專利名稱：用于測(cè)定缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的測(cè)試系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于評(píng)估哺乳動(dòng)物(包括人)中的細(xì)胞損傷，例如由缺氧缺血引起的細(xì)胞損傷的測(cè)試系統(tǒng)，其包含具有樣品收集部分及血漿分離裝置的一次性裝置(disposable device)。
背景技術(shù)：
可以通過測(cè)定自收集樣品獲得的體液內(nèi)的總?cè)樗崦摎涿?LDH)來(lái)完成哺乳動(dòng)物中缺氧(氧缺乏)的評(píng)估。與別的預(yù)后標(biāo)志物天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和乳酸鹽組合測(cè)量LDH的總量揭示了關(guān)于部分或完全氧缺乏的哺乳動(dòng)物狀態(tài)，該信息可以支承進(jìn)一步醫(yī)學(xué)作用的決定。期望缺氧檢出的醫(yī)學(xué)情況的例子很多，并且包括嬰兒的圍產(chǎn)期和新生兒監(jiān)測(cè)、急救室中的傷員檢別分類(triage)、手術(shù)、移植或其它醫(yī)學(xué)方法 或手術(shù)處理。明顯地，期望的是，快速實(shí)施所述生物標(biāo)志的檢測(cè)，從而盡可能快速地采取足夠的措施來(lái)避免由于缺氧所致的永久性損傷。測(cè)定缺氧的方法披露于申請(qǐng)no. US12/101, 470，其中可能與K、Mg、Ca、AST、ALT和乳酸鹽之任一組合測(cè)量患者血漿中的總LDH，而且其中一種或多種這些標(biāo)志物的數(shù)值增加指示患者中的缺氧。還披露了與用于快速定量和/或定性測(cè)定所提及的標(biāo)志物的裝置組合使用血漿分離裝置。一種測(cè)定依照US12/101，470的預(yù)后標(biāo)志物水平的方式是通過排布(arrange)有干化學(xué)手段(means)的視覺檢測(cè)?？捎脺y(cè)量LDH水平的各種其它方式，其中許多基于通過與試劑和染料的化學(xué)反應(yīng)引起的視覺檢測(cè)。US4056485發(fā)現(xiàn)測(cè)定某些酶的效用，所述酶引起無(wú)色的2_(對(duì)-碘苯基)-3-(對(duì)-硝基苯)-5-苯基氯化四唑(INT)還原成鮮紅色I(xiàn)-(對(duì)-碘苯基)-5-(對(duì)-硝基苯)-3-苯基甲月替(phenylformazan) (INT甲月聲)。US4056485中披露的有色參照標(biāo)準(zhǔn)水溶液在500納米具有吸光度最大值，并且適合于用于測(cè)定例如血清乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸磷酸激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、磷酸腺苷、葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、6-磷酸葡萄糖酸鹽
坐寸o與目前用于測(cè)量生物標(biāo)志的方法有關(guān)的一般問題是它們經(jīng)常需要訪問具有測(cè)量感興趣標(biāo)志物的可能性的中心實(shí)驗(yàn)室，這意味著在一些情況中接受測(cè)試結(jié)果的時(shí)間變?yōu)殚L(zhǎng)得不期望。在許多地方，甚至沒有中心實(shí)驗(yàn)室，并且設(shè)立一個(gè)會(huì)需要大量的投資成本?！N中心實(shí)驗(yàn)室的備選是小的測(cè)量?jī)x,例如利用測(cè)試條(testing strip)和測(cè)量?jī)x諸如小的足跡(foot-print)儀或手持式分光光度計(jì)。此類設(shè)備是昂貴的，并且通常需要操作者管理并解讀讀取結(jié)果兩者的某種能力?？紤]全球前景，許多國(guó)家缺乏適當(dāng)運(yùn)行且先進(jìn)的醫(yī)學(xué)治療系統(tǒng)，并且高技術(shù)解決辦法可能不適用，這是由于缺乏經(jīng)濟(jì)資源，或者僅由于缺乏能夠?qū)嵤┐祟悳y(cè)試的內(nèi)科醫(yī)生或健康護(hù)理提供者所致。即使在開發(fā)的醫(yī)學(xué)護(hù)理系統(tǒng)的情況中，存在著如下的情況，其中長(zhǎng)的研制周期(lead time)和/或復(fù)雜的測(cè)試裝置不是期望的，特別地若時(shí)間是至關(guān)重要的，并且僅醫(yī)學(xué)狀況的適應(yīng)癥便足以繼續(xù)進(jìn)行患者的適當(dāng)治療。
鑒于上文，需要可適用于各種醫(yī)學(xué)情況(其中時(shí)間是至關(guān)重要的，并且對(duì)患者狀態(tài)的快速評(píng)估對(duì)于進(jìn)一步醫(yī)學(xué)治療是有價(jià)值的)的護(hù)理點(diǎn)(point-of-care)測(cè)試方法。發(fā)明的目的本發(fā)明的主要目的是提供評(píng)估各種醫(yī)學(xué)情況期間的缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的改善方式，此類改善包括提供快速且用戶友好的測(cè)試，優(yōu)選地床邊測(cè)試，其是小的，優(yōu)選地不依賴于任何儀器，而且其提供一種幾乎即時(shí)檢測(cè)指示哺乳動(dòng)物中的缺氧的水平升高的選定生物標(biāo)志的方式。從以下描述和權(quán)利要求書看，本發(fā)明的其它目的會(huì)變得明顯。發(fā)明概述本發(fā)明的目的是通過用于評(píng)估哺乳動(dòng)物，包括人中的缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的測(cè)試系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，所述測(cè)試系統(tǒng)包含具有用分離裝置排布的樣品入口和收集室的一次性裝置，其中收集室與至少兩個(gè)(第一和第二)可見檢測(cè)區(qū)室連接，其中的至少一個(gè)排布有用于直接檢測(cè)的化學(xué)手段，所述第一檢測(cè)區(qū)室排布為測(cè)定自所述哺乳動(dòng)物采集的體液樣品中的血紅蛋白(ffi)量是否超過預(yù)定的水平，并且所述第二檢測(cè)區(qū)室排布為依靠所述化學(xué)手段評(píng)估所述樣品中的乳酸脫氫酶(LDH)的總量水平。本發(fā)明的目的也是通過評(píng)估哺乳動(dòng)物中的缺氧(hypoxia)誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)的，所述方法包括下列步驟提供包含諸如血細(xì)胞等顆粒的來(lái)自哺乳動(dòng)物的體液樣品，隨后依靠分離裝置分開所述顆粒與所述體液樣品，使所述分開的體液與化學(xué)手段接觸以直接檢測(cè)，并測(cè)定所述體液中的量是否高于或低于預(yù)定的閾值。若Hb的量低于所述閾值，則評(píng)估體液中的乳酸脫氫酶(LDH)的總量水平，并通過評(píng)估所述體液中的LDH水平來(lái)評(píng)估缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的風(fēng)險(xiǎn)和/或存在。在本說(shuō)明書中，“LDH”指乳酸脫氫酶(不是其同工酶)的總量。體液樣品可以為全血樣品、血清、血漿、尿液、腦脊液(CSF)、腹膜內(nèi)流體、或唾液形式，然而，下文呈現(xiàn)的例子主要涉及測(cè)試血液樣品。應(yīng)當(dāng)理解，術(shù)語(yǔ)“血液樣品”可以解釋為其它類型的體液，如先前所提及的。通過提供微升體積血液樣品，并使用所述發(fā)明就選定的預(yù)后生物標(biāo)志而言視覺分析它，提供了如下的測(cè)試系統(tǒng)，其是快速的、容易使用、容易解讀，而且其可以以小的獨(dú)立的一次性單元向醫(yī)學(xué)從業(yè)人員銷售，所述醫(yī)學(xué)從業(yè)人員可以在與治療患者的立即聯(lián)系中使用它們，無(wú)論治療是手術(shù)、傷員檢別分類還是監(jiān)測(cè)情況。 術(shù)語(yǔ)缺氧意指可以由缺血或不充分的氧合或重度貧血引起的部分或完全氧缺乏。缺氧可以或不可導(dǎo)致物理?yè)p傷，并且對(duì)缺氧的身體應(yīng)答隨患者是誰(shuí)而不同。例如，在出生期間或接近出生受到缺氧的嬰兒中，身體會(huì)自“不太重要的”器官再分配血流以有利于腦、心臟和腎上腺。另一方面，成人在不受損傷的情況中不能耐受相同水平的缺氧。嚴(yán)重得足以損傷細(xì)胞的缺氧會(huì)導(dǎo)致進(jìn)入循環(huán)的酶泄露，并且最終細(xì)胞會(huì)死亡，這進(jìn)一步增加血流中的酶濃度?？梢杂糜谠u(píng)估缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的酶和預(yù)后標(biāo)志物是LDH、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、乳酸鹽、肌酸激酶(CK)、K、Mg和Ca。在本申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ)缺氧指嚴(yán)重得足以產(chǎn)生細(xì)胞損傷的氧缺乏。 依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，如下實(shí)施哺乳動(dòng)物中的缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的評(píng)估，即首先提供來(lái)自哺乳動(dòng)物(包括人)的血液樣品，并在測(cè)試系統(tǒng)的樣品入口上應(yīng)用血液樣品以經(jīng)由所述血漿分離裝置來(lái)分開紅細(xì)胞與血漿。接著，產(chǎn)生在所述一次性裝置內(nèi)部的負(fù)壓以將血漿轉(zhuǎn)移通過血漿分離裝置，并進(jìn)一步進(jìn)入至少第一和第二檢測(cè)區(qū)室，在那里血漿接觸其中布置的試劑。以對(duì)要檢測(cè)的標(biāo)志物(例如Hb，LDH)特異性的試劑組合物制備每個(gè)檢測(cè)區(qū)室。血漿中的標(biāo)志物與檢測(cè)區(qū)室中布置的試劑組合物(即，化學(xué)手段)間的化學(xué)反應(yīng)引起可見的顏色轉(zhuǎn)變，這意味著比色分析是有可能的。例如，在Hb的情況中，若樣品中的Hb水平超過某個(gè)預(yù)定的水平，則可以有顏色的變化，否則不會(huì)發(fā)生顏色轉(zhuǎn)變。優(yōu)選地，在LDH的情況中，若標(biāo)志物水平低于預(yù)定的水平，則在相應(yīng)的檢測(cè)區(qū)室中不會(huì)發(fā)生顏色轉(zhuǎn)變。若標(biāo)志物水平高于預(yù)定的水平，則會(huì)發(fā)生顏色變化，優(yōu)選地但不必然地，所述顏色變化與存在于所測(cè)試的血漿中的標(biāo)志物量成比例。優(yōu)選地，每個(gè)檢測(cè)區(qū)室是可見的，這意味著操作者或健康護(hù)理提供者會(huì)清楚地看出反應(yīng)是否正在其中發(fā)生，而且如此可以分別視覺測(cè)定血漿中的和LDH的存在。樣品中高于預(yù)定水平的的存在指示溶血，并且因?yàn)榧t細(xì)胞比血清含有多多至150倍的LDH，所以溶血是錯(cuò)誤的來(lái)源。如此，在高于所述預(yù)定水平的Hb存在的情況中，需要再進(jìn)行測(cè)試。若尚未發(fā)生溶血，則通過視覺比色檢測(cè)血漿中的LDH來(lái)評(píng)估缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的存在。依照本發(fā)明的一個(gè)方面，可以通過與標(biāo)準(zhǔn)化的參照間隔或顏色表比較來(lái)解讀由于高于預(yù)定水平的標(biāo)志物的存在所致的顏色變化，將其校正以定量讀取標(biāo)志物量。例如，可以依照呈現(xiàn)升高的顏色強(qiáng)度的量表形式(其中不太強(qiáng)烈的顏色(例如淡紫色)對(duì)應(yīng)于較低濃度的LDH，而較強(qiáng)烈的顏色(例如暗紫色)對(duì)應(yīng)于較高濃度的LDH)的標(biāo)準(zhǔn)化參照間隔指示樣品中的LDH量。依照現(xiàn)有技術(shù)，比較標(biāo)志物與試劑組合物間反應(yīng)后的顏色與標(biāo)準(zhǔn)的參照量表，由此可以評(píng)估樣品中的標(biāo)志物水平。明顯地，有可能提供呈現(xiàn)不同顏色的標(biāo)準(zhǔn)化參照間隔，其中例如顏色紅色指示低濃度的標(biāo)志物，而紫色指示較高的濃度。依照本發(fā)明的另一方面，將標(biāo)準(zhǔn)化的參照間隔分成有限數(shù)目的顏色部分，每個(gè)部分呈現(xiàn)與標(biāo)志物的某個(gè)間隔對(duì)應(yīng)的顏色強(qiáng)度。這樣，獲得用于評(píng)估標(biāo)志物水平的基于步進(jìn)式(step-wise)的參照量表，可以證明其可用于期望關(guān)于標(biāo)志物水平的更為詳細(xì)的信息的情況。如下測(cè)量Hb水平也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，即試劑組合物在被樣品接觸時(shí)逐漸改變顏色，然而，清楚地指示與預(yù)設(shè)的閾值對(duì)應(yīng)的顏色強(qiáng)度保證正當(dāng)?shù)亟庾x測(cè)試結(jié)果。依照本發(fā)明的又一方面，意圖用于評(píng)估溶血的檢測(cè)區(qū)室沒有任何化學(xué)手段或試齊U。溶血的評(píng)估取而代之僅通過視覺觀察過濾的樣品，優(yōu)選地血漿(其存在于檢測(cè)區(qū)室內(nèi))，并基于所述血漿的顏色(或色彩)來(lái)測(cè)定溶血已經(jīng)發(fā)生與否來(lái)實(shí)現(xiàn)。一般地，若血漿是透明的，則尚未發(fā)生溶血，但是若血漿是粉紅色或暗粉紅色的，則可以懷疑溶血，并且應(yīng)當(dāng)再進(jìn)行測(cè)試。為了便于評(píng)估溶血，可以給測(cè)試系統(tǒng)提供意圖用于與血漿顏色比較的參照顏色表，其包含相應(yīng)檢測(cè)區(qū)室附近清楚表明的指示溶血的粉紅色陰影。應(yīng)當(dāng)理解，此類參照顏色表可以與一次性裝置整合，但是它可以同樣以與一次性裝置一起投遞的測(cè)試系統(tǒng)的獨(dú)立部分提供。在其最不復(fù)雜的形式中，本發(fā)明的測(cè)試系統(tǒng)可以僅包含陽(yáng)性-陰性參照。依照此類實(shí)施方案，為每種標(biāo)志物設(shè)置預(yù)定的水平，并且每個(gè)檢測(cè)區(qū)室內(nèi)的試劑組合物排布為在所述預(yù)定的水平轉(zhuǎn)變/改變顏色，從而醫(yī)學(xué)從業(yè)人員僅會(huì)已知選定標(biāo)志物的量是否低于或、等于/高于預(yù)設(shè)的水平。此類測(cè)試系統(tǒng)在其足以指示缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷風(fēng)險(xiǎn)時(shí)可以是有利的。依照本發(fā)明的又一方面，檢測(cè)區(qū)室排布有干化學(xué)手段或濕化學(xué)手段形式的化學(xué)手段。依照本發(fā)明的一方面，每個(gè)檢測(cè)區(qū)室排布有針對(duì)某種預(yù)后標(biāo)志物，諸如LDH和Hb的化學(xué)手段。用排布為與一種此類標(biāo)志物起反應(yīng)的試劑組合物制備每個(gè)檢測(cè)區(qū)室。根據(jù)特定測(cè)試系統(tǒng)的設(shè)計(jì)，試劑組合物可以是干化學(xué)手段或濕化學(xué)手段。依照本發(fā)明的一個(gè)方面，用于檢測(cè)LDH的試劑組合物可以包含四唑化合物形式的試劑，優(yōu)選地選自下組I-(對(duì)-碘苯基(jodofenyl)) -5-(對(duì)-硝基苯(nitrofenyl)) _3_苯基甲S替(fenylformazan) (INT)和3_ (4，5_ 二甲基噻唑-I-基)_5_ (3_羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鹽(MTS)，它們都是用于比色測(cè)試系統(tǒng)的公知物質(zhì)。優(yōu)選地，試劑組合物還包含吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulphate, PMS)或I-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯(mPMS)及乳酸鹽和NAD+形式的介質(zhì)(mediator)。依照一個(gè)例子，用于檢測(cè)LDH的試劑組合物包含包含N-甲基-D-葡萄糖胺的緩沖液中的四唑化合物(NBT)。優(yōu)選地，檢測(cè)區(qū)室內(nèi)部的pH是8-11，優(yōu)選地8. 5-10. 5，甚至更優(yōu)選地9-10. 5，以優(yōu)化發(fā)生最佳酶反 應(yīng)的條件。LDH的試劑組合物在實(shí)施例1-4中進(jìn)一步例示。依照本發(fā)明的一個(gè)方面，用于檢測(cè)Hb的試劑組合物可以包含聯(lián)苯胺化合物形式的試劑，優(yōu)選地選自下組四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和3，3’ - 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)。用于Hb的試劑組合物可以進(jìn)一步包含過氧化物底物，優(yōu)選地選自下組過氧化氫、和叔-丁基過氧化氫(T-hydro)。優(yōu)選地，用于Hb的檢測(cè)區(qū)室5A內(nèi)部的pH是3_7，優(yōu)選地4. 5-5. 5。用于Hb的試劑組合物在實(shí)施例5-6中進(jìn)一步例示。依照本發(fā)明的一個(gè)方面，濕化學(xué)手段在一次性裝置內(nèi)在濕試劑的貯存排布內(nèi)部，例如在反應(yīng)孔中或在泡罩包裝排布中布置。依照一方面，泡罩包裝排布設(shè)計(jì)為在啟動(dòng)測(cè)試系統(tǒng)使用時(shí)破裂或被弄裂，例如在將樣品加載于一次性裝置之前或之后依靠手工破裂。例如，用戶可以針對(duì)一次性裝置表面在導(dǎo)致泡罩包裝壓縮及其破裂的位置擠壓來(lái)實(shí)施手工破裂。泡罩包裝的破裂導(dǎo)致化學(xué)手段被釋放，并且可以被要測(cè)試的樣品接觸。由于此方面，可以加速試劑化學(xué)組分與樣品內(nèi)可能的標(biāo)志物間的反應(yīng)。依照本發(fā)明的又一方面，一次性裝置包含卡片(card)上排布的超過兩個(gè)檢測(cè)區(qū)室，優(yōu)選地所述區(qū)室的每一個(gè)排布有試劑組合物形式的化學(xué)手段。優(yōu)選地，超過兩個(gè)檢測(cè)區(qū)室各包含用于直接視覺檢測(cè)由下列預(yù)后標(biāo)志物組成的組的一個(gè)成員的化學(xué)手段ffi、LDH、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、乳酸鹽、肌酸激酶(CK)、K、Mg和Ca。優(yōu)選地，每個(gè)裝置包含兩個(gè)分別檢測(cè)Hb和LDH的檢測(cè)區(qū)室，和任選地一個(gè)或多個(gè)用于檢測(cè)AST、ALT、乳酸鹽、CK、K、Mg和Ca之一種或多種的檢測(cè)區(qū)室。依照本發(fā)明的又一方面，測(cè)試系統(tǒng)包含用于在所述一次性裝置內(nèi)部產(chǎn)生負(fù)壓的手段，其用于促使來(lái)自體液樣品的血漿進(jìn)入到所述分離裝置并進(jìn)入所述至少兩個(gè)檢測(cè)區(qū)室。附圖簡(jiǎn)述下文會(huì)參照附圖更為詳細(xì)地描述本發(fā)明的測(cè)試系統(tǒng)和方法。應(yīng)當(dāng)認(rèn)為以下描述僅是優(yōu)選的形式，而在限制的意義上不是決定性的。圖IA呈現(xiàn)了依照本發(fā)明的一個(gè)例子的測(cè)試系統(tǒng)的示意性平面視圖，
圖IB呈現(xiàn)了依照?qǐng)DIA的測(cè)試系統(tǒng)的橫截面?zhèn)纫晥D，圖IC呈現(xiàn)了包含負(fù)壓產(chǎn)生裝置的測(cè)試系統(tǒng)的示意性平面視圖，圖2A-B呈現(xiàn)了依照本發(fā)明的另一個(gè)例子的測(cè)試系統(tǒng)，圖3呈現(xiàn)了依照本發(fā)明的又一個(gè)例子的測(cè)試系統(tǒng)，圖4A呈現(xiàn)了具有分開的毛細(xì)管樣品收集器的依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的測(cè)試系統(tǒng)的透視圖,和圖4B呈現(xiàn)了包含整合毛細(xì)管樣品收集器的測(cè)試系統(tǒng)的透視圖。發(fā)明詳述在以下詳細(xì)描述中，會(huì)參照例示依照本發(fā)明的測(cè)試系統(tǒng)I的多個(gè)實(shí)施方案的圖。然而，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明還涉及用于評(píng)估哺乳動(dòng)物中的缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的方法，并且結(jié) 合測(cè)試系統(tǒng)I公開的許多特征也適用于相應(yīng)的方法。在圖IA-B中，顯示了依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的測(cè)試系統(tǒng)1，其包含一次性裝置2，優(yōu)選地其排布有許多不同檢測(cè)區(qū)室5A-C，如稍后會(huì)更為詳細(xì)地解釋的。在圖IA中示意性顯示了測(cè)試系統(tǒng)I的平面視圖，所述測(cè)試系統(tǒng)I包含具有樣品收集部分的筒式裝置(cartridge device) 2形式的本文中的扁平狀體，所述樣品收集部分具有用于接收自哺乳動(dòng)物采集的體液9樣品，例如全血的樣品入口 4。如圖IB中示意性呈現(xiàn)的，給一次性筒式裝置2提供接收室6，其適合于與供應(yīng)自哺乳動(dòng)物采集的體液9樣品的毛細(xì)管樣品收集器7相配。在與接收室6的連接中，在其底部，存在著以本身已知的方式保護(hù)體液樣品進(jìn)一步轉(zhuǎn)運(yùn)至分離裝置3的界面，所述分離裝置包含濾膜(filter)31和收集室32。圖IA中的濾膜31包含環(huán)狀的形狀，并且具有3mm2至500mm2，優(yōu)選地小于150mm2的面積。應(yīng)當(dāng)理解，濾膜31的合適的面積取決于期望的樣品體積，并且因此，可以相應(yīng)地調(diào)節(jié)濾膜面積31。優(yōu)選地經(jīng)由微射流通道(microf luidic channel) 33將收集室32與至少兩個(gè)，即第一 5A和第二5B可見檢測(cè)區(qū)室連接，其中的至少一個(gè)，但是可能兩者排布有用于直接檢測(cè)，優(yōu)選地直接視覺檢測(cè)至少一種預(yù)后生物標(biāo)志LDH的化學(xué)手段。排布為測(cè)定樣品9’中的血紅蛋白(Hb)水平或量的檢測(cè)5A區(qū)室可以或不可排布有化學(xué)手段?？梢酝ㄟ^觀察進(jìn)入相應(yīng)區(qū)室的血漿的色彩來(lái)評(píng)估溶血，在該情況中，化學(xué)手段可以是不必需的。然而，也有可能用化學(xué)手段檢測(cè)Hb。在血漿收集室32和檢測(cè)區(qū)室5A-C間，可以給微射流通道33提供樣品分流器34以將血漿9’引導(dǎo)入不同檢測(cè)區(qū)室5A-C之每一個(gè)。依照一個(gè)例子，第一檢測(cè)區(qū)室5A排布為測(cè)定體液樣品中的血紅蛋白(Hb)水平是否超過預(yù)定的水平(閾值)，而第二檢測(cè)區(qū)室5B排布為評(píng)估所述樣品中的乳酸脫氫酶(LDH)的總量水平。如圖IA中用點(diǎn)線指示的，一次性裝置2可以包括與收集室32連接的超過兩個(gè)檢測(cè)區(qū)室5A-C，其中區(qū)室5A-C包含試劑組合物形式的化學(xué)手段，其會(huì)與預(yù)后標(biāo)志物(若存在的話)起反應(yīng)，從而發(fā)生顏色轉(zhuǎn)變，所述顏色轉(zhuǎn)變?cè)诳梢姽庾V內(nèi)，從而它可以容易地通過人眼觀察。應(yīng)當(dāng)理解，可見光譜指可以通過人眼檢測(cè)的電磁譜部分，其通常范圍為380nm_750nm。依照本發(fā)明，測(cè)試系統(tǒng)I實(shí)現(xiàn)對(duì)選自下組的標(biāo)志物的直接視覺檢測(cè)Hb、LDH、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、乳酸鹽、CK、K、Mg和Ca。實(shí)際上，僅測(cè)試LDH和Hb的裝置2在一些應(yīng)用中可以是足夠的。
然而，也有可能依靠分光光度檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)讀取結(jié)果(即顏色轉(zhuǎn)變)。應(yīng)當(dāng)理解，可以依照本發(fā)明的測(cè)試系統(tǒng)容易地分析除了血液樣品外或作為血液樣品的補(bǔ)充的體液樣品，例如尿液、腦脊液(CSF)或唾液。所述分離裝置3會(huì)清除樣品，分開在其它情況中可以干擾分析的不想要的顆?；蚱涑练e物。如例如在圖IA-B中顯示的，一次性裝置2為長(zhǎng)方形筒形式，然而，裝置的形狀對(duì)于本發(fā)明不是至關(guān)重要的，并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地選擇適合于給定應(yīng)用的形狀或設(shè)計(jì)。可以使用諸如注射成型或成層等方法自諸如透明塑料，如環(huán)烯烴(COC)、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)或聚甲基丙烯酸甲酯S(PMMA)等材料構(gòu)建裝置2。然而，優(yōu)選的是，裝置2的尺寸為使得它是便攜的，并且小得足以能夠被操作者舒適地手持。所述一次性裝置2是便攜的，并且具有3-15cm，優(yōu)選地5-10cm的長(zhǎng)度1，0. 5_5cm，優(yōu)選地2_4cm的寬度W和0. l_3cm，優(yōu)選地0. 2-2. 5cm的厚度d。優(yōu)選地，所述一次性裝置2具有5_50g的重量?，F(xiàn)在會(huì)描述測(cè)試系統(tǒng)I的用途。
首先，優(yōu)選地但不必然依靠裝滿總計(jì)例如約50 y L的全血的毛細(xì)管裝置7來(lái)提供來(lái)自哺乳動(dòng)物的體液樣品，諸如全血樣品。在連續(xù)步驟中，將毛細(xì)管裝置7插入筒2的區(qū)室6以使血液樣品9與一次性裝置2形成界面，將血液樣品9放置于血漿分離裝置3的濾膜31上。技術(shù)人員理解，使用毛細(xì)管樣品收集器7或其它類型的樣品收集器將流體樣品9應(yīng)用于筒2的許多方式是有可能的。例如，可以將樣品9直接應(yīng)用于濾膜31上，例如依靠釋放其上的樣品體積的移液管形式的樣品收集器。如此，還應(yīng)當(dāng)理解，筒2的設(shè)計(jì)可以使得濾膜3 I排布于筒2的上表面，其被暴露為使得可以將樣品體積9直接在其上釋放。依靠負(fù)壓產(chǎn)生裝置14來(lái)產(chǎn)生負(fù)壓(見

圖1C)，由此引起血液樣品9被吸到濾膜31，在其上面濾出選定的顆粒，特別是紅細(xì)胞。樣品的血清(血漿)通過濾器31，并在收集室32內(nèi)收集，并且繼續(xù)進(jìn)一步通過微射流通道33，進(jìn)入沉積有試劑的不同檢測(cè)區(qū)室5A-C。血清內(nèi)存在的預(yù)后生物標(biāo)志會(huì)與沉積的試劑起反應(yīng)，引起相應(yīng)區(qū)室內(nèi)的顏色轉(zhuǎn)變，其可以被用戶檢出以評(píng)估接受樣品接受的哺乳動(dòng)物(例如人)中的缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。因此，本發(fā)明的方法包括下列步驟-提供包含諸如血細(xì)胞等顆粒的來(lái)自哺乳動(dòng)物的體液樣品，-依靠分離裝置分開所述顆粒與所述體液樣品，-使所述分開的體液與化學(xué)手段接觸以直接檢測(cè)，-測(cè)定所述體液中的Hb量是否高于或低于預(yù)定的閾值，及Hb的量是否低于所述閾值-評(píng)估所述體液中的乳酸脫氫酶(LDH)的總量水平，并通過評(píng)估所述體液中的LDH水平來(lái)評(píng)估缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的風(fēng)險(xiǎn)和/或存在。應(yīng)當(dāng)理解，依照本發(fā)明的方法可以依靠依照本發(fā)明的測(cè)試系統(tǒng)I (例如，包含一次性裝置2，其具有濾膜31和檢測(cè)區(qū)室5A-C)來(lái)實(shí)施，但是實(shí)施方法的其它方法也是想得到的。例如，預(yù)見的是醫(yī)學(xué)從業(yè)人員可以在反應(yīng)孔中分配過濾的液體樣品9’，隨后添加試劑組合物，其可以例如在一次性劑量容器中投遞。在圖IC中，顯示了測(cè)試系統(tǒng)I的一個(gè)例示性實(shí)施方案，提供了用于在所述收集室32內(nèi)部產(chǎn)生負(fù)壓的手段14，其用于促使來(lái)自體液樣品的血漿進(jìn)入到所述分離裝置3并進(jìn)入所述至少兩個(gè)檢測(cè)區(qū)室5A-B。
依照本發(fā)明的一個(gè)方面，所述手段14是手工可調(diào)動(dòng)的，并且排布為在收集室32和微射流通道33內(nèi)部產(chǎn)生負(fù)壓，例如包含可密封排氣孔142的壓縮式膜盒式泵(bellowspump) 14。依照本文中所顯示的實(shí)施方案，負(fù)壓產(chǎn)生裝置14與筒2整合，并且經(jīng)由微射流通道141A，141B與檢測(cè)區(qū)室5A-C連接。可以以如下方式實(shí)現(xiàn)筒式裝置2內(nèi)部的負(fù)壓產(chǎn)生。操作者針對(duì)筒式裝置2的表面在與負(fù)壓產(chǎn)生裝置14的位置對(duì)應(yīng)的，優(yōu)選地筒2表面上指示的位置推進(jìn)。由此空氣會(huì)經(jīng)由可密封排氣孔142自筒2的微射流通道33、141A、141B、81離開。在釋放負(fù)壓產(chǎn)生裝置14后，優(yōu)選地例如依靠包含單向閥(check valve)，或者由于用戶手動(dòng)密封孔142密封排氣孔142。這會(huì)導(dǎo)致負(fù)壓產(chǎn)生裝置14的釋放在筒式裝置2內(nèi)部產(chǎn)生負(fù)壓(例如通過再取其初始形狀的膜盒式泵實(shí)現(xiàn))，并且由此會(huì)促使微射流通道33、141A、141B、81內(nèi)部的流體移到測(cè)試系統(tǒng)I。給一次性裝置提供光學(xué)觀看區(qū)10A-C，藉此可以觀察相應(yīng)的檢測(cè)區(qū)室5A-C，這意味著可能的顏色轉(zhuǎn)變是用戶或健康護(hù)理提供者容易觀察到的。對(duì)于冊(cè)，優(yōu)選的是，只有在Hb水平超過預(yù)定的水平時(shí)會(huì)發(fā)生顏色轉(zhuǎn)變，所述水平設(shè)置為閾值，其中高于閾值的數(shù)值指示溶血。若區(qū)室5A (對(duì)于Hb)中觀察到顏色轉(zhuǎn)變，則測(cè)試是無(wú)效的，并且需要采用新測(cè)試。關(guān)于與針對(duì)Hb不同的檢測(cè)區(qū)室，顏色轉(zhuǎn)變指示標(biāo)志物的存在。關(guān)于試劑盒組合物的改編和設(shè)計(jì)解讀可能的顏色轉(zhuǎn)變的標(biāo)準(zhǔn)化參照量表，各種解決辦法是有可能的。依照一個(gè)例子，試劑組合物設(shè)置為只有在標(biāo)志物高于預(yù)定的濃度存在時(shí)才改變或轉(zhuǎn)變顏色。另一種選項(xiàng)是試劑組合物設(shè)置為隨濃度增加逐漸改變顏色密度，在該情況中顏色強(qiáng)度與體液中存在的標(biāo)志物量成比例。明顯地，有可能的是，只有在標(biāo)志物水平低于預(yù)設(shè)的限度時(shí)檢測(cè)區(qū)室是無(wú)色的，高于所述限度，顏色會(huì)隨標(biāo)志物濃度而出現(xiàn)程度不同的強(qiáng)度。比較顏色轉(zhuǎn)變強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)化參照量表或間隔，由此可以測(cè)定相應(yīng)標(biāo)志物的水平，并且評(píng)估缺氧風(fēng)險(xiǎn)。可以依照實(shí)際組合物的調(diào)節(jié)來(lái)設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)化參照量表，如本文中先前所描述的，這意味著它可以為許多不連續(xù)的顏色部分，優(yōu)選地至少兩個(gè)顏色部分的形式，其中通過比較任何檢測(cè)區(qū)室中的顏色轉(zhuǎn)變與給定的顏色部分來(lái)評(píng)估標(biāo)志物水平。結(jié)合圖2和3更為詳細(xì)地描述了標(biāo)準(zhǔn)化參照量表。應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)特定測(cè)試系統(tǒng)的設(shè)計(jì)，沉積于不同檢測(cè)區(qū)室中的化學(xué)手段可以為干化學(xué)手段或濕化學(xué)手段形式。在濕化學(xué)試劑的情況中，依照本發(fā)明的一個(gè)例示性的實(shí)施方案，每個(gè)檢測(cè)區(qū)室的試劑組合物可以放置于與每個(gè)檢測(cè)區(qū)室5A、5B連接的位于筒2內(nèi)的保護(hù)性泡罩包裝內(nèi)。在與依靠依照本發(fā)明的系統(tǒng)啟動(dòng)測(cè)試的連接中，泡罩包裝排布為破裂，如此釋放所述試劑組合物形式的內(nèi)容物。如此,引入的樣品9’會(huì)與濕試劑組合物混合，并且會(huì)開始反應(yīng)，倘若樣品包含相應(yīng)的標(biāo)志物?？梢允止?shí)現(xiàn)所述泡罩包裝的破裂，例如依靠用戶針對(duì)一次性裝置2的表面推進(jìn)，使得筒2內(nèi)部被壓縮得足以引起整合的泡罩破裂。此外，在干化學(xué)手段的情況中，選定的試劑在檢測(cè)區(qū)室內(nèi)部是干的。在流體樣品9’進(jìn)入相應(yīng)的區(qū)室時(shí)，干的試劑會(huì)開始溶解，使得可以開始反應(yīng)。為了便于反應(yīng)組分的再水合，優(yōu)選的是對(duì)干化學(xué)手段添加支持試劑。如先前所述的，檢測(cè)區(qū)室5A-C內(nèi)的試劑組合物與標(biāo)志物間的化學(xué)反應(yīng)引起顏色轉(zhuǎn)變，其警示操作者以缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的風(fēng)險(xiǎn)。為了保護(hù)測(cè)試系統(tǒng)I的穩(wěn)健性，期望檢、測(cè)區(qū)室5A-C內(nèi)部發(fā)生的反應(yīng)限于預(yù)定的時(shí)間跨度，從而所有測(cè)試單元是可比較。出于此原因，一次性裝置2可以包含具有反應(yīng)停止物(reaction-stopper)的區(qū)室8，所述反應(yīng)停止物用于在測(cè)試用戶已經(jīng)產(chǎn)生流體負(fù)壓后的預(yù)定時(shí)間時(shí)中斷生物標(biāo)志與反應(yīng)試劑間的反應(yīng)。這意味著自首先將血液樣品吸到濾膜31的點(diǎn)至反應(yīng)停止物中斷試劑與生物標(biāo)志間的反應(yīng)時(shí)的時(shí)間跨度總是相同的。如對(duì)于技術(shù)人員明顯的，有可能替代反應(yīng)停止物，設(shè)置定時(shí)器，并且在某個(gè)預(yù)定的時(shí)間后評(píng)估是否已經(jīng)發(fā)生任何顏色變化。圖IA中看出反應(yīng)停止物8的概述的例子，其中一次性裝置2包含如下的區(qū)室8，其含有適合于解讀酶活性的物質(zhì)或化合物，例如酸性或堿性溶液，如HC1、檸檬酸或NaOH。此夕卜，有可能使用各種表面活性劑或添加劑作為反應(yīng)停止物，例如已經(jīng)證明了十二烷基硫酸鈉(SDS)作為反應(yīng)停止物運(yùn)行良好。依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，在產(chǎn)生負(fù)壓時(shí)，反應(yīng)停止物會(huì)開始經(jīng)由微射流通道81流向檢測(cè)區(qū)室5B，其中其意圖停止反應(yīng)。微射流裝置81的長(zhǎng)度會(huì)決定反應(yīng)停止物達(dá)到 區(qū)室5B所花費(fèi)的時(shí)間。在圖IA中，微射流通道81是用于延長(zhǎng)停止反應(yīng)前的時(shí)間的蜿蜒樣通道，然而，許多其它調(diào)節(jié)通道81長(zhǎng)度的方式同樣有可能。明顯地，同樣有可能排布筒2，使得與試劑組合物混合的樣品9’會(huì)例如經(jīng)由微射流通道81在某個(gè)反應(yīng)時(shí)間后移到排布有固定的反應(yīng)停止物8的區(qū)室。在此類實(shí)施方案中，固定的反應(yīng)8停止物可以為干或濕的反應(yīng)停止物形式。圖IB以示意方式顯示了具有樣品入口 4的一次性裝置2的透明側(cè)視圖，所述樣品入口 4為與室6連接的樣品入口形式，所述室6改編為接受含有全學(xué)樣品9的毛細(xì)管裝置7，該毛細(xì)管裝置7排布為放置于血漿分離裝置3上。優(yōu)選地，樣品入口 4周圍有漏斗樣插入槽，其用于將毛細(xì)管樣品收集器7引導(dǎo)入室6。本文中進(jìn)一步看到所述光學(xué)觀看區(qū)10A，其容許觀察檢測(cè)區(qū)室5A-B內(nèi)部正在進(jìn)行中的反應(yīng)。在圖2A-B中呈現(xiàn)了依照本發(fā)明的一次性裝置2的例子。圖2A是從平面頂視圖看出，而圖2B是依照?qǐng)D2A中的IIB的截面視圖。依靠裝滿總計(jì)例如約50ii L的全血的毛細(xì)管裝置來(lái)給本文中的裝置2供應(yīng)測(cè)試血液9。根據(jù)患者和/或裝置2的特定設(shè)計(jì)(例如檢測(cè)區(qū)室的數(shù)目，通道大小等)，各種量的血液樣品是可想象的，并且有可能使用僅Iu L，或多達(dá)100 u L，優(yōu)選的量是25-75 u L。為了便于插入樣品，優(yōu)選地，將樣品入口 4周圍的區(qū)域凹下以將毛細(xì)管裝置7引導(dǎo)入室6中。在圖2A中，已經(jīng)將毛細(xì)管裝置7插入筒2的區(qū)室6中以使血液樣品9與筒2形成界面，并且將血液樣品9放置于血漿分離裝置3的濾膜3 I上。代替毛細(xì)管裝置7，想得到的是，依靠將樣品滴釋放到筒2上的標(biāo)記區(qū)域上的移液管來(lái)提供樣品9。手工產(chǎn)生負(fù)壓，并且推進(jìn)血漿通過濾膜31，并進(jìn)入血漿收集室32，自該血漿收集室32它繼續(xù)通過微射流通道33，并且分布到不同檢測(cè)區(qū)室5A-C中。如圖2B中看到的，測(cè)試系統(tǒng)包含光學(xué)觀看區(qū)10B，因?yàn)槊總€(gè)檢測(cè)區(qū)室5B上方的一次性裝置2的至少部分10A-C是透明的，這意味著每個(gè)檢測(cè)區(qū)室5B是可見的，并且可以在正在進(jìn)行中的反應(yīng)期間觀察。依照一個(gè)實(shí)施方案，用于試劑組合物制備每個(gè)檢測(cè)區(qū)室5A-C，所述試劑組合物排布為與下列預(yù)后標(biāo)志物之一起反應(yīng)LDH、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、乳酸鹽、CK、K、Mg和Ca。優(yōu)選地，每個(gè)裝置2包含至少兩個(gè)分別用于檢測(cè)Hb和LDH的檢測(cè)區(qū)室5A-B，和任選地一個(gè)或多個(gè)用于檢測(cè)AST、ALT、乳酸鹽、CK、K、Mg和Ca之一種或多種的檢測(cè)區(qū)室。在預(yù)定的時(shí)間跨度后，通過反應(yīng)停止物來(lái)中斷反應(yīng)，并由測(cè)試系統(tǒng)I的用途視覺檢測(cè)任何顏色轉(zhuǎn)變。從應(yīng)用圖2A中的血液樣品到測(cè)試2C中的測(cè)試結(jié)果的總時(shí)間小于5分鐘，但是優(yōu)選地在2分鐘內(nèi)。圖2A呈現(xiàn)了已經(jīng)在檢測(cè)區(qū)室5A-C內(nèi)發(fā)生可能的反應(yīng)后的測(cè)試系統(tǒng)的平面視圖。為了測(cè)定預(yù)后標(biāo)志物的水平，將每個(gè)檢測(cè)區(qū)室5A-C中的顏色轉(zhuǎn)變(若有的話)與標(biāo)準(zhǔn)參照間隔比較，所述標(biāo)準(zhǔn)參照間隔優(yōu)選地與測(cè)試系統(tǒng)一起提供。依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，給緊鄰每個(gè)檢測(cè)區(qū)室5A-C的區(qū)域提供許多參照顏色11，由此容易實(shí)施標(biāo)志物水平的評(píng)估。在這里，檢測(cè)區(qū)室5A排布為測(cè)定Hb的存在，而5B-C排布為測(cè)定或評(píng)估任何其它預(yù)后標(biāo)志物(LDH、AST、ALT、乳酸鹽、CK、K、Mg 或 Ca)水平。例如在圖2A中，例示了如下的情況，其中尚未在針對(duì)Hb的區(qū)室5A中發(fā)生顏色轉(zhuǎn)變，指示測(cè)試是無(wú)效的。已經(jīng)在區(qū)室5B中發(fā)生反應(yīng)，其顏色轉(zhuǎn)變對(duì)應(yīng)給定參照顏色11之一，而尚未在區(qū)室5C中發(fā)生明顯的反應(yīng)。優(yōu)選地，若顏色轉(zhuǎn)變已經(jīng)導(dǎo)致某種顏色強(qiáng)度，則指示測(cè)試系統(tǒng)I的用戶起反應(yīng)。此類指令可以結(jié)合例如符號(hào)形式的參照間隔標(biāo)記，所述符號(hào)指示代筆缺氧風(fēng)險(xiǎn)的參照間隔的一部分。在圖2A中，區(qū)室5B-C的標(biāo)準(zhǔn)參照11具有三個(gè)顏色部分，然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解更大數(shù)目的顏色部分是有可能的，以提高讀取的分辨率，以及有可能具有連續(xù)的顏色間隔，替代如本文中所顯示的不連續(xù)顏色部分。圖3中看出可能的參照間隔11的又一個(gè)例子，其中標(biāo)準(zhǔn)參照11僅具有兩個(gè)顏色部分，這意味著讀取會(huì)僅給用戶提供陽(yáng)性或陰性答案。參照標(biāo)準(zhǔn)的此類設(shè)計(jì)在有可能預(yù)設(shè)濃度限度(高于該濃度限度，總是要求采取醫(yī)學(xué)行動(dòng))的醫(yī)學(xué)情況中或在簡(jiǎn)單且快速的讀取比定量精確測(cè)量標(biāo)志物水平更重要的情況中是合適的。在4A-B中，呈現(xiàn)了依照本發(fā)明的其它例子的測(cè)試系統(tǒng)，其中代替具有筒式設(shè)計(jì)，一次性裝置2僅作為棒(stick)形成，所述棒具有伸長(zhǎng)的主體及兩個(gè)相反的短側(cè)21，21’。依照本例子，具有樣品入口 4的樣品入口排布于一次性裝置2的短側(cè)21 (結(jié)合圖4A-B，又稱為“測(cè)試棒2”)。本文中顯示了測(cè)試棒2的兩種設(shè)計(jì)。圖4A中示意性顯示的第一種測(cè)試棒2具有接受部分，其具有與圖1-2中呈現(xiàn)的室相似的室6。關(guān)于測(cè)試棒2的室6的一個(gè)特定的優(yōu)點(diǎn)在于它可以排布為接受整個(gè)毛細(xì)管裝置7，從而一旦它被插入室6中，毛細(xì)管7的部分無(wú)一延伸到棒2的外部。如此，使用的測(cè)試棒2可以作為一個(gè)實(shí)體處理，其從污染觀點(diǎn)看是有利的，因?yàn)槭褂玫那液醒旱拿?xì)管裝置無(wú)一會(huì)留下未被注意的和偶然破裂的開口。圖4B中示意性顯示了第二測(cè)試棒2，并且其包含整合的毛細(xì)管成員7，該毛細(xì)管成員7自一個(gè)短的末端21突出，并且與棒2內(nèi)部的血漿分離裝置3直接連接。如此，可以在不需要作為分開單元處理毛細(xì)管7的情況中將血液樣品9直接收集入裝置2中。有益地，本發(fā)明的方法和實(shí)施方案容許測(cè)定極其多種情況中的缺氧。例如，本發(fā)明的實(shí)施方案包括但不限于測(cè)定新生兒中的缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，其通過分析來(lái)自新生兒的血液，例如通過分析自臍帶提供的樣品來(lái)進(jìn)行。 本發(fā)明的方法和實(shí)施方案可以進(jìn)一步容許測(cè)定胃腸道(例如，結(jié)腸吻合)、特定器官(例如，肝和主動(dòng)脈)、來(lái)自腰引流(lumbar drain)的腦脊液、和要移植的器官中的缺氧。另外，本發(fā)明的實(shí)施方案實(shí)現(xiàn)評(píng)估和/或監(jiān)測(cè)自已知的和/或潛在垂危(criticallyill)的患者中(例如在潛在患有多器官功能障礙，例如涉及外傷、敗血癥、出血或廣泛手術(shù)的哺乳動(dòng)物中)的一種或多種器官系統(tǒng)的細(xì)胞泄漏，預(yù)測(cè)出生前窒息(低氧性缺血性腦病(hypoxic ischemic encephalopathy)，HIE)后的腦損傷，并監(jiān)測(cè)哺乳動(dòng)物的周圍血液循環(huán)。已經(jīng)證明了不同預(yù)后標(biāo)志物和預(yù)后標(biāo)志物的組合可用于評(píng)估不同醫(yī)學(xué)情況中的缺氧，如US2008/0213744中更為詳細(xì)描述的，在此將其收入本申請(qǐng)。LDH存在于所有身體組織中，并且是一般細(xì)胞損傷的理想標(biāo)志物。然而，通過與其它標(biāo)志物組合，臨床現(xiàn)象可以甚至更清楚。在下文中提供了特定醫(yī)學(xué)情況感興趣的標(biāo)志物的組合的幾個(gè)例子。LDH與器官特異性標(biāo)志物如ALT (對(duì)肝特異性)組合。 LDH與乳酸鹽和/或Mg組合，其是低氧性事件上的更急性標(biāo)志物，一般在整個(gè)生物體中或特定組織中注意。LDH與AST和ALT組合，它們都具有不同血漿半衰期，使該組合成為較早已經(jīng)發(fā)生的低氧性事件的潛在的暫時(shí)標(biāo)志物。在法醫(yī)學(xué)方面，在發(fā)生回顧調(diào)查時(shí)，在新生兒受到窒息損傷時(shí)。下文中，呈現(xiàn)了缺氧是一項(xiàng)嚴(yán)重憂慮的幾種醫(yī)學(xué)狀況，并且如此，依照本發(fā)明的測(cè)試系統(tǒng)會(huì)是有益的。在出生期間或接近出生，評(píng)估缺氧容許預(yù)測(cè)圍產(chǎn)期窒息和/或出生前窒息后腦損傷(例如HIE)。在預(yù)測(cè)的腦損傷的情況中，給新生兒童提供低溫治療，由此可以避免形成低氧性缺血性腦病(HIE)。由此提供了一種快速的且容易的鑒定有形成HIE危險(xiǎn)的嬰兒的方式，有時(shí)其可以挽救無(wú)數(shù)的來(lái)自腦損傷的兒童，尤其是在醫(yī)學(xué)護(hù)理系統(tǒng)目的先進(jìn)得不足以鑒定這些嬰兒的國(guó)家。在傷員檢別分類情況期間，目的是分類等待中的患者，從而大多數(shù)緊急的病例首先得到治療。通過測(cè)量一種或多種呈現(xiàn)的標(biāo)志物評(píng)估缺氧是一種能夠分類等待室中的患者的方式。在一個(gè)實(shí)施方案中，在醫(yī)學(xué)方法(procedure)前自感興趣位置收集第一參照血液樣品，并使用依照本發(fā)明的測(cè)試系統(tǒng)來(lái)分析預(yù)后標(biāo)志物。在完成醫(yī)學(xué)方法前，可以自感興趣的點(diǎn)獲得第二血液樣品，并以與初始樣品相同的方式分析?？梢员容^第一和第二樣品中預(yù)后標(biāo)志物的測(cè)定以評(píng)估缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的存在。在先前的實(shí)施方案中，分析了多種預(yù)后標(biāo)志物。此類實(shí)施方案包括測(cè)定參照和最終的血液樣品兩者中的至少Hb和LDH的量，和任選地一種或多種別的預(yù)后標(biāo)志物的量，所述預(yù)后標(biāo)志物選自基本上由K，Mg, Ca, AST, ALT, CK和乳酸鹽組成的組。因而，可以比較第一和第二樣品中的每種預(yù)后標(biāo)志物的相應(yīng)量以鑒定吻合的正確位置。在一個(gè)實(shí)施方案中，醫(yī)學(xué)方法包括胃腸道的吻合。在另一方面，本發(fā)明的實(shí)施方案可以降低移植療法后的患者中的發(fā)病率和死亡率。影響移植后的患者中的患病率和死亡率的關(guān)鍵因素之一涉及移植物，諸如肝移植中肝移植物的保存損傷(preservation injury)。例如，對(duì)灌注液的LDH、AST和ALT泄露是喪失干細(xì)胞膜完整性的指征。在一個(gè)此類實(shí)施方案中，用于測(cè)定要移植入有此需要的哺乳動(dòng)物中的器官中缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的存在的方法可以提供血液樣品，并如上文所描述的，在移植手術(shù)前對(duì)樣品分析預(yù)后標(biāo)志物。在一個(gè)實(shí)施方案中，分析樣品以測(cè)定存在和LDH總量及樣品中的至少一種別的預(yù)后標(biāo)志物，其選自基本上由K、Mg、Ca、AST、ALT、CK和乳酸鹽組成的組。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，移植的器官包括肝。在又一方面，可以使用本發(fā)明的實(shí)施方案來(lái)評(píng)估醫(yī)學(xué)或手術(shù)治療之前和之后的哺乳動(dòng)物肢的狀態(tài)。例如，損傷、骨折和血管阻塞可以影響對(duì)周圍的肢和肌肉的循環(huán)(例如間隔綜合征(compartment syndrome))。也呈現(xiàn)于US2008/0213744中，存在著缺血性肌肉中的氧與乳酸鹽和LDH水平間的顯著關(guān)聯(lián)，并且與對(duì)照值相比，乳酸鹽在周圍動(dòng)脈閉塞疾病患者中的股動(dòng)脈血液中是升高。依照本發(fā)明的實(shí)施方案的裝置使得有可能使用酶和乳酸鹽水平來(lái)診斷特定肢的缺血，并且還評(píng)估大多數(shù)治療的效果。另外，本發(fā)明的實(shí)施方案包括用于測(cè)定缺氧-缺血的方法，其通過分析來(lái)自感興趣的肢的樣品，并測(cè)定血漿中的LDH總量。還可以在手術(shù)期間使用所述裝置來(lái)評(píng)估對(duì)肢的截肢術(shù)期間存活組織的邊界?？梢栽跍y(cè)定LDH同時(shí)量化其它預(yù)后標(biāo)志物。這容許在醫(yī)學(xué)或手術(shù)處理之前和之后評(píng)估對(duì)哺乳動(dòng)物肢的血液循環(huán)。本發(fā)明的實(shí)施方案包括用于在床邊測(cè)定缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的裝置和方法，其中至多在大約幾分鐘里可獲得結(jié)果。此類實(shí)施方案包括獲得用于分析的樣品，并測(cè)定Hb和LDH0在優(yōu)選的實(shí)施方案中，方法包括測(cè)定血漿中選自基本上由AST、ALT和乳酸鹽組成的組的至少一種別的預(yù)后標(biāo)志物的量。通過以下非限制性實(shí)施例1-6進(jìn)一步描述分別針對(duì)LDH和Hb的試劑組合物，其中1-4涉及檢測(cè)LDH，而5-6涉及檢測(cè)Hb。實(shí)施例I分別將四唑鹽硝基藍(lán)四唑(NBT)、2-對(duì)-碘苯基-3-對(duì)-硝基苯-5-苯基氯化四唑(INT)和3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鹽(MTS)在二甲基亞砜中溶解,生成IOmM儲(chǔ)備溶液。分別將介質(zhì)吩嗪硫酸甲酯(phenazinemethosulphate, PMS)和I-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯(mPMS)在水中溶解,生成ImM儲(chǔ)備溶液。將NAD的儲(chǔ)備溶液在緩沖液中制備。將乳酸鈉在水中溶解，并用IM tris將pH調(diào)節(jié)至約9。使用對(duì)照血清(分別為2. 2和4. 7 ii katal/1)和來(lái)自同事(co-worker)的血液樣品。用分離器(Vacuette,Greiner)和鉀-EDTA 管(Vacuette, Greiner)將血液樣品在Li-肝素管中收集。將管以1500xg離心15分鐘,并將血樣轉(zhuǎn)移至Eppendorf管中。在視覺檢查外，使用塑料Iml比色皿使用Shimadzu UV-VIS 1610分光光度計(jì)使用常規(guī)的分光光度計(jì)來(lái)實(shí)施酶測(cè)定法。依照表I制備反應(yīng)混合物，并通過添加50 u I NAD來(lái)啟動(dòng)反應(yīng)。表I :反應(yīng)混合物、緩沖液Tris/HC]SOO^lI
四唑儲(chǔ)液(I OmM)SOtxl
介質(zhì)儲(chǔ)液(I mM)50^1
乳酸鹽儲(chǔ)液(0.8M)50^1
樣品(血漿或?qū)φ昭?200nl
NAD50li!結(jié)果在反應(yīng)后，NBT出現(xiàn)暗藍(lán)色，INT出現(xiàn)紫色，而MTS出現(xiàn)微紅的褐色，在反應(yīng)某個(gè)時(shí)間后產(chǎn)生顏色轉(zhuǎn)變。 實(shí)施例2在視覺檢查外,使用96孔板使用來(lái)自Emax Molecular Devices的ELISA讀板儀來(lái)實(shí)施測(cè)定法。使用96孔板的底部作為測(cè)量的光學(xué)表面，并且每個(gè)孔可以含有多至400 Ul液體。吸光度會(huì)隨孔中的溶液深度而有所變化。此實(shí)驗(yàn)中使用的板來(lái)自NUNC(高結(jié)合能力)。分別將四唑鹽硝基藍(lán)四唑(NBT)、2-對(duì)-碘苯基-3-對(duì)-硝基苯_5_苯基氯化四唑(INT)和3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鹽(MTS)在二甲基亞砜中溶解，生成IOmM儲(chǔ)備溶液。分別將介質(zhì)吩嗪硫酸甲酯(PMS)和I-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯(mPMS)在水中溶解，生成ImM儲(chǔ)備溶液。將NAD的儲(chǔ)備溶液在緩沖液中制備。將乳酸鈉在水中溶解，并用IM tris將pH調(diào)節(jié)至約9。使用對(duì)照血清(分別為2. 2和4. 7 ii katal/1)和來(lái)自同事的血液樣品。用分離器(Vacuette,Greiner)和鉀-EDTA 管(Vacuette, Greiner)將血液樣品在Li-肝素管中收集。將管以1500xg離心15分鐘,并將血樣轉(zhuǎn)移至Eppendorf管中。分別在總體積100和50 ill中完成酶活性的測(cè)量。表2 :100 ^ I反應(yīng)體積的反應(yīng)混合物:
緩沖液 Tris/HC!5pl
四0坐儲(chǔ)液(10 m M)5 pi
介質(zhì)(ImM)5|il
乳酸鹽儲(chǔ)液(0.8 M)Spl
樣品75|nl
NAD+5 pi在使用血液樣品時(shí)也以稀釋物(as diluted)測(cè)試樣品,對(duì)應(yīng)于小于20 y I血漿。表2 :50 y I反應(yīng)體積的反應(yīng)混合物:樣品37. 5 ii I反應(yīng)混合物12.5 U I在使用血液樣品時(shí)也以稀釋物(as diluted)測(cè)試樣品,對(duì)應(yīng)于小于IOii I血漿。反應(yīng)混合物在添加至樣品前混合等體積的四唑鹽儲(chǔ)備溶液、介質(zhì)儲(chǔ)備溶液、乳酸鹽和NAD+儲(chǔ)備溶液。
結(jié)果對(duì)所有四唑鹽染料成功觀察到顏色轉(zhuǎn)變。NBT完全適合于視覺檢測(cè)LDH活性。PMS和mPMS兩者都可以充當(dāng)介質(zhì)，然而，mPMS是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼘?duì)光化分解不太靈敏。足夠令人驚訝地，實(shí)施例顯示了甚至低于10 y L的小體積足以給出視覺檢測(cè)可接受的顏色轉(zhuǎn)變。實(shí)施例3以下實(shí)施例3涉及用于評(píng)估血漿樣品中的LDH存在的濕試劑組合物。將四唑鹽硝基藍(lán)四唑(NBT)在二甲基亞砜中溶解，生成IOmM儲(chǔ)備溶液。分別將介質(zhì)I-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯(mPMS)在水中溶解，生成ImM儲(chǔ)備溶液。將NAD+的儲(chǔ)備溶液在緩沖液中制備。將乳酸鈉在水中溶解。將N-甲基-D-葡糖胺在水中溶解(IM)，并用HCl將pH調(diào)節(jié)至10。 使用對(duì)照血清(分別為2. 2和4. 7 ii katal/1)和來(lái)自同事的血液樣品。用分離器(Vacuette,Greiner)和鉀-EDTA 管(Vacuette, Greiner)將血液樣品在Li-肝素管中收集。將管以1500xg離心15分鐘,并將血樣轉(zhuǎn)移至Eppendorf管中。反應(yīng)混合物在添加至樣品前混合等體積的四唑鹽儲(chǔ)備溶液，介質(zhì)儲(chǔ)備溶液、乳酸鹽和NAD+儲(chǔ)液。在80 ii I反應(yīng)混合物和20 U I樣品的100 U I總體積中完成酶活性測(cè)量。結(jié)果成功觀察到顏色轉(zhuǎn)變。在視覺上及用分光光度法檢測(cè)顏色變化。實(shí)施例4以下實(shí)施例4涉及用于評(píng)估血漿樣品中的LDH存在的干試劑組合物。制備依照表4的裝備溶液。表4 反應(yīng)混合物NBT(IOmM)mPMS (2. 5mM)NAD (50mM)L-乳酸鹽(5M)NMG (2M)使用儲(chǔ)備溶液，將NMG (0. 61ml)、NAD (0. 467ml)、L-乳酸鹽(0. 440ml)、NBT (I. 21ml)和mPMS(0. 997ml)混合，并到塑料片上干燥。干燥后，將5 ii L摻入LDH的血漿應(yīng)用于干點(diǎn)上，并容許反應(yīng)進(jìn)行2分鐘。用2M HCl停止反應(yīng)。結(jié)果清楚地觀察到高的和低的LDH水平間的顏色描繪。實(shí)施例5 以下實(shí)施例5涉及用于評(píng)估血漿中的Hb的濕試劑組合物。如下制備試劑溶液。分別將生色化合物N，N，N’，N’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和3，3’-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)在二甲基亞砜中或者直接在緩沖液溶液(磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液)中溶解。分別將底物過氧化氫和叔-丁基過氧化氫(T-hydro)在相應(yīng)的生色化合物溶液中溶解。將PH在范圍4-7中調(diào)節(jié)?；旌象w積90 U I試劑溶液和10 U I血漿(樣品)來(lái)反應(yīng)。結(jié)果對(duì)每種相應(yīng)的試劑溶液成功顯現(xiàn)顏色。TMB將顏色從透明的黃色(不存在Hb)轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色(存在ffi)。DAB將顏色從透明(不存在Hb)轉(zhuǎn)變?yōu)楹稚?存在Hb)。在視覺上及用分光光度法檢測(cè)顏色變化。實(shí)施例6以下實(shí)施例6涉及用于評(píng)估血漿中的Hb的干試劑組合物。將由TMB、過氧化氫和緩沖液(pH 5. 5)組成的試劑混合物到塑料片上干燥，并通過10 含有摻入水平的Hb的血漿樣品再水合。再水合后，TMB的濃度是0. 2mg/ml，過氧化氫的濃度是0. 04%，而緩沖液的濃度是50mM。結(jié)果來(lái)自運(yùn)行的顏色顯現(xiàn)顯示了具有不同濃度Hb的樣品的良好描繪，在較高濃度的Hb具有升高的顏色強(qiáng)度。技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，可以在不背離上述說(shuō)明書的前提下在不使用發(fā)明性技術(shù)的情況中實(shí)施許多修飾，例如使用玻璃或一些其它合適的材料替換塑料等。此外，依靠可見光譜內(nèi)的分光光度方法來(lái)分析測(cè)試結(jié)果(顏色轉(zhuǎn)變)在本發(fā)明的范圍內(nèi)。具有前述說(shuō)明書和附圖中呈現(xiàn)的教導(dǎo)的益處，本文中所列的本發(fā)明的許多修飾和 其它實(shí)施方案會(huì)提示本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員。因此，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不應(yīng)限于所公開的具體實(shí)施方案，而且修飾和其它實(shí)施方案意圖包括在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。雖然本文中采用具體的術(shù)語(yǔ)，但是它們僅以通用且描述性的意義，而不出于限制目的使用。
權(quán)利要求
1.用于評(píng)估哺乳動(dòng)物，包括人中的缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的測(cè)試系統(tǒng)，其包含具有用分離裝置(3)排布的樣品入口(4)和收集室(32)的一次性裝置(2)，其特征在于收集室(32)與至少兩個(gè)，即第一(5A)和第二(5B)可見檢測(cè)區(qū)室連接，其中的至少一個(gè)排布有用于直接檢測(cè)的化學(xué)手段，所述第一檢測(cè)區(qū)室(5A)排布為測(cè)定來(lái)自所述哺乳動(dòng)物的體液(9)樣品中的血紅蛋白(Hb)量是否超過預(yù)定的水平，并且所述第二檢測(cè)區(qū)室(5B)排布為依靠所述化學(xué)手段評(píng)估所述樣品中的乳酸脫氫酶(LDH)的總量水平。
2.依照權(quán)利要求I的測(cè)試系統(tǒng)，其中所述至少兩個(gè)檢測(cè)區(qū)室(5A，5B)分別排布有用于直接檢測(cè)所述Hb和LDH量的化學(xué)手段。
3.依照權(quán)利要求2的測(cè)試系統(tǒng)，其中所述至少兩個(gè)可見檢測(cè)區(qū)室(5A，5B)排布有依靠比色法直接視覺檢測(cè)的化學(xué)手段。
4.依照權(quán)利要求I或2的測(cè)試系統(tǒng)，其中所述至少兩個(gè)可見檢測(cè)區(qū)室(5A，5B)排布有通過分光光度手段直接檢測(cè)的化學(xué)手段。
5.依照權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的測(cè)試系統(tǒng)，其中所述分離裝置(3)包含具有3_2至500mm2,優(yōu)選地小于150mm2面積的分離濾膜(31)。
6.依照權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的測(cè)試系統(tǒng)，其中所述樣品是全血樣品(9)，且所述分離裝置(3)包含用于分開血漿(9’ )與所述全血樣品(9)內(nèi)的血細(xì)胞的濾膜(31)。
7.依照權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的測(cè)試系統(tǒng)，其中所述樣品是血漿、血清、尿液、腦脊液(CSF)、腹膜內(nèi)流體或唾液之任一。
8.依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的測(cè)試系統(tǒng)，其中所述體液(9)樣品的體積是Iμ L-100 μ L,更優(yōu)選地 10 μ L-75 μ L。
9.依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的測(cè)試系統(tǒng)，其中經(jīng)由所述樣品入口(4)應(yīng)用所述體液(9)樣品至可能通過視覺檢測(cè)評(píng)估缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的時(shí)間是小于5分鐘，優(yōu)選地小于2分鐘，甚至更優(yōu)選地小于I分鐘。
10.依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的測(cè)試系統(tǒng)，其中通過與顏色強(qiáng)度升高的標(biāo)準(zhǔn)參照量表比較來(lái)評(píng)估所述體液(9)樣品中的預(yù)后標(biāo)志物的總量，而顏色缺乏或不太強(qiáng)烈的顏色對(duì)應(yīng)于低密度的標(biāo)志物，而較強(qiáng)烈的顏色對(duì)應(yīng)于高濃度的標(biāo)志物。
11.依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的測(cè)試系統(tǒng)，其中所述一次性裝置(2)包含卡片上排布的超過兩個(gè)可見檢測(cè)區(qū)室(5A-C)，優(yōu)選地，所述區(qū)室之每一個(gè)排布有試劑組合物形式的化學(xué)手段。
12.依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的測(cè)試系統(tǒng)，其中所述至少兩個(gè)可見檢測(cè)區(qū)室(5A-C)之每個(gè)排布有直接視覺檢測(cè)由下列預(yù)后標(biāo)志物組成的組的一個(gè)成員的試劑組合物Hb、LDH、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、乳酸鹽、肌酸激酶(CK)、K、Mg和Cb ο
13.依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的測(cè)試系統(tǒng)，其中所述一次性裝置(2)具有連接的接受室(6)和樣品入口(4)，所述接受室(6)形成樣品收集器(7)的區(qū)室和界面。
14.依照權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的測(cè)試系統(tǒng)，其中所述樣品入口(4)包含用于自哺乳動(dòng)物收集體液樣品的整合毛細(xì)管樣品收集器(7)。
15.依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的測(cè)試系統(tǒng)，其中所述化學(xué)手段是干化學(xué)手段或濕化學(xué)手段形式的試劑組合物。
16.依照權(quán)利要求15的測(cè)試系統(tǒng)，其中所述試劑組合物排布為測(cè)定LDH，包括四唑化合物，優(yōu)選地選自下組硝基藍(lán)四唑(NBT)、I-(對(duì)-碘苯基(jodofenyl)) -5-(對(duì)-硝基苯(nitrofenyl))_3_ 苯基甲月替(fenylformazan) (INT)和 3-(4，5_ 二甲基噻唑-2-基)-5- (3-羧基甲氧基苯基)-2- (4-磺苯基)-2H-四唑鹽(MTS)。
17.依照權(quán)利要求15或16的測(cè)試系統(tǒng)，其中所述試劑組合物包含吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulphate, PMS)或I-甲氧基_5_甲基吩嗪硫酸甲酯(mPMS)形式的介質(zhì)。
18.依照權(quán)利要求15-17中任一項(xiàng)的測(cè)試系統(tǒng)，其中所述試劑組合物進(jìn)一步包含乳酸鹽和MD+。
19.依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的測(cè)試系統(tǒng)，其中檢測(cè)區(qū)室(5A-C)內(nèi)部的pH是8-11，優(yōu)選地8. 5-10,更優(yōu)選地8. 8-9. 8。
20.依照權(quán)利要求15-18中任一項(xiàng)的測(cè)試系統(tǒng)，其中所述試劑組合物排布為測(cè)定包含N-甲基-D-葡萄糖胺的緩沖液中的LDH。
21.依照權(quán)利要求15或20中任一項(xiàng)的測(cè)試系統(tǒng)，其中檢測(cè)區(qū)室(5A-C)內(nèi)部的pH是9-11，優(yōu)選地 9. 5-10. 5，更優(yōu)選地 9. 8-10. 2。
22.依照權(quán)利要求15的測(cè)試系統(tǒng)，其中所述試劑組合物排布為測(cè)定Hb，包括聯(lián)苯胺化合物，優(yōu)選地選自下組四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和3，3’ - 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)。
23.依照權(quán)利要求22的測(cè)試系統(tǒng)，其中所述試劑組合物包含過氧化物底物，優(yōu)選地選自下組過氧化氫、和叔-丁基過氧化氫(T-hydro)。
24.依照權(quán)利要求22或23中任一項(xiàng)的測(cè)試系統(tǒng)，其中用于測(cè)定Hb的所述檢測(cè)區(qū)室(5A)內(nèi)部的pH是3-7，優(yōu)選地4. 5-5. 5。
25.依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的測(cè)試系統(tǒng)，其中所述一次性裝置(2)包含具有反應(yīng)停止物的區(qū)室(8)，所述反應(yīng)停止物用于在預(yù)定的時(shí)間跨度后中斷預(yù)后標(biāo)志物與所述試劑組合物間的反應(yīng)。
26.依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的測(cè)試系統(tǒng)，其包含用于在所述收集室(32)內(nèi)部產(chǎn)生負(fù)壓的手段(14)，用于促使來(lái)自體液樣品的血漿通過所述分離裝置(3)并進(jìn)入所述至少兩個(gè)檢測(cè)區(qū)室(5A-B)。
27.依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的測(cè)試系統(tǒng)，其中所述一次性裝置(2)是便攜的，并且具有3-15cm，優(yōu)選地5-10cm的長(zhǎng)度(1),0. 5_5cm，優(yōu)選地2_4cm的寬度(W)和0. l_3cm，優(yōu)選地0. 3-0. 7cm的厚度(d)。
28.依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的測(cè)試系統(tǒng)，其中所述一次性裝置(2)具有5-50g的重量。
29.評(píng)估哺乳動(dòng)物中的缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的方法，包括下列步驟 a.提供包含諸如血細(xì)胞等顆粒的來(lái)自哺乳動(dòng)物的體液(9)樣品， b.依靠分離裝置(3)分開所述顆粒與所述體液(9)樣品， c.使所述分開的體液(9’)與用于直接檢測(cè)的化學(xué)手段接觸， d.測(cè)定所述體液(9’)中的Hb量是否高于或低于預(yù)定的閾值，及Hb的量是否低于所述閾值 e.評(píng)估所述體液(9’)中的乳酸脫氫酶(LDH)的總量水平，并 f.通過評(píng)估所述體液(9’)中的LDH水平來(lái)評(píng)估缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的風(fēng)險(xiǎn)和/或存在。
30.依照權(quán)利要求29的方法，其中在步驟(d)-(e)中，通過依靠比色法的直接視覺檢測(cè)來(lái)實(shí)施分別測(cè)定和評(píng)估標(biāo)志物Hb和LDH水平。
31.依照權(quán)利要求29的方法，其中在步驟(d)-(e)中，通過分光光度檢測(cè)來(lái)實(shí)施分別測(cè)定和評(píng)估標(biāo)志物Hb和LDH水平。
32.依照權(quán)利要求29-31中任一項(xiàng)的方法，其中所述分離裝置(3)包含用于分開顆粒與體液(9’)的濾膜(31)，所述分離濾膜(31)包含3mm2至500mm2，優(yōu)選地小于150mm2的面積。
33.依照權(quán)利要求29-32中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品是全血樣品(9)，且所述分離裝置(3)包含用于分開血漿(9’ )與所述全血樣品(9)內(nèi)的血細(xì)胞的濾膜(31)。
34.依照權(quán)利要求29-32中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品是如下任一形式的體液(9)全血、血漿、血清、尿液、腦脊液(CSF)、腹膜內(nèi)流體或唾液。
35.依照權(quán)利要求29-34中任一項(xiàng)的方法，其中體液(9)樣品的體積是Iμ L-100 μ L,更優(yōu)選地10μ L-75y L。
36.依照權(quán)利要求29-35中任一項(xiàng)的方法，其中經(jīng)由所述樣品入口(4)應(yīng)用所述體液(9)樣品至可能通過視覺檢測(cè)評(píng)估缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的時(shí)間是小于5分鐘，優(yōu)選地小于2分鐘，甚至更優(yōu)選地小于I分鐘。
37.依照權(quán)利要求29-36中任一項(xiàng)的方法，其中所述化學(xué)手段是干化學(xué)手段或濕化學(xué)手段形式的試劑組合物。
38.依照權(quán)利要求37的方法，其中所述試劑組合物排布為測(cè)定LDH，并且包括四唑化合物，優(yōu)選地選自下組硝基藍(lán)四唑(NBT)、I -(對(duì)-碘苯基)-5-(對(duì)-硝基苯)-3-苯基甲月替(INT)和3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鹽(MTS)。
39.依照權(quán)利要求37或38的方法，其中所述試劑組合物包含吩嗪硫酸甲酯(PMS)或I-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯(mPMS)形式的介質(zhì)。
40.依照權(quán)利要求37-39中任一項(xiàng)的方法，其中所述試劑組合物進(jìn)一步包含乳酸鹽和NAD+O
41.依照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述試劑組合物中的pH是8-11，優(yōu)選地8.5-10，更優(yōu)選地 8. 8-9. 8。
42.依照權(quán)利要求37-40中任一項(xiàng)的方法，其中所述試劑組合物排布為測(cè)定包含N-甲基-D-葡萄糖胺的緩沖液中的LDH。
43.要求權(quán)利要求37或42中任一項(xiàng)的方法，其中所述試劑組合物中的pH是9_11，優(yōu)選地9. 5-10. 5，更優(yōu)選地9. 8-10. 2。
44.依照權(quán)利要求37的方法，其中所述試劑組合物排布為測(cè)定Hb，并且包括聯(lián)苯胺化合物，優(yōu)選地選自下組四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和3，3’ - 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)。
45.依照權(quán)利要求44的方法，其中所述試劑組合物包含過氧化物底物，優(yōu)選地選自下組過氧化氫、和叔-丁基過氧化氫(T-hydro)。
46.依照權(quán)利要求44或45的方法，其中所述試劑組合物中的pH是3_7，優(yōu)選地4.5-5. 5。
47.依照權(quán)利要求29-46中任一項(xiàng)的方法，其中通過與顏色強(qiáng)度升高的標(biāo)準(zhǔn)參照量表比較來(lái)分別評(píng)估體液(9)樣品中的預(yù)后標(biāo)志物諸如Hb和LDH的總量，其中顏色缺乏或不太強(qiáng)烈的顏色對(duì)應(yīng)于低密度的標(biāo)志物，而較強(qiáng)烈的顏色對(duì)應(yīng)于高濃度的標(biāo)志物。
48.依照權(quán)利要求29-47中任一項(xiàng)的方法，其中自新生兒收集體液(9)樣品以評(píng)估缺氧，并容許預(yù)測(cè)出生前窒息后的低氧性缺血性腦病。
49.依照權(quán)利要求29-48中任一項(xiàng)的方法，其中在醫(yī)學(xué)方法前收集所述血液樣品。
50.依照權(quán)利要求49的方法，其中所述醫(yī)學(xué)方法牽涉移植。
51.依照權(quán)利要求49的方法，其中所述醫(yī)學(xué)方法是胃腸道手術(shù)。
52.一次性裝置用于依照權(quán)利要求29-51中任一項(xiàng)的方法評(píng)估哺乳動(dòng)物中的缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的用途，所述裝置(2)至少包含具有用分離裝置(3)排布的樣品入口(4)和收集室(32)，其中收集室(32)與至少兩個(gè)，即第一(5A)和第二(5B)可見檢測(cè)區(qū)室連接，每個(gè) 所述可見檢測(cè)室排布有用于直接檢測(cè)的化學(xué)手段，所述第一檢測(cè)區(qū)室(5A)排布為測(cè)定來(lái)自所述哺乳動(dòng)物的體液(9)樣品中的血紅蛋白(Hb)量是否超過預(yù)定的水平，并且所述第二檢測(cè)區(qū)室(5B)排布為評(píng)估所述樣品中的乳酸脫氫酶(LDH)的總量水平。
53.依照權(quán)利要求52的用途，其中所述一次性裝置(2)包含卡片上排布的超過兩個(gè)可見檢測(cè)區(qū)室(5A-C)，優(yōu)選地，所述區(qū)室之每一個(gè)排布有試劑組合物形式的化學(xué)手段。
54.依照權(quán)利要求53的用途，其中所述至少兩個(gè)可見檢測(cè)區(qū)室(5A-C)之每個(gè)排布有用于直接視覺檢測(cè)由下列預(yù)后標(biāo)志物組成的組的一個(gè)成員的試劑組合物Hb、LDH、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、乳酸鹽、肌酸激酶(CK)、K、Mg和Ca。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于評(píng)估哺乳動(dòng)物(包括人)中的缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的測(cè)試系統(tǒng)，其包含具有由分離裝置分開的樣品入口和收集室的一次性裝置，其中所述收集室與至少兩個(gè)，即第一和第二可見檢測(cè)區(qū)室連接，其中的至少一個(gè)排布有用于直接視覺檢測(cè)的化學(xué)手段，所述第一檢測(cè)區(qū)室排布為測(cè)定自所述哺乳動(dòng)物采集的體液樣品中的血紅蛋白(Hb)水平是否超出預(yù)定的閾值，并且所述第二檢測(cè)區(qū)室排布為評(píng)估所述樣品中的乳酸脫氫酶(LDH)的總量水平。
文檔編號(hào)C12Q1/32GK102639708SQ201080054087
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2010年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月30日
發(fā)明者M.卡爾森, S.西奧特阿芙奧納斯 申請(qǐng)人:卡爾馬克瑞典股份公司