包含缺氧誘導(dǎo)因子-1α的組合物及其使用方法
【專利說明】包含缺氧誘導(dǎo)因子-1a的組合物及其使用方法
[0001] 相關(guān)申請的交叉參考
[0002] 本申請要求2013年3月15日提交的美國臨時(shí)申請No.61/800,703的優(yōu)先權(quán)，其 全部內(nèi)容在此通過引用并入。
[0003] 政府利益的聲明
[0004] 本發(fā)明是在由美國國家衛(wèi)生研究院授予的合同號K12HL083772-01下借助政府資 助進(jìn)行的。政府具有本發(fā)明的某些權(quán)利。
技術(shù)領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明涉及包含缺氧誘導(dǎo)因子-1a(HIF-1a)的組合物和治療缺氧或局部缺血 的方法。
【背景技術(shù)】
[0006] 在哺乳動(dòng)物中，胚胎發(fā)育和成人動(dòng)態(tài)平衡的維持依賴于向哺乳動(dòng)物的組織和細(xì)胞 提供氧氣（〇 2)和其他營養(yǎng)物質(zhì)的功能性血管系統(tǒng)的建立。氧氣至這些組織的和細(xì)胞的局 部遞送是由循環(huán)系統(tǒng)通過預(yù)存血管的緊張度的瞬間變化、新血管的建立（血管生成）和現(xiàn) 有血管的重塑（以接受增加的血流）（動(dòng)脈生成）來調(diào)節(jié)的。生理和病理狀況下的組織灌 流由缺氧誘導(dǎo)因子-l(HIF-l)調(diào)節(jié)。
[0007]HIF-1是由氧調(diào)節(jié)a亞基（HIF-1a)和組成型表達(dá)的0亞基（HIF-1 0 )組成的 異二聚體轉(zhuǎn)錄因子。HIF-1通過指導(dǎo)通過對血管緊張度的作用、血管生成和/或動(dòng)脈生成參 與血管內(nèi)平衡的基因的轉(zhuǎn)錄來介導(dǎo)后生生物的有核細(xì)胞的對缺氧和局部缺血的適應(yīng)性響 應(yīng)。在病理狀況諸如嚴(yán)重肢體缺血（CLI)下，HIF-1可被抑制，從而導(dǎo)致減少的組織灌流、 靜止時(shí)缺血性疼痛的表現(xiàn)、潰瘍和/或壞疽，并最終導(dǎo)致截肢。
[0008] 因此，存在對用于治療與局部缺血和/或缺氧相關(guān)的治療的組合物和方法（包括 增加患病組織的組織灌流和恢復(fù)對局部缺血和缺氧的正常生理響應(yīng)）的鑒定和開發(fā)的需 要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明涉及一種包含缺氧誘導(dǎo)因子_la(HIF-a)的治療劑。本發(fā)明還涉及治療 有此需要的受試者的缺氧或局部缺血的方法。所述方法可以包括向所述受試者施用所述治 療劑。
【附圖說明】
[0010] 圖1顯示舉例說明缺氧誘導(dǎo)因子-1a(HIF-1a)蛋白的特征的示意圖。
[0011] 圖2顯示舉例說明實(shí)驗(yàn)性研究設(shè)計(jì)的概要的示意圖。EP，電穿孔；HIF-la，缺氧誘 導(dǎo)因子1a;頂，肌內(nèi)注射；LDPI，激光多普勒灌注成像儀；pVAX，空骨架質(zhì)粒DNA。
[0012] 圖3顯示（A)利用激光多普勒灌注成像儀記錄的代表性圖像；(B)將股動(dòng)脈結(jié)扎 后天數(shù)相對肢體灌注率（結(jié)扎的/未結(jié)扎的）繪圖的曲線圖；(C)將股動(dòng)脈結(jié)扎后天數(shù)相 對肢體運(yùn)動(dòng)評分繪圖的曲線圖；和（D)將處理組相對小于3的肢體壞死評分的百分比繪圖 的曲線圖。
[0013] 圖4顯示⑷利用編碼HIF-1a的DNA與電穿孔（EP)的組合處理的小鼠、⑶利 用編碼HIF-1a的DNA的肌內(nèi)（頂）注射處理的小鼠、（C)pVAXlDNA(空載體對照）和EP的 組合處理的小鼠和（D)假處理的肢體的后肢術(shù)后恢復(fù)的總體描繪。在圖4A-圖4D的每一 個(gè)圖中，箭頭指示患病肢體。
[0014] 圖5顯示（A)用蘇木精和伊紅（H&E)染色的收肌組織切片的代表性顯微照片（原 始放大倍數(shù)，x200) ;(B)將處理組相對組織壞死（面積百分比）繪圖的曲線圖；（C)針對 ⑶31+毛細(xì)血管染色的收肌組織的代表性顯微照片（原始放大倍數(shù)，x200);和（d)將處理 組相對毛細(xì)血管密度（⑶31+細(xì)胞/HPF)繪圖的曲線圖。
[0015] 圖6顯示（A)將處理組相對總動(dòng)脈數(shù)（SMA+血管/HPF)繪圖以及（B)將處理組相 對血管面積（ym2)繪圖的曲線圖。
[0016] 圖7顯示（A)編碼小鼠HIF-1a的核酸序列，其中下劃線標(biāo)示起始密碼子和編碼 IgE前導(dǎo)序列的核苷酸，雙下劃線和粗體標(biāo)示編碼代替脯氨酸的丙氨酸的密碼子；和（B)小 鼠HIF-la的氨基酸序列，其中下劃線標(biāo)示起始甲硫氨酸和連接于HIF-la氨基酸序列的 IgE前導(dǎo)序列，雙下劃線和粗體標(biāo)示已替代了HIF-1a的氨基酸序列中的野生型脯氨酸殘 基的丙氨酸殘基。
[0017] 圖8顯示（A)編碼小鼠HIF-1a的核酸序列，其中5'末端上的下劃線標(biāo)示用于克 隆目的的BamHI限制性位點(diǎn)（S卩，GGATCC)和Kozak序列（S卩，GCCACC)，3'末端上的下 劃線標(biāo)示終止密碼子（即，TGATAA)和用于克隆目的的Xhol限制性位點(diǎn)（即，CTCGAG)， 雙下劃線和粗體標(biāo)示編碼替代脯氨酸的丙氨酸的密碼子；和（B)小鼠HIF-1a的氨基酸序 列，其中雙下劃線和粗體標(biāo)示已替代了HIF-1a的氨基酸序列中的野生型脯氨酸殘基的丙 氨酸殘基。
[0018] 圖9顯示（A)編碼人HIF-1a的核酸序列，其中雙下劃線和粗體標(biāo)示編碼替代脯 氨酸的丙氨酸的密碼子；和（B)人HIF-1a的氨基酸序列，其中雙下劃線和粗體標(biāo)示已替代 了HIF-la的氨基酸序列中的野生型脯氨酸殘基的丙氨酸殘基。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 本發(fā)明涉及用于治療缺氧或局部缺血的治療劑。所述治療劑可以包含缺氧誘導(dǎo)因 子-la(HIF-la)。所述治療劑可以促進(jìn)或誘發(fā)血管形成。相較于未被施予所述治療劑的 受試者，所述治療劑可增加被施予所述治療劑的受試者的毛細(xì)血管密度、側(cè)支血管形成、血 管尺寸或其組合。相較于未被施予所述治療劑的受試者，所述治療劑可增加被施予所述治 療劑的受試者的組織灌流。相較于未被施予所述治療劑的受試者，所述治療劑可減少被施 予所述治療劑的受試者的組織壞死。
[0020] 因此，所述治療劑可用于治療缺氧或局部缺血的方法。缺氧或局部缺血可與嚴(yán)重 肢體缺血相關(guān)。
[0021] 1?定義
[0022] 除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員 理解的含義相同的含義。在沖突的情況下，以本文件（包括定義）為準(zhǔn)。下文中描述了優(yōu) 選的方法和材料，盡管可在本發(fā)明的實(shí)施或測試中使用與本文中描述的那些方法和材料類 似或等同的方法和材料。本文中提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻(xiàn)通過引 用整體并入。本文中公開的材料、方法以及實(shí)施例僅僅是說明性的并非意在限制。
[0023] 如本文中所用，術(shù)語"包含/包括"、"包括"、"具有"、"有"、"可以"、"含有"及其變 型意欲為不排除另外的行為或結(jié)構(gòu)的可能性的開放式過渡短語、術(shù)語或詞語。除非上下文 另有明確說明，否則單數(shù)形式"一個(gè)（a) "、"和（and)"以及"該（the)"包括復(fù)數(shù)參考物。本 公開還涵蓋"包含/包括"本文中提出的實(shí)施方案或組件、"由所述實(shí)施方案或組件組成"和 "基本上由所述實(shí)施方案或組件組成"的其它實(shí)施方案，無論是否明確地顯示。
[0024] 如本文中所用，"編碼序列"或"編碼核酸"意指包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核 酸（RNA或DNA分子）。編碼序列還可包括有效地連接于能夠在施用了核酸的個(gè)體或哺乳動(dòng) 物的細(xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)的調(diào)控元件（包括啟動(dòng)子和多聚腺苷酸化信號）的起始和終止信號。
[0025] 如本文中所用，"互補(bǔ)"或"互補(bǔ)的"意指核酸分子的核苷酸或核苷酸類似物之間的 沃森-克里克（Watson-Crick)(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen堿基配對。
[0026] 如本文中可互換使用的"電穿孔"、"電-透化"或"電動(dòng)增強(qiáng)"（"EP"）意指使用 跨膜電場脈沖來誘發(fā)生物膜中的微觀通路（孔）；它們的存在允許生物分子諸如質(zhì)粒、寡核 苷酸、siRNA、藥物、離子和水從細(xì)胞膜的一側(cè)通過進(jìn)入另一側(cè)。
[0027] 如本文中所用，"片段"意指編碼能夠改變或影響哺乳動(dòng)物中的血管內(nèi)平衡的變化 (例如，但不限于通過對血管緊張度的作用、血管生成和/或動(dòng)脈生成）的多肽的核酸序列 或其部分。所述片段可以是選自編碼下文中所示的蛋白質(zhì)片段的各種核苷酸序列的至少一 個(gè)的DNA片段。所述片段可以是選自編碼下文中所示的蛋白質(zhì)片段的各種核苷酸序列的 至少一個(gè)的DNA片段。片段可包含下文中所示的核酸序列的一個(gè)或多個(gè)的至少10%、至少 20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少 95%。在一些實(shí)施方案中，片段可包含下文中所示的核酸序列的至少一個(gè)的至少20個(gè)核苷 酸或更多、至少30個(gè)核苷酸或更多、至少40個(gè)核苷酸或更多、至少50個(gè)核苷酸或更多、至 少60個(gè)核苷酸或更多、至少70個(gè)核苷酸或更多、至少80個(gè)核苷酸或更多、至少90個(gè)核苷 酸或更多、至少100個(gè)核苷酸或更多、至少150個(gè)核苷酸或更多、至少200個(gè)核苷酸或更多、 至少250個(gè)核苷酸或更多、至少300個(gè)核苷酸或更多、至少350個(gè)核苷酸或更多、至少400 個(gè)核苷酸或更多、至少450個(gè)核苷酸或更多、至少500個(gè)核苷酸或更多、至少550個(gè)核苷酸 或更多、至少600個(gè)核苷酸或更多、至少650個(gè)核苷酸或更多、至少700個(gè)核苷酸或更多、至 少750個(gè)核苷酸或更多、至少800個(gè)核苷酸或更多、至少850個(gè)核苷酸或更多、至少900個(gè) 核苷酸或更多、至少950個(gè)核苷酸或更多或至少1000個(gè)核苷酸或更多核苷酸。
[0028] 關(guān)于多肽序列的"片段"意指能夠改變或影響哺乳動(dòng)物中的血管內(nèi)平衡的變化 (例如，但不限于通過對血管緊張度、血管生成和/或動(dòng)脈生成的作用）的多肽。所述片段可 以是選自下文中所示的各種氨基酸序列的至少一個(gè)的多肽片段。片段可包含下文中所示的 蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、 至少70 %、至少80 %、至少90 %或至少95 %。在一些實(shí)施方案中，片段可包含下文中所示的 蛋白質(zhì)的至少一個(gè)的至少20個(gè)氨基酸或更多、至少30個(gè)氨基酸或更多、至少40個(gè)氨基酸 或更多、至少50個(gè)氨基酸或更多、至少60個(gè)氨基酸或更多、至少70個(gè)氨基酸或更多、至少 80個(gè)氨基酸或更多、至少90個(gè)氨基酸或更多、至少100個(gè)氨基酸或更多、至少110個(gè)氨基酸 或更多、至少120個(gè)氨基酸或更多、至少130個(gè)氨基酸或更多、至少140個(gè)氨基酸或更多、至 少150個(gè)氨基酸或更多、至少160個(gè)氨基酸或更多、至少170個(gè)氨基酸或更多、至少180個(gè) 氨基酸或更多、至少190個(gè)氨基酸或更多、至少200個(gè)氨基酸或更多、至少210個(gè)氨基酸或 更多、至少220個(gè)氨基酸或更多、至少230個(gè)氨基酸或更多或至少240個(gè)氨基酸或更多氨基 酸。
[0029] 如本文中所用，"遺傳構(gòu)建體"或"構(gòu)建體"是指包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的 DNA或RNA分子。所述編碼序列包括有效地連接于能夠在施用了核酸分子的個(gè)體的細(xì)胞中 指導(dǎo)表達(dá)的調(diào)控元件（包括啟動(dòng)子和多聚腺苷酸化信號）的起始和終止信號。如本文中所 用，術(shù)語"可表達(dá)的形式"是指基因構(gòu)建體或構(gòu)建體，所述基因構(gòu)建體或構(gòu)建體含有有效地 連接于編碼蛋白質(zhì)的編碼序列的必需調(diào)控元件，以便當(dāng)存在于個(gè)體的細(xì)胞中時(shí)，所述編碼 序列將被表達(dá)。
[0030] 如本文中所用，"缺氧"意指環(huán)境氧氣（02)濃度的降低。
[0031] 如在本文中在兩個(gè)或更多個(gè)核酸或多肽序列的上下文中所用，"相同的"或"同一 性"意指序列具有指定百分比的在指定區(qū)域上相同的殘基?？赏ㄟ^如下步驟計(jì)算百分比：將 兩條序列最佳地比對，在指定的區(qū)域上比較兩條序列，測定在兩條序列中存在相同殘基的 位置的數(shù)目以得到匹配位置的數(shù)目，將匹配位置的數(shù)目除以指定區(qū)域中的位置總數(shù)，及將 結(jié)果乘以100來得到序列同一性的百分比。在兩條序列具有不同長度或比對產(chǎn)生一個(gè)或多 個(gè)交錯(cuò)末端以及指定的比較區(qū)域僅包括單條序列的情況下，將單條序列的殘基包括在計(jì)算 的分母而非分子中。當(dāng)比較DNA和RNA時(shí)，可將胸腺嘧啶（T)和尿嘧啶（U)認(rèn)為是等同的。 人工或通過使用計(jì)算機(jī)序列算法諸如BLAST或BLAST2. 0來獲得同一性。
[0032] 如本文中所用，"局部缺血"意指其中組織灌流被縮減，使得氧氣（02)的可用度不 足以滿足組織代謝需要的狀況。
[0033] 如本文中所用，核酸"或"寡核苷酸"或"多核苷酸"意指共價(jià)連接在一起的至少兩 個(gè)核苷酸。單鏈的描述也限定了互補(bǔ)鏈的序列。因此，核酸還包括描述的單鏈的互補(bǔ)鏈。核 酸的許多變體可出于相同的目的作為給定的核酸使用。因此，核酸還包括基本上相同的核 酸和其補(bǔ)體。單鏈提供可在嚴(yán)格雜交條件下與靶序列雜交的探針。因此，核酸還包括在嚴(yán) 格雜交條件下雜交的探針。
[0034] 核酸可以是單鏈或雙鏈的，或可含有雙鏈和單鏈序列的部分。核酸可以是DNA(基 因組和cDNA)、RNA或雜交體，其中核酸可含有脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的組合，及堿 基（包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、肌苷、黃嘌呤次黃嘌呤、異胞嘧啶和異 鳥嘌呤）的組合。核酸可以通過化學(xué)合成法或通過重組法獲得。
[0035] 如本文中所用，"有效連接的"意指基因的表達(dá)在與其空間上連接的啟動(dòng)子的控制 下。啟動(dòng)子可位于在其控制下的基因的5'（上游）或3'（下游）。啟動(dòng)子與基因之間的距 離可與在所述啟動(dòng)子來源自的基因中該啟動(dòng)子與其控制的基因之間的距離大致相同。如在 本領(lǐng)域中是已知的，在不喪失啟動(dòng)子功能的情況下，可接受該距離的變化。
[0036] 如本文中所用，"肽"、"蛋白質(zhì)"或"多肽"可意指氨基酸的連接的序列，并且可以是 天然的、合成的或者經(jīng)修飾的或者天然和合成的組合。
[0037] 如本文中所用，"啟動(dòng)子"意指能夠賦予、激活或增強(qiáng)核酸在細(xì)胞中的表達(dá)的合成 或天然來源的分子。啟動(dòng)子可包含一個(gè)或多個(gè)特定的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列以進(jìn)一步增強(qiáng)所述序列 的表達(dá)和/或改變其的空間表達(dá)和/或時(shí)間表達(dá)。啟動(dòng)子還可包含與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相距多 達(dá)數(shù)千堿基對的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子或阻遏子元件。啟動(dòng)子可源自包括病毒、細(xì)菌、真菌、植物、昆蟲 和動(dòng)物的來源。啟動(dòng)子可針對表達(dá)發(fā)生的細(xì)胞、組織或器官或針對表達(dá)發(fā)生所處的發(fā)育階 段，或響應(yīng)外部刺激（諸如生理應(yīng)激、病原體、金屬離子或誘導(dǎo)劑