(dá)水平鑒別正常人和胰腺導(dǎo)管腺癌患者的價(jià)值。
[0019] 圖7顯示了血清CHIP表達(dá)水平鑒別慢性胰腺炎患者和胰腺良性腫瘤患者的價(jià)值。
[0020] 圖8顯示了血清CHIP表達(dá)水平鑒別慢性胰腺炎患者和胰腺內(nèi)分泌腫瘤患者的價(jià) 值。
[0021] 圖9顯示了血清CHIP表達(dá)水平鑒別慢性胰腺炎患者和胰腺導(dǎo)管腺癌患者的價(jià)值。
[0022] 圖10顯示了血清CHIP表達(dá)水平鑒別胰腺良性腫瘤患者和胰腺內(nèi)分泌腫瘤患者的 價(jià)值。
[0023] 圖11顯示了血清CHIP表達(dá)水平鑒別胰腺良性腫瘤患者和胰腺導(dǎo)管腺癌患者的價(jià) 值。
[0024] 圖12顯示了血清CHIP表達(dá)水平鑒別胰腺內(nèi)分泌腫瘤患者和胰腺導(dǎo)管腺癌患者的 價(jià)值。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 本發(fā)明涉及的SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）是目前最常用 的分離蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié) 構(gòu)，蛋白質(zhì)同SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié) 合大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子 團(tuán)塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合 是按重量成比例的，因此在進(jìn)行電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速度僅取決于分子大小，因此可 以根據(jù)蛋白分子量大小將不同的蛋白拉出不同的梯度進(jìn)而檢測(cè)。
[0026] Western blot即蛋白質(zhì)印跡。被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，"探針"是抗體，"顯色"用標(biāo)記 的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體(例如PVDF薄膜)上，固相載體以非 共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體 上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與辣根過氧化物酶或同位素標(biāo) 記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá) 的蛋白成分。發(fā)光值得高低反映蛋白濃度的高低水平。
[0027] ELISA檢測(cè)人血清中的CHIP表達(dá)水平是結(jié)合在固相載體(如96孔板)表面的抗體 仍保持其免疫活性，受檢標(biāo)本中的抗原可以與固相載體表面的抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，用 洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體符合物與液體中的其他物質(zhì)分開，再加入酶標(biāo)記 的抗體，使之也通過反應(yīng)而結(jié)合在固體載體上。此時(shí)固相上的酶含量即與標(biāo)本中受監(jiān)測(cè)物 質(zhì)的量呈正比，通過酶催化的底物顏色即可確定標(biāo)本中抗原的含量。
[0028] 本部分實(shí)驗(yàn)主要通過免疫組化研究CHIP在胰腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水 平，通過CHIP的表達(dá)水平與臨床指標(biāo)的聯(lián)系尋找可能影響預(yù)后的因素，通過CHIP表達(dá)水平 與總生存期和無瘤生存期觀察其是否可以作為預(yù)測(cè)預(yù)后的指標(biāo)；通過在正常人和不同患者 血清中CHIP表達(dá)水平的差異觀察其是否可以作為胰腺癌鑒別診斷的有效腫瘤學(xué)標(biāo)志物。
[0029] 實(shí)施例1、實(shí)驗(yàn)材料的采集
[0030] 1、組織病理標(biāo)本：
[0031] 收集北京協(xié)和醫(yī)院2006年1月至2010年7月收治的經(jīng)病理檢查確診的胰腺導(dǎo)管 腺癌的病例標(biāo)本，標(biāo)本于北京協(xié)和醫(yī)院基本外科-80°C標(biāo)本庫(kù)保存。研究樣本的納入和排除 標(biāo)準(zhǔn)如下：
[0032] 1)納入標(biāo)準(zhǔn)：病理診斷為胰腺導(dǎo)管腺癌的標(biāo)本，行手術(shù)切除的病例。
[0033] 2)排除標(biāo)準(zhǔn)：未行腫瘤切除，或僅行胰腺組織活檢；病例資料不完整，無法獲得隨 訪信息；標(biāo)本無法制備成免疫組化切片。
[0034] 本次共有58例胰腺癌患者被納入本次研究，其中男性25人，女性33人，男女比例 為1:1. 32 ;年齡< 65歲者38例，> 65歲者20例；位于胰頭者36例，位于胰體尾者22例； 低分化者25例，高中分化者33例；腫瘤--Μ分期1-2期44例，3-4期14例；R0切除者47 例，R1切除11例。所有患者在術(shù)前均未接受放化療或免疫治療。本項(xiàng)研究已經(jīng)獲得北京 協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。
[0035] 2、血清標(biāo)本：
[0036] 收集北京協(xié)和醫(yī)院2008年1月至2012年1月進(jìn)行檢查的健康志愿者47例，經(jīng)臨 床診斷為慢性胰腺炎患者的血標(biāo)本18例，經(jīng)病理檢查確診為胰腺良性腫瘤的血標(biāo)本29例， 經(jīng)病理檢查確診為胰腺內(nèi)分泌腫瘤的血標(biāo)本19例，經(jīng)病理檢查確診為胰腺導(dǎo)管腺癌患者 的血標(biāo)本47例。行手術(shù)患者其血清樣品均為手術(shù)如獲取樣品，標(biāo)本保存于北點(diǎn)協(xié)和醫(yī)院基 本外科-80°C冰箱中。研究樣本的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)如下：
[0037] 1)納入標(biāo)準(zhǔn)：
[0038] 健康志愿者：無肝炎，結(jié)核，慢性炎癥以及腫瘤的健康人群。
[0039] 慢性胰腺炎：根據(jù)內(nèi)外分泌不足的臨床癥狀和體征、影像學(xué)診斷作為臨床診斷納 入標(biāo)準(zhǔn)。
[0040] 胰腺良性腫瘤：包括漿液性囊性腫瘤，粘液性囊性腫瘤，導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀粘液性腫 瘤，實(shí)性假乳頭性腫瘤患者。
[0041] 胰腺內(nèi)分泌腫瘤：包括胰島素瘤和胰腺內(nèi)分泌癌患者。
[0042] 胰腺癌：胰腺導(dǎo)管腺癌患者，包括未手術(shù)切除僅行病理穿刺確診患者。
[0043] 2)排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有肝炎，膽囊炎或其他合并癥；血清標(biāo)本發(fā)生降解；術(shù)后獲取的血 清樣品；病例資料不完整，無法獲得隨訪息。
[0044] 本項(xiàng)研究已經(jīng)獲得北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。
[0045] 實(shí)施例2、實(shí)驗(yàn)方法
[0046] 采用本領(lǐng)域公知的技術(shù)進(jìn)行組織蛋白的提取、組織蛋白SDS-PAGE和 Westernblot、免疫組化檢測(cè)、ELISA檢測(cè)人血清中的CHIP表達(dá)水平。其中CHIP蛋白的 ELISA試劑盒購(gòu)自武漢華美生物有限公司，試劑盒號(hào)CBS-EL022887HU。
[0047] 免疫組化結(jié)果的判定如下：
[0048] 按染色陽性細(xì)胞百分比分為四個(gè)等級(jí)
[0049] -陰性
[0050] +< 30%陽性細(xì)胞數(shù)
[0051] ++30-60%陽性細(xì)胞數(shù)
[0052] +++>60%陽性細(xì)胞數(shù)
[0053] 以陽性細(xì)胞百分比為60%分為CHIP低表達(dá)和CHIP高表達(dá)兩組。評(píng)分由兩位病理 科醫(yī)師獨(dú)立完成。
[0054] 統(tǒng)計(jì)分析：
[0055] 對(duì)于計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)（Chi-square test)或Fisher精確檢驗(yàn)；單因素分析 用Log-rank檢驗(yàn)組間生存曲線差異，多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析相對(duì)危險(xiǎn) 度；Kaplan-Meier法進(jìn)行生存時(shí)間分析；采用R0C曲線評(píng)估指標(biāo)的診斷價(jià)值以及診斷敏感 性和特異性。統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS13. 0,取p〈0. 05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。采用Graphpad Prism5. 0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)作圖。
[0056] 實(shí)施例3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0057] 1 )、SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)CHIP和Hsp70在胰腺癌和癌旁組織的表達(dá)水 平
[0058] 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CHIP在第一和第三例病人中的胰腺癌組織中表達(dá)水平是升高的，在第 二和第四例病人中表達(dá)水平明顯降低。Hsp70表達(dá)水平差別并不明顯，第一例和第三例患者 表達(dá)水平升高，第二例表達(dá)水平無明顯差異，第四例表達(dá)水平降低。（圖1)
[0059] 2)、免疫組化檢測(cè)CHIP蛋白在胰腺癌組織和癌旁組織的表達(dá)水平
[0060] CHIP蛋白表達(dá)主要在胞漿中，表現(xiàn)為淡黃色至深棕色。癌旁組織CHIP蛋白陰性表 達(dá)37例，有表達(dá)21例。癌組織陰性表達(dá)19例，有表達(dá)39例。胰腺癌組織中CHIP表達(dá)水 平明顯高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（P=〇. 001)。（圖2)
[0061] 3)、人胰腺癌組織中CHIP表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)系
[0062] 以陽性細(xì)胞百分比60%分為低表達(dá)和高表達(dá)組，進(jìn)行免疫組化染色進(jìn)行評(píng)分和統(tǒng) 計(jì)學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CHIP表達(dá)水平與N分期有相關(guān)性，p=0. 041，胰腺癌中低表達(dá)CHIP發(fā) 生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)是高表達(dá)CHIP發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的3. 06倍。另外，CHIP表達(dá)水平 也與術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，P=〇. 01，低表達(dá)CHIP發(fā)生術(shù)后轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)是高表達(dá)CHIP發(fā)生 術(shù)后轉(zhuǎn)移的4. 18倍。CHIP表達(dá)和性別、年齡、腫瘤部位、手術(shù)方式、腫瘤分化程度、是否根治 切除、T分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、術(shù)后是否復(fù)發(fā)并無相關(guān)性。
[0063] 表1胰腺癌組織CHIP蛋白表達(dá)水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性
[0064]

【權(quán)利要求】
1. CHIP蛋白標(biāo)志物在制備用于診斷膜腺癌患者的試劑盒中的用途。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述的CHIP蛋白標(biāo)志物作為區(qū)分正常人、慢性胰腺炎 和胰腺癌患者的有效的血清學(xué)標(biāo)志物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述的CHIP蛋白標(biāo)志物作為區(qū)分正常人、胰腺良性腫 瘤和胰腺癌患者的有效的血清學(xué)標(biāo)志物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述的CHIP蛋白標(biāo)志物作為區(qū)分胰腺良性腫瘤、胰腺 內(nèi)分泌腫瘤與正常人的有效的血清學(xué)標(biāo)志物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的用途，其中將所述試劑盒用于ELISA方法中。
6. -種CHIP蛋白在制備用于評(píng)估胰腺癌患者預(yù)后的試劑盒中的用途。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其中CHIP蛋白高表達(dá)患者預(yù)后相對(duì)較好。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104142403SQ201310172510
【公開日】2014年11月12日 申請(qǐng)日期:2013年5月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月10日
【發(fā)明者】趙玉沛, 張?zhí)? 王天笑, 由磊, 周立, 廖泉, 戴夢(mèng)華, 舒紅, 徐建威, 李建, 曹喆 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院